第三章 消毒與滅菌,1滅菌：應用物理或化學方法殺滅物體中所有的病原微生物、非病原微生物以及芽胞和霉菌孢子的方法。 2消毒：應用物理或化學方法殺滅物體中的病原微生物，而對非病原微生物及芽胞，孢子不要求全部殺死。 3防腐：應用物理或化學方法阻止和抑制微生物的生長繁殖的方法。 4無菌操作法：防止或杜絕一切細菌進入動物體或其他物體的方法。 5濾過除菌：液體或氣體通過濾過作用除去其中所存在的細菌。一般用0.22微米濾膜，但不能除去病毒，霉形體及L型細菌。,介紹幾個基本概念,第一節(jié) 物理因素,溫度 干燥 滲透壓 輻射 過濾 其他物理因素,一、溫度 （一）高溫對微生物的影響,高溫對微生物有明顯的致死作用，其主要原因是高溫能使菌體蛋白質變性或凝固，酶失去活性，核酸結構遭到破壞等，從而導致其死亡。 多數(shù)細菌，酵母菌和霉菌的營養(yǎng)細胞和病毒在50-65 10 min可以致死。 細菌芽孢，在121 下20min才能致死， 同種微生物老齡菌比幼菌耐熱。,干熱滅菌(dry heat sterilization ) 焚燒滅菌法：常用于廢棄物動物尸體等處理。 燒灼滅菌法：是直接火焰滅菌，如接種環(huán)滅菌。 烘烤滅菌法；實驗室用干燥箱烘。一般是1602小時即可達到滅菌目的。,濕熱滅菌(mosist heatsterilization) 在同溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好；因為： a比干熱更易使菌體蛋白凝固。 b濕熱穿透力強； c濕熱可以釋放大量潛熱。,濕熱滅菌法 高壓蒸汽滅菌法 煮沸消毒法 流通蒸汽消毒法 間歇蒸汽滅菌法 巴氏消毒法,高壓蒸汽滅菌法 是濕熱滅菌中最好的方法， 通常1.05kg/cm2,的壓力下面 （此時溫度121）處理15 30min。要排冷空氣，否則 會形成假壓力，雖然壓力達 到要求，溫度卻達不到相應 溫度，而影響滅菌效果。,B、煮沸消毒法 物品在水中煮沸 15min，可殺死所有營養(yǎng)細胞和一部分芽孢。 在水中加入的a2CO3 或的石碳酸效果更好。此法適合注射器和解剖用具的消毒。,C、間歇滅菌法(fractional sterilization） 是用常壓蒸汽反復幾次進行滅菌的方法。 主要用于不宜高壓滅菌的培養(yǎng)基，不耐熱的藥物和營養(yǎng)物等 方法是將待滅菌物品置于蒸鍋內加熱到沸騰維持15-30min殺死營養(yǎng)細胞，取出冷卻后在37恒溫培養(yǎng)24小時，使芽孢萌發(fā)，再用此法滅菌，反復三次，即可達到滅菌目的。,D、巴氏消毒法(pasteurization) 是食品（牛奶）釀造（啤酒）工業(yè)中常用的方法。 具體做法是6365處理30min或7172度處理15 s,速冷卻至10下。 這樣即可殺死病原微生物。又不致?lián)p壞營養(yǎng)，可保留食品飲料原有風味。 d) 為節(jié)省時間，又達到巴氏消毒的效果，現(xiàn)多用高溫瞬時滅菌132下1-2 s。,（二）低溫對微生物的影響,常溫冰箱保存細菌和病毒：（細菌40；病毒2070）。 低溫保存食品應迅速冷凍，否則擾亂細胞膠體狀態(tài)，使水分形成結晶，冰結晶還能機械地刺傷菌體胞膜，胞壁。 冷凍真空干燥法：采取迅速冷凍和抽真空除水原理；如凍干疫苗和凍干菌種。,二 、干燥,水分是微生物的正常生命活動必不可少的。