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1、第四章 核酸,主要內(nèi)容,核苷酸 脫氧核糖核酸和核糖核酸 核酸的理化性質(zhì)及分離純化,一、核酸的分類與組成,核酸分為兩大類: 脫氧核糖核酸（DNA） 主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。 核糖核酸（RNA） 主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。,（一）核酸的分類,（二）核酸的組成,核酸（DNA和RNA）是一種線性多聚核苷酸，它的基本結(jié)構(gòu)單元是核苷酸。 核苷酸本身由核苷和磷酸組成, 核苷則由戊糖和堿基形成 DNA與RNA結(jié)構(gòu)相似，但在組成成份上略有不同。,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,堿基,核酸,1核苷酸,基本組成單位,嘌呤,嘧啶,（1）組成核苷酸的堿基,1核苷酸,腺嘌呤 A,鳥嘌呤 G,尿嘧啶 U,胞嘧啶 C,胸腺嘧啶 T,（2）戊

2、糖,組成核酸的戊糖有兩種。 DNA所含的糖為-D-2-脫氧核糖。 RNA所含的糖則為-D-核糖。,（3）核苷 nucleoside,堿基+戊糖=核苷 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵。,（4）核苷酸nucleotide,核苷酸是核苷的磷酸酯。 5-磷酸-脫氧核糖核苷-DNA 5-磷酸-核糖核苷-RNA,核苷+磷酸=核苷酸 核苷酸 脫氧核苷酸 腺嘌呤核苷酸 脫氧腺嘌呤核苷酸 AMP dAMP 鳥嘌呤核苷酸 脫氧鳥嘌呤核苷酸 GMP dGMP 胞嘧啶核苷酸 脫氧胞嘧啶核苷酸 CMP dCMP 尿嘧啶核苷酸 脫氧胸腺嘧啶核苷酸 UMP dTMP,(5)修飾成分,核酸中也存在一些不常見的稀有堿

3、基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。,核苷酸的理化性質(zhì)P89,堿基與紫外吸收：260 nm 疏水堆積作用 堿基互補(bǔ)配對(duì),ATP是生物體內(nèi)分布最廣和最重要的一種核苷酸衍生物。,ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸),2核苷酸的衍生物,腺苷酸及其多磷酸化合物,AMP Adenosine monophosphate,ADP Adenosine diphosphate,ATP Adenosine triphosphate,ATP的性質(zhì),ATP 分子的最顯著特點(diǎn)是含有兩個(gè)高能磷酸鍵。 ATP水解時(shí), 可以釋放出大量自由能。 ATP 水解釋放出來(lái)的能量用于推動(dòng)生物體內(nèi)各種需能的生化反應(yīng)。 AT

4、P 是生物體內(nèi)最重要的能量轉(zhuǎn)換中間體。,多聚核苷酸,多聚核苷酸是通過核苷酸的5-磷酸基與另一分子核苷酸的C3-OH形成磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。 由脫氧核糖核苷酸聚合而成的稱為DNA鏈； 由核糖核苷酸聚合而成的則稱為RNA鏈。,脫氧核糖核酸(DNA)的結(jié)構(gòu) 核酸 核糖核酸(RNA)的結(jié)構(gòu),第二節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu),一級(jí)結(jié)構(gòu): 由4種脫氧核苷酸通過3-5磷酸二酯鍵連接起來(lái)的直線形或環(huán)形多聚體。 二級(jí)結(jié)構(gòu): 核苷酸鏈內(nèi)或鏈之間通過氫鍵折疊卷曲而成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。絕大多數(shù)為右旋。 三級(jí)結(jié)構(gòu): 是指DNA分子在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過進(jìn)一步的扭曲和折疊所形成的特定構(gòu)象。,一、脫氧核糖核酸(DNA)的結(jié)構(gòu),D

5、NA的一級(jí)結(jié)構(gòu)-堿基序列 由4種脫氧核苷酸通過3-5磷酸二酯鍵連接起來(lái)的直線形或環(huán)形多聚體。 一級(jí)結(jié)構(gòu)的走向的一般為53。 不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列順序，因此攜帶有不同的遺傳信息。,二、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu),5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羥基端（常用3-OH表示） 多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個(gè)多聚核苷酸鏈時(shí)，必須注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,5PdAPdCPdGPdTOH 3 或5ACGTGCGT 3 ACGTGCGT,線條式,字母式,DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu),RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu),DNA與RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)照,二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),1953年，J. Watson和

