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1、1,2,第二章 分子發(fā)光分析,分子,吸收能量,激發(fā)為激發(fā)態(tài),釋放出能量,基態(tài),電能,化學能,光能,稱為“發(fā)光”,光的形式釋放,熒光,磷光,分子發(fā)光,光致發(fā)光,化學發(fā)光,輻射躍遷,非輻射躍遷,以熱的形式釋放,分子熒光分析法 一、基本原理 （一）熒光和磷光的產生 從分子結構理論來討論,3,分子中電子 的能量狀態(tài),電子所處的能級,振動能級,轉動能級,電子的多重態(tài),J=2S+1,S：為各電子自旋量子 數的代數和,S=0, J=1 單重態(tài)S表示,（所有電子都是自旋配對的）,S=1, J=3,三重態(tài) T表示,大多數基態(tài)分子都處于單重態(tài),電子在躍遷過程中伴隨著 自旋方向的變化（自旋平行）,4,基態(tài)單重態(tài)S,

2、激發(fā)態(tài)單重態(tài)S,激發(fā)態(tài)三重態(tài)T,激發(fā)單重態(tài)S與激發(fā)三重態(tài)T的不同點：, S是抗磁分子，T是順磁分子, tS = 10-8s, tT = 10-41s；(發(fā)光速度很慢), 基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)為允許躍遷， 基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的激發(fā)為禁阻躍遷；, 激發(fā)三重態(tài)的能量較激發(fā)單重態(tài)的能量低,5,其中S0、S1和S2分別表示分子的基態(tài)、第一和第二電子激發(fā)的單重態(tài),T1和T2則分別表示分子的第一和第二電子激發(fā)的三重態(tài)。,V=0、1、2、3、表示基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動能級。,2分子內的光物理過程,6,振動弛豫:,在同一電子能級中，電子由高振動能級轉至低振動能級，而將多余的能量以熱 的形式發(fā)出。發(fā)生振動

3、弛豫的時間為10-12s數量級。,非輻射能量傳遞過程；,7,內轉移: 當兩個電子能級非?？拷灾疗湔駝幽芗売兄?疊時， 常發(fā)生電子由高能級以無輻射躍遷方式轉移至低能級。（S1 轉移 S2）,8,系間竄躍: 指不同多重態(tài)間的無輻射躍遷， 例如S1T1就是一種系間竄躍。 通常，發(fā)生系間竄躍時，電子由S1的較低振動能級轉移至T1的較高振動能級處。,9,輻射能量傳遞過程,熒光發(fā)射:,電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài),得到最大波長為3的熒光,由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小,3 2 1,10,磷光發(fā)射: 電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，因為這是禁阻躍遷。 但是，由第一激發(fā)

4、單重態(tài)的最低振動能級，有可能以系間竄躍方式轉至第一激發(fā)三重態(tài)，再經過振動馳豫，轉至其最低振動能級，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時，便發(fā)射磷光， 這個躍遷過程（T1S0）也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為10-4-10s。因此，這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時間。,外轉移 指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質分子 的相互作用及能量轉移，使熒光或磷光強 度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為“熄滅”或“猝滅”。 熒光與磷光的根本區(qū)別：,11,磷光是由激發(fā)三重態(tài)最低振動能層至基態(tài),熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動能層至基態(tài),區(qū)別,(二 )熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 激發(fā)光譜:(ex) 以不同波長的入射光激發(fā)熒光物

5、質,在熒 光最強的波長處測量熒光強度 即以激發(fā)光波長為橫坐標,以熒光強度為 縱坐標繪制曲線即可得到激發(fā)光譜曲線。 發(fā)射光譜：(em) 固定激發(fā)光波長（最大） 然后測定不同的波長時所發(fā)射的熒光強度 即可繪制熒光發(fā)射光譜曲線,12,在熒光的產生過程中，由于存在各種形 式的無輻射躍遷，損失能量，所以它們的 最大發(fā)射波長都向長波方向移動，以磷光 波長的移動最多，而且它的強度也相對較 弱。,13,14,15,激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關系,a. Stokes位移,激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。,b. 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關,電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，

