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1、氣單胞菌檢驗及研究進(jìn)展,概述 流行病學(xué) 微生物特性 嗜水氣單胞菌的鑒定要點,概 述,氣單胞菌在自然界分布廣泛 ,普遍存在于淡水、 污水、 淤泥、土壤和人類糞便中 ,有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病菌株可感染魚類、 兩棲類、 爬行類、 鳥類和哺乳類等動物 。臨床上以急性出血性敗血癥為主要特征。,氣單胞菌可引起人腸道感染和腸道外感染 ,如敗血癥、 傷口、 眼、 骨關(guān)節(jié)、 腹腔感染和其它感染 ,其中嗜水氣單胞菌是一種典型的人 -畜 -魚共患病原菌 ,人類可因致病性嗜水氣單胞菌感染而發(fā)生腹瀉、 食物中毒、 繼發(fā)感染等等。,分類與地位,1984年第 8版伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊 中列為弧菌科 ,氣單胞菌

2、屬。 嗜水氣單胞菌：嗜水氣單胞菌嗜水亞種、 嗜水氣單胞菌無色亞種和嗜水氣單胞菌解朊亞種 豚鼠氣單胞菌 溫和氣單胞菌 殺鮭氣單胞菌：殺鮭亞種、不產(chǎn)色亞種、殺日本鮭亞種 維隆氣單胞菌：溫和生物亞種和維氏生物亞種,至今，發(fā)展到l4個氣單胞菌表型種和 16個基 因種 ,把以往被歸類為弧菌科的氣單胞菌屬劃 為一個獨立的科 ,即氣單胞菌科。,流 行 病 學(xué),自然棲息地,主要存在于水生環(huán)境包括食品、 地面水、 海水、 河水、 湖泊、 蓄水池和供水系統(tǒng)中 ,其生長密度較低 ,可小于 11 000個細(xì)胞 /mL; 在廢水、 處理過或未處理的污水、 家庭污水泥漿中密度很高 ,可高達(dá) 1億個細(xì)胞 /mL以上。 許多

3、氣單胞菌可在新鮮或儲存食品中廣泛存在 ,并且數(shù)量很高。 在瓶裝天然礦泉水中 ,甚至手術(shù)使用的醫(yī)療用品中也能檢出氣單胞菌。,致病因素,在溫血和冷血脊椎動物 (包括青蛙、 魚、 爬蟲、蛇、 鳥和人 )中 ,氣單胞菌與許多種類的疾病有關(guān) ,對人感染主要有兩類: 腸道感染和腸道外感染 (敗血癥、 傷口、 眼、 骨關(guān)節(jié)、 腹腔感染和其他感染 )。 毒力因子：外毒素、胞外蛋白酶、s蛋白、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等 外毒素包括腸毒素、溶血素和細(xì)胞毒素,文獻(xiàn)報道,食物及環(huán)境中分離到的氣單胞菌 29 . 4%產(chǎn)生腸毒素 , 43 . 1%產(chǎn)生溶血素 , 89 . 0%產(chǎn)生細(xì)胞毒素 , 從食物中分離到的氣單胞菌 1

4、8 . 2%產(chǎn)生腸毒素 , 17 . 1%產(chǎn)生溶血素 , 72 .7%產(chǎn)生細(xì)胞毒素 。 溫和氣單胞菌和維隆氣單胞菌比其他菌種產(chǎn)生更多的腸毒素和溶血素 ,維隆氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌可產(chǎn)生細(xì)胞游離性溶血素。,嗜水氣單胞菌致病因子,嗜水氣單胞菌可以通過飲水、 皮膚創(chuàng)傷等途徑感染動物機體， 并在體內(nèi)經(jīng)過不同途徑對機體的不同器官進(jìn)行破壞。 嗜水氣單胞菌可產(chǎn)生多種致病因子 氣溶素(aerolysin) 、 溶血素(hemolysin)、 溶血毒素(hemolytic toxin ) 、 細(xì)胞毒性腸毒素( cytolyti- centerotoxin ) 、 胞外蛋白酶 、型菌毛、 s層蛋白及載鐵體等。,嗜

5、水氣單胞菌致病因子,外毒素( exotoxin) 由于嗜水氣單胞菌基因型的多樣性， 其外毒素的基因差異也很大， 包括氣溶素、 溶血素、 溶血毒素和細(xì)胞毒性腸毒素等。雖然外毒素名稱各異，但這些毒素在結(jié)構(gòu)和功能上都極為相似：它們都是單一多肽分子，并且其生物學(xué)活性相同，都具有溶血性、腸毒性和細(xì)胞毒性， 因此外毒素屬于同一基因家族。 國際上將外毒素統(tǒng)一命名為氣溶素( Aer ) 。在國內(nèi)， 涂小林、 陸承平等將毒素命名為 HEC毒素。,嗜水氣單胞菌致病因子,胞外酶 是嗜水氣單胞菌重要的致病因子之 一， 研究得較多的是金屬蛋白酶和絲氨酸蛋 白酶。 G o b i u s、A n g u i t a等分別