6、F. Crick 在前人研究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNA結(jié)晶的X-衍射圖譜和分子模型，提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測(cè)。,DNA分子由兩條DNA單鏈組成。 雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的最基本形式。 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是分子中兩條DNA單鏈之間基團(tuán)相互識(shí)別和作用的結(jié)果。,1DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),DNA雙螺旋模型,B型結(jié)構(gòu) 兩條鏈反向平行，右手螺旋， 有大溝和小溝。 Z型結(jié)構(gòu) 磷酸基在多核苷酸骨架上的分布呈Z字形。 左手螺旋，只有小溝。,2.0 nm,小溝,大溝,三B-DNA的結(jié)構(gòu),左手螺旋Z-DNA(a)和右手螺旋B-DNA(b)的測(cè)試圖,DNA雙螺旋結(jié)

7、構(gòu)的要點(diǎn),(1) DNA分子由兩條多聚脫氧核糖核苷酸鏈(簡(jiǎn)稱DNA單鏈)組成。兩條鏈沿著同一根軸平行盤繞，形成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋中的兩條鏈方向相反，即其中一條鏈的方向?yàn)?3，而另一條鏈的方向?yàn)?5。,（2）嘌呤堿和嘧啶堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè)，糖基位于螺旋的外側(cè)，堿基環(huán)平面與螺旋軸垂直。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn),（3）螺旋橫截面的直徑約為2 nm，每條鏈相鄰兩個(gè)堿基平面之間的距離為0.34 nm，每10個(gè)核苷酸形成一個(gè)螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）高度為3.4 nm。,（4）兩條DNA鏈相互結(jié)合以及形成雙螺旋的力是鏈間的堿基對(duì)所形成的氫鍵。 堿基的相互結(jié)合具有嚴(yán)格的配對(duì)規(guī)律，即腺嘌呤（A）與胸腺嘧

8、啶（T）結(jié)合，鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）結(jié)合，這種配對(duì)關(guān)系，稱為堿基互補(bǔ)。 A和T之間形成兩個(gè)氫鍵，G與C之間形成三個(gè)氫鍵。 在DNA分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。,DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多樣性,回文序列,發(fā)夾式結(jié)構(gòu),十字形結(jié)構(gòu),中心區(qū)域,DNA回文序列及幾種結(jié)構(gòu)形式,DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義,該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價(jià)值的是確認(rèn)了堿基配對(duì)原則，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。,三、DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu),在細(xì)胞內(nèi)，由于DNA分子與其它分子（主要是蛋白質(zhì)）的相互作用，使DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲或再螺旋形成的高級(jí)結(jié)構(gòu). 實(shí)例：超螺

9、旋 染色體（ chromosome） 病毒（virus）,超螺旋,一個(gè)環(huán)形雙螺旋DNA分子，通過細(xì)胞內(nèi)旋轉(zhuǎn)酶的作用，或在體外EB染料的作用下，可在環(huán)形分子內(nèi)部引進(jìn)張力。這種新產(chǎn)生的張力在DNA分子內(nèi)部促使原子的位置重排，造成雙螺旋的再螺旋，形狀似麻花，稱為超螺旋。 如果引起的張力的方向與原先的右手螺旋方向相同，則超螺旋的方向是左手螺旋，稱為正超螺旋。正超螺旋是旋緊雙螺旋后形成的。正超螺旋為雙螺旋旋轉(zhuǎn)過度，通過分子整體的左旋來(lái)解去過度的螺旋。 反之，如果引起的張力的方向與原先的右手螺旋方向相反，則超螺旋的方向是右手螺旋，稱為負(fù)超螺旋。負(fù)超螺旋是放松雙螺旋后形成的。,DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的形成,核小體