6、吸收不同波長的能量(如能級圖 2 , 1)，產生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產生波長一定的熒光,c. 鏡像規(guī)則,通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。,（三）熒光的影響因素 分子產生熒光必須具備兩個條件： 分子必須具有與所照射的輻射頻率(紫外-可見光）相適應的結構（共軛雙鍵），才能吸收激發(fā)光； 吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產率。,16,1.熒光效率 它表示物質發(fā)射熒光的能力，通常用下 式表示,17,熒光效率越高；,物質發(fā)射熒光越強,kf為熒光發(fā)射過程的速率常數（與化學結構有關）,ki為其它有關過程

7、的速率常數的總和（化學環(huán)境）,凡使kf 值升高而使ki值降低的因素，都可增強熒光。,2. 熒光與有機化合物結構的關系 （1）躍遷類型 實驗證明，對于大多數熒光物質，首先經歷激發(fā)，然后經過振動弛豫或其他無輻射躍遷，再發(fā)生 躍遷而得到熒光。 （2）共軛效應 實驗證明，容易實現(xiàn)激發(fā) 的芳香族化合物 容易發(fā)生熒光，增加體系的共軛度熒光效率一般 也將增大，主要是由于增大熒光物質的摩爾吸光 系數，有利于產生更多的激發(fā)態(tài)分子,18,(3) 剛性平面結構 實驗發(fā)現(xiàn)，多數具有剛性平面結構的 有機分子具有強烈的熒光。 因為這種結構可以減少分子的振動， 使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用 減少，也就減少了碰 撞去

8、活的可能性。,19,20,（4）取代基效應,芳環(huán)上 取代基,給電子基團，熒光增強,（-OH、-OR、-CN、-NH2）,產生了p-共軛作用，增強了電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。,吸電子基團,減弱甚至會猝滅熒光,如-COOH、-NO、-C O、鹵素,鹵素取代基隨原子序數的增加而熒光降低,在重原子中，能級之間的交叉現(xiàn)象比 較嚴重，因此容易發(fā)生自旋軌道的相互作用，增加了由單重態(tài)轉化為三重態(tài)的速率,3. 金屬螯合物的熒光 大多數無機鹽類金屬離子，在溶液中只能 發(fā)生無輻射躍遷，因而不產生熒光。 不少有機化合物雖然具有共軛雙鍵，但由 于不是剛性結構，分子處于非同一平面， 因而不發(fā)

9、生熒光。 但是，若這些化合物和金屬離子形成螯 合物，隨著分子的剛性增強，平面結構的 增大，常會發(fā)生熒光,21,22,23,同一種熒光物質溶于不同溶劑，其熒光光譜的位置和強度 可能有明顯不同。,4溶劑效應,一般情況下，隨著溶劑的極性的增加，熒光物質的* 躍遷幾率增加，熒光強度將增強，熒光波長也發(fā)生紅移。,5 溫度的影響,一般說來，大多數熒光物質的溶液隨著溫度的降低， 熒光效率和熒光強度將增加,如熒光素的乙醇溶液在0以下每降低10 ， 熒光效率增加3%，冷至-80時，熒光效率為100%。,（四）溶液的熒光（或磷光）強度 1. 熒光強度與溶液濃度的關系 熒光強度If正比于吸收的光量Ia與熒光量 子產

10、率 。 If = Ia 式中為熒光量子效率，又根據Beer定律 A=-lg I/ I0 I= I0 .10- A Ia = I0 - I = I0(1- 10 -A) I0和I分別是入射光強度和透射光強度。代入上式得 If = I0(1- 10 -kb c),24,整理得： If =2.3 I0 kbc 當入射光強度I0 和b一定時，上式為： If = K c 即熒光強度與熒光物質的濃度成之正比， 但這種線性關系只有在極稀的溶液中， 當 kbc0.05時才成立。 對于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強度和濃度不呈線性關系。,25,26,2 、影響熒光強度的環(huán)境因素,因素,溶劑,一般

11、溶劑效應,折射率和介電常數的影響,特殊溶劑效應,熒光體和溶劑分子間的 特殊化學作用如氫鍵的生成,同一種熒光物質在不同的溶劑中的熒光光譜不同,溫度,溫度上升使熒光強度下降,內部能量轉化作用增大,碰撞頻率增加，使外轉換的幾率增加,酸度,化合物所處狀態(tài)不同,電子構型上有所不同,熒光強度和熒光光譜不同,27,28,3、熒光猝滅,定義：熒光物質分子與溶劑分子或其它溶質分子 的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象,類型,碰撞猝滅,激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞,熒光分子以無輻射躍遷的方式回到基態(tài),靜態(tài)猝滅,熒光物質分子與猝滅劑分子生成非熒光 的絡合物,轉入三重態(tài)的猝滅,發(fā)生電子轉移反應的猝滅,猝滅劑與熒