6、克隆得 到了嗜水氣單胞菌的胞外淀粉酶、 蛋白酶、 脂肪酶及磷脂酶。,嗜水氣單胞菌致病因子,胞外蛋白酶有的具有直接致病性，有的則不具有直接致病性 ， 但可以活化其他致病因子，外毒素是以無活性的前體形式存在的， 必須經(jīng)過蛋白酶將其前體 C末端的蛋白降解后才具有生物學(xué)活性。 總之， 嗜水氣單胞菌的致病因子繁多復(fù)雜，它們對機體發(fā)揮毒性作用時也不是單個因子獨立作用， 而是相互協(xié)同作用于機體的 。,胃腸道感染,腹瀉病是氣單胞菌感染最常見的臨床表現(xiàn) 好發(fā)人群主要是 5歲以下兒童 ,成人也有報道 ,但很少引起旅游者腹瀉。 夏季發(fā)病率最高 主要由嗜水氣單胞菌、 豚鼠氣單胞菌和溫和氣單胞菌引起氣單胞菌相關(guān)性胃腸道

7、感染 。 傾向于輕度的、自限性的水樣腹瀉。但也有出現(xiàn)血便和糞便白細(xì)胞的嚴(yán)重病例 ,與志賀菌所致的痢疾非常相似。 少數(shù)情況下還可引起霍亂樣腹瀉。,腸道外感染,菌血癥 傷口感染 通常繼發(fā)于胃腸炎或外傷性損害以及接觸 污染水體后發(fā)生。 主要是嗜水氣單胞菌和維隆氣單胞菌引起,氣單胞菌有致病性菌株和非致病性菌株之分。 從腸道外來源分離的氣單胞菌特別是以純培養(yǎng)物 的形式分離時比較有臨床意義。 在沒有分離到其他腸道病原 (包括兒童輪狀病 毒 )的情況下 , 從10歲以下患者分離的大多數(shù)菌 株比較有意義。而成人只有嗜水氣單胞菌和維 隆氣單胞菌比較有意義。,藥物敏感性,多數(shù)菌株產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶 ，大多數(shù)氣單胞菌對青

8、霉素、 氨芐青霉素、 替卡西林耐藥 ，對廣譜抗生素先鋒霉素、 氨基糖苷類、 碳青霉烯、 氯霉素、 四環(huán)素、 復(fù)方新諾明和喹諾酮類敏感。 我國氣單胞菌對抗生素的耐藥比較普遍 , 氣單胞菌主要 3個種的耐藥率比較 ,對頭孢噻肟和頭孢美唑的敏感率溫和氣單胞菌明顯高于嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌,對其他抗生素的耐藥率各種之間無明顯差異。 我中心的食品中氣單胞菌藥敏試驗結(jié)果表明，氣單胞菌對利福平、氨芐青霉素的耐藥率較高，對丁胺卡那、慶大霉素、氟哌酸的敏感性高。,微生物特性,形態(tài)和染色特征,革蘭陰性、 直桿狀或略彎、球形、 末端鈍圓的菌體 無莢膜 ,無芽孢 ,有時也可呈雙球狀或絲狀。 單極鞭毛 ,固體培養(yǎng)基

9、上的幼齡培養(yǎng)物可形成周鞭毛。 殺蛙氣單胞菌和中間氣單胞菌幼菌株無運動性。,培養(yǎng)與鑒定,觸酶和氧化酶均為陽性 還原硝酸鹽為亞硝酸鹽 發(fā)酵葡萄糖以及其他許多糖類產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣 生長溫度范圍廣 (045) ,人分離菌株 (嗜常溫菌株 )在 1042 間生長 ,而無運動性的嗜冷菌種生長的最高溫度為 37(如中間氣單胞菌 )或更低一些 (如殺蛙氣單胞菌 )。在腦心浸液培養(yǎng)基 28培養(yǎng)條件下 ,可在 pH 4 . 59 . 0和 0% 4%的NaCl濃度生長。 氣單胞菌可在許多普通常規(guī)培養(yǎng)基上生長 ,如血、巧克力平板及許多腸道鑒別培養(yǎng)基。,培養(yǎng)與鑒定,28培養(yǎng) 24小時 普通營養(yǎng)瓊脂平板 菌落為光滑、 凸