10、盤繞及染色質(zhì)示意圖,真核生物染色體DNA組裝 不同層次的結(jié)構(gòu),DNA （2 nm）,核小體鏈（ 11 nm，每個(gè)核小體200 bp）,纖絲（ 30 nm，每圈6個(gè)核小體）,突環(huán)（ 150 nm，每個(gè)突環(huán)大約75000 bp）,玫瑰花結(jié)（ 300 nm ，6個(gè)突環(huán)）,螺旋圈（ 700 nm，每圈30個(gè)玫瑰花）,染色體（ 1400 nm， 每個(gè)染色體含10個(gè)玫瑰花200 bp）,動(dòng)物病毒切面模式圖,被膜（脂蛋白、碳水化合物）,衣殼（蛋白質(zhì)）,核酸,突起（糖蛋白）,病毒粒,（DNA或RNA）,二、 RNA的分子結(jié)構(gòu),一、 RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)和類別 二、 tRNA 的分子結(jié)構(gòu) 三、 rRNA的分子結(jié)構(gòu) 四

11、、 mRNA的分子結(jié)構(gòu),一、 RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)和類別,RNA與DNA的差異 DNA RNA 糖 脫氧核糖 核糖 堿基 AGCT AGCU 不含稀有堿基 含稀有堿基,1、RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu),1、分子較小，一級(jí)結(jié)構(gòu)為直線型多核苷酸鏈，因此，在RNA分子中，并不遵守堿基種類的數(shù)量比例關(guān)系，即分子中的嘌呤堿基總數(shù)不一定等于嘧啶堿基的總數(shù)。 2、基本單位主要是CMP、GMP、AMP和UMP四種核苷酸 3、磷酸二酯鍵，5端向3端延伸,局部為雙螺旋結(jié)構(gòu)，是RNA分子通過自身回折使互補(bǔ)的堿基對(duì)相遇，形成氫鍵結(jié)合而成，同時(shí)形成雙螺旋。這種結(jié)構(gòu)可以形象地稱為“發(fā)夾型”結(jié)構(gòu)。 不能配對(duì)的區(qū)域形成突環(huán)（loop），被排

12、斥在雙螺旋之外。 RNA中的雙螺旋結(jié)構(gòu)為A-DNA類型的結(jié)構(gòu)。 一般來(lái)說，雙螺旋結(jié)構(gòu)占RNA分子的50%。,發(fā)卡式結(jié)構(gòu) A-U, C-G配對(duì),2、RNA的類別,信使RNA（messenger RNA，mRNA）：在蛋白質(zhì)合成中起模板作用； 核糖體RNA（ribosoal RNA，rRNA）：與蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成核糖體（ribosome），核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所； 轉(zhuǎn)移RNA（transfor RNA，tRNA）：在蛋白質(zhì)合成時(shí)起著攜帶活化氨基酸的作用。 小RNA（small nuclear RNA, snRNA），存在真核細(xì)胞中,分子量25000左右，大約由7090個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左

13、右。 分子中含有較多的修飾成分，稀有堿基。 3-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)，用于接受活化的氨基酸，也稱接受末端。 tRNA占全部RNA的16%，tRNA的生物功能是在蛋白質(zhì)生物合成過程中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸和識(shí)別密碼子。 細(xì)胞內(nèi)tRNA的種類很多，估計(jì)有50多種。每一種氨基酸都有與其相對(duì)應(yīng)的一種或幾種tRNA。,二、tRNA 的結(jié)構(gòu),生物大分子在單位離心力場(chǎng)作用下的沉降速度稱為沉降系數(shù)。量綱為秒。一個(gè)svedberg單位，簡(jiǎn)寫為S， 是110-13秒，8S即為810-13秒。相對(duì)分子量越大，S越大。 當(dāng)一種新發(fā)現(xiàn)的大分子的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能等都處在研究階段中時(shí)，其名稱未定，為了描述方便，常用其沉降系數(shù)

14、S來(lái)表示。 蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)在1200 S之間。,沉降系數(shù),二級(jí)結(jié)構(gòu)特征： 三葉草形 四臂四環(huán),三級(jí)結(jié)構(gòu) 特征： 在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上 進(jìn)一步折疊扭曲形成倒 L型,tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)都呈” 三葉草” 形狀。 一般可將其分為五部分：包括氨基酸臂、反密碼環(huán)、二氫尿嘧啶環(huán)、TC環(huán)和可變環(huán)（額外環(huán)）。,攜帶氨基酸,辨認(rèn)并結(jié)合氨基酰tRNA合成酶,識(shí)別mRNA上的密碼,識(shí)別并結(jié)合核蛋白體,氨基酸臂,二氫尿嘧啶環(huán),反密碼環(huán),可變環(huán),TC環(huán),(1) 氨基酸臂 包含有tRNA的3-末端和5-末端， 3 -末端的最后3個(gè)核苷酸殘基都是CCA。氨基酸可與其成酯，該區(qū)在蛋白質(zhì)合成中起攜帶氨基酸的作用