12、光物質,熒光物質的自猝滅,濃度較高單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未 激發(fā)的熒光物質分子碰撞而引起的自猝滅,溶解氧與熒光物質,29,光源,氙燈和高壓汞燈,激發(fā)單色器,光柵,掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長,樣品池,I0,I,If,發(fā)射單色器,掃描發(fā)射光譜,消除其它光線的干擾 獲得所需的熒光,檢測器,顯示器,與分光光度計的差別,兩個單色器,兩個單色器互成直角,光電倍增管,二、熒光分析儀,30,三、分子熒光分析法及其應用,1. 熒光分析方法的特點,（1）靈敏度高 （2）選擇性強 （3）試樣量少和方法簡單 （4）提供比較多的物理參數,2、熒光定量分析的方法,方法,標準曲線法,熒光強度與熒光物質濃度成正比的

13、關系,比較法,同樣條件下，測定試樣溶液和一標準溶液 的熒光強度，直接通過比例計算,31,3、熒光分析法的應用,方法,直接熒光法,被測物本身有熒光,被測物與試劑反應后,F與物質的 濃度成正比,熒光猝滅法,被測物使熒光熄滅,由熒光強度降低的強度來測定被測物的含量,間接熒光法,某些陰離子奪取金屬絡合物中金屬 離子，而釋放出能發(fā)熒光的配位體,催化熒光法,反應速度慢，熒光微弱，難測定,金屬離子將加速反應進行,32,磷光分析法,1如何獲得較強的磷光,增加試樣的剛性: 低溫冷凍,固體磷光法：吸附于固相載體（濾紙）,分子締合物的形成：加入表面活性劑等,重原子效應：加入含重原子的物質，如銀鹽等,敏化磷光：通過能

14、量轉移產生磷光,磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級,基態(tài)， T1 S0躍遷；,電子由S0進入T1的可能過程：（ S0 T1禁阻躍遷）,33,熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。 在有熒光發(fā)射的同時測量磷光,磷光分析儀器,應用,34,化學發(fā)光分析法,一、基本原理,A +B C + D*,D* D + h,某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時， 發(fā)射出一定波長的光,（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機化合物，芳香族化合物,（2）發(fā)光反應多為氧化還原反應，激發(fā)能與反應能相當,E=170300 kJ/mol；位于可見光區(qū),（3）發(fā)光持續(xù)時間較長，反應持續(xù)進行,發(fā)光反應如果存在于

15、生物體(螢火蟲)中，稱生物發(fā)光,35,化學發(fā)光效率,化學效率：,發(fā)光效率：,化學反應所決定,化學反應和環(huán)境因素,化學發(fā)光強度(單位時間發(fā)射的光量子數)：,dc/dt是分析物參加反應的速率,36,若化學發(fā)光反應是一級動力學反應則,即發(fā)光總強度與被測物濃度成線性：,二、化學發(fā)光反應類型,1. 直接化學發(fā)光和間接化學發(fā)光,直接發(fā)光 是被測物作為反應物直接參加化學發(fā)光反應 ，生成電子激發(fā)態(tài)產物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子,A + B C* + D C* C + h,37,間接發(fā)光是被測物A或B，通過化學反應生成初始激發(fā)態(tài)產 物C* ， C* 不直接發(fā)光，而是將其能量轉移給F，使F躍遷 回基態(tài)，產生發(fā)光

16、。,A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h,2. 氣相化學發(fā)光和液相化學發(fā)光,（1）氣相化學發(fā)光,化學發(fā)光反應在氣相中進行,主要有O3、NO、S的化學發(fā)光反應，可用于監(jiān)測空氣中的 O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等,NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h,38,（2）液相化學發(fā)光,化學發(fā)光反應在液相中進行,應用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；,魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應過程：,魯米諾- H2O2發(fā)光反應反應速度慢，可檢測低至 10-9 mol/L 的H2O2；,39,生物發(fā)光,生物發(fā)光是化學發(fā)光中的一類，特指在生物體內通過 化