干燥會導致細胞失水而造成代謝停止以致死亡。 微生物的種類，環(huán)境條件，干燥的程度等均影響對微生物殺滅的效果。休眠孢子抗干燥能力也很強，在干燥條件下可長期不死，這一特性已用于菌種保藏，如用砂土管來保藏有孢子的菌種。 在日常生活中也常用烘干、曬干和熏干等方法來保存食物。,三、滲透壓,細菌處于低滲液中，細胞會吸水膨脹乃至破裂，稱胞漿壓出。 細胞處于高滲液中會脫水，引起細胞質和細胞壁分離，稱質壁分離，導致死亡。 等滲溶液對微生物生長有利,四、輻射,輻射是能量通過空間傳遞的一種物理現(xiàn)象。 可見光線 肉眼可見的光線是在紅外線和紫外線之間，波長為400800nm。 日光 利用日光暴曬是常用的簡易消毒方法，許多細菌繁殖體在日光直射下2h很易死亡。,紫外線：,殺菌機理：,波長200300m的紫外線具有殺菌作用,干擾DNA的復制與轉錄,紫外線穿透力較弱,不耐熱物品的表面消毒,應用范圍：,特點：,殺菌機理：,應用范圍：,電離輻射：,包括高速電子、x射線和 射線。,產(chǎn)生游離基,破壞DNA。,一次性醫(yī)用塑料制品的消毒，,食品的消毒不破壞其營養(yǎng)成分。,五、濾過除菌法,濾菌器:用物理阻留的方法，將液體或空氣中的細菌除去,以達到除菌目的。含有微細小孔0.22微米,只允許液體或氣體通過，而大于孔徑的細菌等顆粒不能通過。 適用范圍：血清、毒素、抗生素以及空氣等的除菌。,濾菌器,六 、其他物理因素,超聲波 超聲波是由超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的，對細胞有破壞作用，能使大多數(shù)細胞裂解死亡。 微波 微波是一種波長短而頻率較高的電磁波。微波對微生物的殺菌作用，主要是由于微生物在微波電磁場作用下，吸收微波的能量而產(chǎn)生熱效應所致。,第二節(jié) 化學因素,各種消毒劑可按其作用水平分為3類： （1）高效消毒劑：可以殺滅一切微生物，包括細菌繁殖體、細菌芽孢、結核桿菌、真菌和病毒等。這類消毒劑又稱為滅菌劑。 如甲醛、戊二醛、過氧乙酸和環(huán)氧乙烷等。 （2）中效消毒劑 除細菌芽孢外，可殺滅各種微生物。如乙醇、酚、含氯消毒劑和碘消毒劑等。 （3）低效消毒劑 可殺滅細菌繁殖體、真菌和有囊膜病毒，但不能殺滅細菌芽孢、結核桿菌和無囊膜病毒。如新潔爾滅、洗必太等。,一、常用消毒劑的實用性能 見下表,二、影響消毒劑作用的因素,消毒劑的性質 消毒劑的濃度與作用時間 微生物的類型及數(shù)量 環(huán)境中有機物的存在,三、選擇適當?shù)南緞?殺菌譜廣、有效濃度低、作用快。 性質穩(wěn)定、易溶于水、不易受酸堿影響。 無腐蝕性、無毒；不易殘留。 價格低、便于運輸，可長期保存。,第三節(jié) 生物因素,共生：兩種或多種生物生活在一起時，彼此并不損害而相互有利，稱為共生。 寄生：一種生物從另一種生物獲得所需的營養(yǎng)，賴以為生，并對后者呈現(xiàn)傷害作用者，稱為寄生。 拮抗：當兩種微生物生活在一起時，一種微生物能抑制或殺死另一種微生物，此現(xiàn)象稱為拮抗。 協(xié)同：兩種或多種生物在同一環(huán)境中，互相協(xié)助，共同完成某種作用，而為其任何一種所不能單獨達到。,一、抗生素與細菌素,（一）抗生素 是某些微生物在代謝過程中產(chǎn)生的能抑制或殺滅其他微生物的一種化學物質。它主要來源于放線菌、某些真菌和細菌等。 