15、。 (2)反密碼環(huán) 與氨基酸接受區(qū)相對(duì)的一般含有7個(gè)核苷酸殘基的區(qū)域，其中正中的3個(gè)核苷酸殘基稱為反密碼。 反密碼子與結(jié)合在核糖體上的mRNA中的核苷酸（密碼子）根據(jù)堿基配對(duì)原則互補(bǔ)成對(duì)，因此在蛋白質(zhì)合成過程中，攜帶特定氨基酸的tRNA憑借自身的反密碼子識(shí)別mRNA上的密碼子，把所攜帶的氨基酸摻入到多肽鏈的一定位置上。 I次黃嘌呤核苷酸，也稱肌苷酸，常出現(xiàn)在反密碼子中。,（3）二氫尿嘧啶環(huán) 由812個(gè)核苷酸組成，因?yàn)楹袃蓚€(gè)而氫尿嘧啶而得名。通過由34對(duì)堿基組成的雙螺旋區(qū)（也稱二氫尿嘧啶臂）與tRNA分子的其它部分相連。 (4)可變環(huán)（額外環(huán)） 位于反密碼區(qū)與TC區(qū)之間，不同的tRNA具有大小

16、不同的額外環(huán)，所以是tRNA分類的重要指標(biāo)。,（5）TC環(huán) 該區(qū)與二氫尿嘧啶區(qū)相對(duì)， 假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷環(huán)(TC)由7個(gè)核苷酸組成，通過由5對(duì)堿基組成的雙螺旋區(qū)(TC臂)與tRNA的其余部分相連。除個(gè)別例外，幾乎所有tBNA在此環(huán)中都含有TC 。 T-胸腺嘧啶核糖核苷酸 -假尿嘧啶核苷酸,tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu),在三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未配對(duì)的堿基由于整個(gè)分子的扭曲而配成對(duì)，目前已知的tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)均為倒L型。,tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu),倒 L 型,三、rRNA的分子結(jié)構(gòu),特征： 單鏈，螺旋化程度較tRNA低 與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能,5sRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),rRNA,動(dòng)

17、物細(xì)胞核糖體rRNA有四類：5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA，28S rRNA。 大腸桿菌核糖體中的rRNA有三類：5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA。這些不同的rRNA的核苷酸排列順序是不同的，它們能與細(xì)菌染色體DNA的不同部位雜交。 rRNA約占全部RNA的80%左右。 rRNA的功能是構(gòu)成核糖體的骨架。,四、mRNA的分子結(jié)構(gòu),原核生物mRNA特征： 先導(dǎo)區(qū)+翻譯區(qū)（多順反子）+末端序列 真核生物mRNA特征： “帽子”+單順反子+“尾巴”,順反子，是遺傳學(xué)名詞，指mRNA分子中對(duì)應(yīng)于 DNA上一個(gè)完整基因的一段核苷酸序列。,多順反子，即一條mRNA鏈

18、含有指導(dǎo)合成幾種蛋白質(zhì)分子的信息，可作為模板翻譯出幾種蛋白質(zhì)。,單順反子，即一條mRNA鏈只能翻譯產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)。,原核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),真核細(xì)胞mRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),真核細(xì)胞mRNA的3-末端有一段長(zhǎng)達(dá)200個(gè)核苷酸左右的聚腺苷酸(poly A)，稱為 “尾結(jié)構(gòu)” 。 真核細(xì)胞mRNA的5-末端有一個(gè)甲基化的鳥苷酸，稱為 “帽結(jié)構(gòu) ” 。,3 -非編碼區(qū),5 -非編碼區(qū),編碼區(qū)（單順反子）,5 帽子,3 poly A尾,5帽子：m7G-5ppp-Nm-3p,G鳥苷 N任意核苷 m在字母左側(cè)代表堿基被甲基化，右上角的數(shù)字代表甲基化的位置 m在字母右側(cè)表示核糖被甲基化,原核生物的mRNA