17、學反應產生的發(fā)光現(xiàn)象，主要由酶來催化產生的。 多種細菌、昆蟲、魚類等均能發(fā)光,40,熒光燈：當高壓加在燈管兩端后，燈管內少數電子高速撞擊電極后產生二次電子發(fā)射，開始放電，管內的水銀受電子撞擊后，激發(fā)輻射出253.7nm的紫外光，產生的紫外光激發(fā)涂在管內壁上的熒光粉而產生可見光。 （可見光的顏色將依據所選用的熒光粉的不同而不同）,41,熒光棒中的化學物質主要由三種物質組成：過氧化物、酯類化合物和熒光染料。簡單地說，熒光棒發(fā)光的原理就是過氧化物和酯類化合物發(fā)生反應，將反應后的能量傳遞給熒光染料，再由染料發(fā)出熒光。目前市場上常見的熒光棒中通常放置了一個玻璃管夾層，夾層內外隔離了過氧化物和酯類化合物，

18、經過揉搓，兩種化合物反應使得熒光染料發(fā)光。,42,三、化學發(fā)光的測量儀器,儀器主要包括： 樣品室、光檢測器、放大器和信號輸出裝置等部件,43,熒光法測定維生素B2片劑中核黃素含量,一、實驗目的：,1學習和掌握熒光光度分析方法,2了解熒光分光光度計的結構及使用方法,二、實驗原理：,維生素B2結構式,維生素B2，又叫核黃素， 橘黃色,無臭的針狀晶體,易溶于水而不溶于 乙醚等有機溶劑,在中性或酸性溶液中穩(wěn)定,光照易分解，對熱穩(wěn)定,44,維生素B2水溶液在430-440nm藍光或紫外光照射下 會發(fā)生綠色熒光，熒光峰在535nm,在pH=6-7溶液 中熒光強度最大，在pH=11的堿溶液中熒光消失， 所以

19、可以用熒光光譜法測定維生素2的含量,三、實驗用品： 1儀器： 熒光分光光度計，移液管，容量瓶，棕色試劑瓶， 比色管，燒杯，離心機，離心管 2藥品： 核黃素（生化試劑），冰醋酸（AR）,鹽酸（AR） 氫氧化鈉，市售維生素B2片劑,45,四、實驗步驟： 1、試劑溶液的配制 1）5醋酸溶液 取5份冰醋酸與95份體積蒸餾水混合 2）10.0mgL-1VB2標準溶液：準確稱取10.0mgVB2 將其溶解于少量的5%HAc中，轉移至1L容量瓶中用5%HAc 稀釋至刻度，該溶液應裝于棕色試劑瓶中，置陰涼處保存 3）待測液：取市售VB2一片，置于50mL燒杯中，加入約 12mL 5%HAc溶液，用玻璃棒搗碎藥

20、片，水浴加熱使樣品 由混濁變?yōu)榛就该骱笕∠吕鋮s，轉移并加入5%HAc溶液 定容至100 mL。取數毫升于離心管中進行離心，用移液 管準確移取5 mL的上層清液并定容成50mL，貯于棕色試 劑瓶中，置陰涼處保存,2、激發(fā)光和熒光波長的選擇 準確移取10.0mgL-1VB2標準溶液5.0 mL于50mL容量瓶中定容。轉移部分溶液至石英比色皿中，將熒光分光光度計的熒光波長暫定在525 nm處，在200500 nm波長范圍內對激發(fā)波長進行掃描，記錄激發(fā)光譜曲線，約在265、372、442nm有三個峰。然后將激發(fā)波長設定在442nm處，在400700nm波長范圍內對熒光波長掃描，記錄熒光光譜曲線，約在

21、525nm處熒光強度最大。從激發(fā)和發(fā)射光譜上確定最佳的激發(fā)和發(fā)射波長,46,3、標準系列溶液的配制 在五個干凈的50mL容量瓶中，分別加入1.00 mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL和5.00 mL定容至50mL。 4、標準溶液的測定 設置適當的儀器參數, 在最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長處從稀到濃測量系列標準溶液的熒光強度。 5、未知試樣的測定 取待測液5.0 mL置于50mL容量瓶中，用5%HAc溶液稀釋至刻度，搖勻。用測定標準系列時相同的條件，測量其熒光強度。,47,五、數據處理： 0 1 2 3 4 5 6 VB2 標mL 0 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 VB2待mL 5.00 用H2O定容 (VB2) 0.00 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 (mgL-1 ) 熒光強度(F) 1用標準系列溶液的熒光強度繪制標準工作曲線。 2根據經稀釋的待測液的熒光強度，從標準工作曲線上求得其濃度 VB2 %=,48,