抗生素的作用機理： a.干擾細菌細胞壁的合成 b.影響細胞膜的通透性 c.阻礙菌體蛋白質的合成 d.改變核酸代謝,（二）細菌素 大腸桿菌產(chǎn)生的細菌素稱大腸菌素；葡萄球菌產(chǎn)生的稱葡萄球菌素；霍亂弧菌產(chǎn)生的稱弧菌素等，每類細菌素又可分為不同的型別；細菌素僅對近緣細菌有作用。,1928年A.Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素,澳大利亞病理學家霍華德.弗羅里與弗萊明1940提純出青霉素。 共同獲得1945年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎.,三、 噬菌體,病毒種類很多，根據(jù)病毒寄生的對象來分，有植物病毒、動物病毒和微生物病毒。 噬菌體：是病毒中的一種，一般把侵染細菌、放線菌的病毒叫噬菌體。（把侵染真菌的病毒叫噬真菌體） 噬菌體在自然界廣泛存在，在1995年發(fā)表的ICTV的病毒分類與命名第六次報告中共報道了4000余種，分別劃歸為49個病毒科. 據(jù)Bradley(1967)歸納，噬菌體共有六類形態(tài)。,1、組成：主要由蛋白質和核酸組成。 2、基本形態(tài)：蝌蚪形、微球形和纖絲形。,（一）噬菌體的形態(tài)結構與組成,以大腸桿菌T4噬菌體為例 頭部：廿面體對稱結構，由蛋白質衣殼構成，內含一條DNA。 頸部：薄盤狀，附頸須。 尾鞘：長95nm, 衣殼粒螺旋對稱；可伸縮。 尾髓:中空，DNA可由此進入細胞。 基板: 六角形盤狀物，其上有刺突、尾絲。 刺突: 有吸附功能。 尾絲: 有識別吸附功能。,大腸桿菌T4噬菌體構造,3、蝌蚪形噬菌體的構造,（二）、噬菌體(phage)的繁殖,噬菌體并沒有個體的生長過程，而只有其基本成分的合成和裝配，即首先將各個部件合成出來，然后裝配，所以一般將噬菌體的繁殖稱做復制。 根據(jù)噬菌體與宿主的關系： 烈性噬菌體：指感染宿主細胞后，能夠使宿主細胞裂解的噬菌體. 溫和噬菌體（或溶源性噬菌體）：噬菌體感染細胞后，將其核酸整合（附著）到宿主的核DNA上，并且可以隨宿主DNA的復制而進行同步復制，在一般情況下，不引起寄主細胞裂解的噬菌體。,烈性噬菌體的繁殖過程一般分為五個階段： 即吸附、侵入、復制、裝配和釋放。,1、烈性噬菌體的繁殖,吸附：噬菌體和宿主細胞上的特異性吸附部位進行特異性結合，噬菌體以尾絲牢固吸附在受體上后，靠刺突“釘”在細胞表面上。 侵入：核酸注入細胞的過程。噬菌體尾部所含酶類物質可使細胞壁產(chǎn)生一些小孔，然后尾鞘收縮，尾髓刺入細胞壁，并將核酸注入細胞內，蛋白質外殼留在細胞外。 復制 ：包括核酸的復制和蛋白質合成。噬菌體核酸進入宿主細胞后，會控制宿主細胞的合成系統(tǒng)，然后以噬菌體核酸中的指令合成噬菌體所需的核酸和蛋白質。,裝配： 主要步驟有： DNA分子的縮合通過衣殼包裹DNA而形成頭部尾絲及尾部的其它部件獨立裝配完成頭部與尾部相結合最后裝上尾絲，至此，一個個成熟的形狀、大小相同的噬菌體裝配完成。,釋放： 方式： 裂解：多以裂解細胞的方式釋放。 分泌：噬菌體穿出細胞，細胞并不裂解。 通常情況下，一個噬菌體通過上述五個過程能合成100300個噬菌體。烈性噬菌體的這種生長繁殖方式也稱為一步生長，,一步生長曲線,實驗設計依據(jù)：1個菌體被1個噬菌體感染,避免二次吸附；細菌群體被噬菌體同步感染。 