19、一般無(wú)poly A，但某些病毒mRNA也有3-poly A。 poly A可能有多方面功能： 與mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移有關(guān)； 與mRNA的壽命有關(guān)，新合成的mRNA的poly A鏈較長(zhǎng)，而衰老的mRNA的poly A鏈縮短。,化學(xué)結(jié)構(gòu)決定物理化學(xué)性質(zhì) 水解核酸的糖苷鍵、磷酸二酯鍵 酸堿性質(zhì)磷酸基、堿基 紫外吸收堿基 核酸的變性、復(fù)性雙螺旋結(jié)構(gòu),第三節(jié) 核酸的性質(zhì),（一）一般性質(zhì)： 分子大小：DNA Mr 1061012或更大，RNA Mr 104105或更大 性狀： DNA為白色纖維狀固體（絮狀），而RNA為白色粉末。 溶解度：DNA和RNA均微溶于水，不溶于一般的有機(jī)溶劑，所以常用乙

20、醇做沉淀劑，使其從溶液中析出。,與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團(tuán)（磷酸基）也含有堿性基團(tuán)（氨基），因而核酸也具有兩性性質(zhì)。 由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿性（氨基）是一個(gè)弱堿，所以核酸的等電點(diǎn)較低。如DNA的等電點(diǎn)為44.5，RNA的等電點(diǎn)為22.5。 RNA的等電點(diǎn)比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通過氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子的解離，而DNA沒有這種作用。,（二）核酸的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn),堿基與戊糖形成的糖苷鍵、以及磷酸酯鍵均能被酸、堿和酶水解。 酸水解 糖苷鍵比磷酸鍵更容易被水解; 嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵更容易被水解; 水解嘧啶堿需要較高的溫度. 比如：

21、DNA在pH1.6于37 對(duì)水透析，可完全除去嘌呤堿；在pH 2.8于100 加熱1 h也可完全除去嘌呤。,（三）核酸的水解,堿水解,RNA的磷酸酯鍵易被堿水解成核苷酸，DNA的磷酸酯鍵則不易被堿水解。 這是因?yàn)镽NA核糖上2-OH在堿的作用下形成的磷酸三酯極不穩(wěn)定，容易水解。 DNA的脫氧核糖沒有2-OH，不能形成堿水解的中間產(chǎn)物，因而對(duì)堿有一定的抗性。 用于水解RNA的堿有KOH，NaOH等。,堿水解RNA：堿濃度一般為0.31 mol/L，在室溫至37 下水解1824 h，產(chǎn)物為2-和3-單核苷酸。 堿水解DNA：1 mol/L NaOH于100 加熱4 h，可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸

22、。,酶水解,磷酸二酯酶：非特異性水解磷酸二酯鍵 核酸酶：專一水解核酸的磷酸二酯鍵 分類 1）按底物專一性：核糖核酸酶（RNase），脫氧核糖核酸酶（DNase） 2）按作用方式：內(nèi)切酶，外切酶 核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3-端或5-端）開始，逐個(gè)水解切除核苷酸。 核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個(gè)位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵。 3）其它：限制性核酸內(nèi)切酶，雙鏈酶，單鏈酶 在分子生物學(xué)研究中最有應(yīng)用價(jià)值的是限制性核酸內(nèi)切酶。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。,(四)核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具

23、有獨(dú)特的紫外線吸收光譜（240290 nm），一般在260 nm左右有最大吸收峰。 不同堿基的紫外吸收特性不同；同一種堿基在不同pH、不同波長(zhǎng)下的紫外吸收也不同，據(jù)此，可以作為核酸及其組份定性和定量測(cè)定的依據(jù)。,紫外吸收是實(shí)驗(yàn)室最常用的定量測(cè)定DNA或RNA的方法。 鑒定DNA和RNA的純度： 待測(cè)樣品的純度可用它們的A260/A280來(lái)判斷。純DNA的A260/A280為 1.8，而純RNA的A260/A280為 2.0。 樣品中若含有蛋白質(zhì)-? 則：A260/A280值要下降，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的最大吸收在A280。,核酸溶液的紫外吸收還可以摩爾磷的吸光度來(lái)表示，摩爾磷相當(dāng)于摩爾核苷酸。 單鏈核酸