實驗過程: 敏感菌10ml Phage 1ml 混勻，5min,使之吸附 離心或用抗phage血清處理, 去除過量phage 高倍稀釋,吸附phage的菌懸液(避免多次吸附) 37培養(yǎng),定時取樣,取樣人為裂解處理（每5min） 樣品中加入氯仿裂解細胞,24-48h,裂解液加入敏感菌液中,適當稀釋混合液,涂布于瓊脂培養(yǎng)基上,計數(shù)噬菌斑,噬菌斑: 概念：將少量噬菌體與大量敏感菌混合培養(yǎng)在營養(yǎng)瓊脂中，在平板表面布滿宿主細胞的菌苔上,可以用肉眼看到一個個透明的不長菌的小圓斑，稱為噬菌斑。(每個噬菌斑一般是由一個噬菌體粒子形成的。) 應用: 噬菌斑可用于檢出、分離、純化噬菌體和進行噬菌體的計數(shù)。,噬菌斑,以培養(yǎng)時間為橫坐標,以噬菌斑數(shù)為縱坐標,繪制成的曲線為一步生長曲線。 可分以下階段： 潛伏期 裂解期 穩(wěn)定期,一步生長曲線,潛伏期：從噬菌體吸附細菌到細菌細胞釋放 新的噬菌體之前的這段時期.曲線平行于橫軸，噬菌體數(shù)無變化.樣品中無游離的噬菌體。(潛伏期前的噬菌斑數(shù)是噬菌體數(shù),也就是感染噬菌體的細菌數(shù)). 裂解期：曲線直線上升,子代噬菌體不斷釋放到培養(yǎng)基中,直到達到一個極限. 穩(wěn)定期:感染細胞后復制的子代噬菌體全部釋放，噬菌斑數(shù)穩(wěn)定，一次感染結束。,裂解量:每一受感染細胞所釋放的新的噬菌體的 平均數(shù)。 穩(wěn)定期噬菌斑數(shù) 裂解量 = 潛伏期噬菌斑數(shù) 不同的噬菌體或同種噬菌體感染敏感菌后所釋放的噬菌體數(shù)不同,與噬菌體種類、宿主細胞菌齡以及環(huán)境因數(shù)有關。,2、溫和噬菌體與溶源性細菌,溫和噬菌體：噬菌體感染細胞后，將其核酸整合（附著）到宿主的核DNA上，并且可以隨宿主DNA的復制而進行同步復制，在一般情況下，不引起寄主細胞裂解的噬菌體。 原噬菌體（或前噬菌體）： 即整合在宿主核DNA上的噬菌體的核酸。 溶原性細菌：指在核染色體上整合有原噬菌體的細菌?？蛇M行正常生長繁殖,而不被裂解。,溶原性細菌的特點： 可穩(wěn)定遺傳：子代細菌都含有原噬菌體，均具有溶原性。 可自發(fā)裂解：溫和噬菌體的核酸也可從宿主DNA上脫落下來，恢復原來的狀態(tài)，進行大量的復制，變成烈性噬菌體，自發(fā)裂解幾率10-210-5 。 可誘導裂解：用化學、物理方法誘導 具有“免疫性”：溶原菌對其本身產(chǎn)生的噬菌體或外來的同源的噬菌體不敏感，對同源噬菌體具免疫性，對非同源噬菌體沒有免疫性。 可復愈：自然遺失前噬菌體，但不發(fā)生自發(fā)裂解和誘導裂解 溶源轉變：由于溶原菌整合了溫和噬菌體的核酸而使自己產(chǎn)生一些新的生理特征。,（三）、噬菌體的危害和應用,噬菌體的危害： 主要是引起發(fā)酵中的噬菌體污染 例：丙酮、丁醇發(fā)酵中的噬菌體污染 抗生素發(fā)酵中的噬菌體污染 食品工業(yè)上的噬菌體污染 防治： 控制活菌排放 選育抗性生產(chǎn)菌株 生產(chǎn)中輪換使用菌種 藥物防治例如用金霉素、四環(huán)素等。,噬菌體的應用： 1.作為分子生物學研究的工具 2.用于鑒定未知菌，可到型。 3.用于臨床治療傳染病 4.檢驗植物病原菌 5.測定輻射劑量,