24、的摩爾磷吸收值高于雙鏈核酸的摩爾磷吸收值，這是因?yàn)殡p螺旋結(jié)構(gòu)使堿基對(duì)的電子云發(fā)生重疊，因而減少了對(duì)紫外光的吸收。 所以，核酸發(fā)生變性時(shí)，核酸的摩爾磷吸收值升高約25%，這種現(xiàn)象成為增色效應(yīng)；復(fù)性后，摩爾磷值又降低，這種現(xiàn)象叫做減色效應(yīng)。,（五）核酸的變性、復(fù)性與雜交,(1) 核酸的變性 核酸的變性是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。 變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。 能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變pH（11.3或5.0）；甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變性。,DNA變

25、性的特征,DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常把加熱變性使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱為融點(diǎn)，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85 C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。 G和C的含量高，Tm值高。因而測(cè)定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算： （G + C)%=(Tm - 69.3) 2.44,淬火：如當(dāng)溫度高于Tm約5 時(shí)，DNA的兩條鏈由于布朗運(yùn)動(dòng)而完全分開。如果此熱溶液迅速冷卻，則兩條鏈繼續(xù)保持分開，稱為淬火。 退火：若將此溶液緩慢冷卻，到適當(dāng)?shù)牡蜏?，則兩條鏈可發(fā)生特異性的重新組合而恢復(fù)到原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱

26、退火。 變性的因素：加熱、酸堿、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑、尿素、酰胺等試劑。,當(dāng)DNA的稀鹽溶液加熱到80-100 時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開，形成無(wú)規(guī)線團(tuán)。 DNA變性后，它的一系列性質(zhì)也隨之發(fā)生變化，如紫外吸收(260 nm)值升高, 粘度降低等。,粘度 天然DNA分子的長(zhǎng)度可達(dá)到幾個(gè)厘米，而分子的直徑只有2 nm，所以即使是極稀的DNA溶液，也有極大的粘度。RNA的粘度要小得多，當(dāng)核酸溶液因受熱或在其他因素作用下發(fā)生螺旋線團(tuán)轉(zhuǎn)變時(shí)，則粘度降低。,(2) 核酸的復(fù)性,變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)

27、將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。 DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)。 將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性。分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。此外，DNA的復(fù)性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。,(3) 核酸的雜交,熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與同源DNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。 DNA單鏈與互補(bǔ)的RNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。 核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。,核酸的雜交,一、DNA的復(fù)制與

28、生物遺傳信息的保持 DNA復(fù)制的要點(diǎn)是： 1）在復(fù)制開始階段，DNA的雙螺旋拆分成兩條單鏈。,2）以DNA單鏈為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則, 在DNA聚合酶催化下，合成與模板DNA完全互補(bǔ)的新鏈，并形成一個(gè)新的DNA分子。,3) 通過DNA復(fù)制形成的新DNA分子, 與原來(lái)的DNA分子完全相同。 經(jīng)過一個(gè) 復(fù)制周期后，子代DNA分子的兩條鏈中，一條來(lái)自親代DNA分子，另一條是新合成的，所以又稱為半保留復(fù)制。,核酸的研究方法,核酸的分離和提純 超速離心 瓊脂糖凝膠電泳,核酸的分離、提純,DNA的分離 RNA的分離 制備DNA需要注意的問題：防止核酸的降解和變性。 制備條件：溫和，低溫（04 ），

29、防止過酸、過堿、避免劇烈攪拌；防止核酸酶的作用（加入十二烷基硫酸鈉SDS、乙二胺四乙酸EDTA、檸檬酸鈉等抑制核酸酶活性）,DNA的分離,原理：真核生物中的染色體DNA與堿性蛋白（組蛋白）結(jié)合成核蛋白（DNP）存在細(xì)胞核中。DNP溶于水和濃鹽溶液（如1 mol/L NaCl），但是不溶于生理鹽水(0.14 mol/L NaCl)。 DNA分離方法： 1.破碎細(xì)胞后，用濃鹽溶液提取。 2.用水稀釋至0.14 mol/L 鹽溶液，使DNP沉淀出來(lái)。 3. 除去蛋白質(zhì) 用氯仿-戊醇溶液抽提：將DNP溶于高氯酸鈉溶液，再與等體積的氯仿-戊醇溶液混合，振蕩，離心，溶液分為三層，上層為核酸，中層為類脂，下

30、層為蛋白質(zhì)。 如此反復(fù)操作多次除凈蛋白。 4. 除去少量RNA：用核糖核酸酶溶液50 g/ml于37 保溫30 min。 5. 將含DNA的水相合并，用7090%的乙醇洗去鹽分。 保存：將提純的DNA溶于緩沖液，于4 保存。,RNA的分離,RNA比DNA更不穩(wěn)定，而且RNase又無(wú)處不在。 注意： 1）所有用于制備RNA的玻璃器皿都要經(jīng)過高溫焙烤，塑料用具經(jīng)過高壓滅菌，不能滅菌的用具要用0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）處理，再煮沸以除凈DEPC。DEPC能破壞 RNase。 2）在破碎細(xì)胞同時(shí)加入強(qiáng)變性劑（如胍鹽）使RNase失活。 3）在RNA反應(yīng)體系中加入RNase抑制劑。,tRNA：占1

31、5%，pH 5沉淀 mRNA：占5%，很不穩(wěn)定，提取條件嚴(yán)格 rRNA：占80%，一般提取的RNA主要是rRNA。 提取方法： 1）稀鹽溶液提取 細(xì)胞破碎，用0.14 mol/L NaCl反復(fù)抽提，得到核糖核蛋白提取液，再進(jìn)一步分離蛋白、多糖等，得RNA。 2）苯酚水溶液提取 細(xì)胞破碎，加入等體積90%苯酚水溶液，振蕩，DNA和蛋白質(zhì)沉淀在苯酚層，RNA和多糖溶于水層。,核酸的超速離心,超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速高達(dá)2.51048104 r/min，最大離心力達(dá)5105 g甚至更高。 常速：8000 r/min以內(nèi)，1104 g以下 高速： 11042.5104 r/min， 1104 1105 g,等

32、密度離心-氯化銫,目的：分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)。 在離心力作用下，不同浮力密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，一直移動(dòng)到與他們各自浮力密度恰好相等的位置，形成區(qū)帶。這種方法稱為等密度梯度離心，或稱為平衡等密度離心。 常用的離心介質(zhì)是銫鹽，如氯化銫、硫酸銫、溴化銫等。,離心操作時(shí)，將一定濃度的介質(zhì)溶液與樣品混合均勻，在選用的離心力的作用下，經(jīng)過足夠時(shí)間的離心分離，銫鹽在離心場(chǎng)中沉降，自動(dòng)形成密度梯度，樣品中不同浮力密度的顆粒在其各自的等密度點(diǎn)位置上形成區(qū)帶。,瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 Agarose Gel Electrophoresis,應(yīng) 用,1. 適用于大分

33、子的核酸、核蛋白等的分離、鑒定及純化 2. 臨床生化檢驗(yàn)中常用于LDH、CK等同工酶的分離與檢測(cè) 3. 為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病等提供生化指標(biāo),DNA序列分析,化學(xué)法測(cè)序 雙脫氧法測(cè)序,化學(xué)法測(cè)序,將待測(cè)DNA片段的一端用32P標(biāo)記，將標(biāo)記的DNA分成4份。 每份樣品用一種堿基特異性試劑處理，它能特異性地破壞DNA中某種特定的堿基，使鏈在該種堿基處斷裂，產(chǎn)生一系列標(biāo)記片段。 經(jīng)凝膠電泳后，再進(jìn)行放射自顯影，可測(cè)出DNA序列。放射自顯影條帶的位置由標(biāo)記末端到拆開的堿基之間的距離決定。,雙脫氧法測(cè)序,該法是利用了2, 3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）可特異性的終止DNA鏈延長(zhǎng)這一特點(diǎn)。 在DNA聚合酶不斷形成二酯鍵使DNA延伸的過程中，當(dāng)ddNTP摻入其中，則鏈的延長(zhǎng)終止。,