10、起、 圓整、 無色或淡黃色 ,有特殊芳香氣味。菌落大小因培養(yǎng)時間溫度而異 ,小如針尖 ,大的直徑可達(dá) 23mm,不產(chǎn)生色素。 血瓊脂 某些菌株即使在 10也可產(chǎn)生清晰的-溶血環(huán)。,培養(yǎng)與鑒定,注：許多氣單胞菌 ,如豚鼠氣單胞菌蔗糖或乳糖利用 陽性 ,在選擇性培養(yǎng)基上發(fā)酵乳糖 ,與腸道的常居菌群 不易鑒別。因此使用麥康凱等腸道選擇性培養(yǎng)基來分 離氣單胞菌時 ,一些菌株很容易被漏檢。 堿性蛋白胨水是氣單胞菌最有效的增菌培養(yǎng)基。,血清分型,氣單胞菌血清學(xué)分型主要用于流行病學(xué)調(diào)查。 多年來的研究表明 ,嗜水氣單胞菌、 溫和氣單胞菌 和豚鼠氣單胞菌的分離頻率在所有氣單胞菌中占有 絕對優(yōu)勢地位 ,其中尤以

11、嗜水氣單胞菌為最 ,而其他 種類則極少從環(huán)境和腹瀉患者中分離出 ,難以形成 種群優(yōu)勢。,國際上對氣單胞菌的血清學(xué)分型研究比較系統(tǒng)的是 日本國立康復(fù)研究院 (N I H)和荷蘭國立公共健康和 環(huán)境衛(wèi)生研究院 (N IPHEH)對嗜溫群氣單胞菌的血 清學(xué)分型 ,前者共分 44個 O抗原血清型 ,后者分 30 個 O抗原血清型。,血清分型,英國學(xué)者 Thomas等將 N I H系統(tǒng)在原有 44個 O型血清基礎(chǔ)上擴(kuò)大到 96個。Thomas的分型結(jié)果顯示 03、 016、 017和034是優(yōu)勢血清型 ,其中 011、 016和 034毒力強大 ,被認(rèn)為是引起人類腹瀉的重要病原 。 魚源氣單胞菌的優(yōu)勢血

12、清型主要為011、 019和034引起。國內(nèi)則多認(rèn)為 05和 09是引起家養(yǎng)魚類暴發(fā)性流行病的優(yōu)勢血清型,而人源主要也是 011、 016、 034。,檢驗程序,標(biāo)本,增菌,分離培養(yǎng) （血平板、Mac）,全面生化反應(yīng),可疑菌落,腸毒素測定,初步生化反應(yīng),涂片 染色鏡檢,血標(biāo)本,氧化酶 TCBS生長 O/129 耐鹽試驗,鑒定試驗,與腸道桿菌、非發(fā)酵菌鑒別 與鄰單胞菌屬和弧菌屬鑒別 氣單胞菌屬種間鑒別,。,致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法 GB/ T 1 8 6 5 2 -2 0 0 2,本標(biāo)準(zhǔn)在嗜水氣單胞菌的鑒定中， 參考了 伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊 (第九版， 1 9 9 4 ) 中有關(guān)嗜水氣單胞菌的

13、內(nèi)容。 在嗜水氣單胞菌的分離鑒定中， 除采用選擇培養(yǎng)基R S培養(yǎng)基及鑒別培養(yǎng)基嗜水氣單胞菌( A H M)培養(yǎng)基外，還應(yīng)借助一些生化反應(yīng)將其與假單胞菌、鄰單胞菌、腸桿菌、弧菌及其他氣單胞菌進(jìn)行區(qū)分。 蛋白酶是嗜水氣單胞菌重要的毒力決定因子，與該菌的致病性密切相關(guān)，凡蛋白酶陽性的嗜水氣單胞菌均具致病性。蛋白酶的檢測除采用脫脂奶平板法外，還可采用斑點酶聯(lián)免疫試驗。,本標(biāo)準(zhǔn)可用于嗜水氣單胞菌的分離鑒定， 而且可區(qū)分致病性菌株和非致病性菌株，有助于致病性嗜水氣單胞菌感染的確切診斷。 本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。,致病性嗜水氣單胞菌檢驗程序,嗜水氣單胞菌

14、的鑒定,檢樣： 水樣的分離用孔徑為0.2 m的硝酸纖維素微孔濾膜過濾水樣,取出濾膜，置含有滅菌堿性蛋白胨水的試管中。,菌落形態(tài) 嗜水氣單胞菌在普通瓊脂平板上，2 8 培養(yǎng)2 4 h后的菌落為光滑、微凸、圓整 、無色或淡黃色，有特殊芳香氣味。 革蘭氏染色 嗜水氣單胞菌應(yīng)為革蘭氏陰性短桿菌。 氧化酶試驗 陽性,嗜水氣單胞菌革蘭染色,嗜水氣單胞菌菌落特征（血平板）,嗜水氣單胞菌菌落特征（MAC）,返回,嗜水氣單胞菌電鏡圖,返回,AHM鑒別培養(yǎng),用鉑金耳挑取普通瓊脂平板上氧化酶試驗陽性的單個菌落少許， 穿刺接種AHM鑒別培養(yǎng)基。 3 7 培養(yǎng)2 4 h 結(jié)果：頂部仍為紫色，底部為淡黃色; 細(xì)菌沿穿刺

15、線呈刷狀生長，即動力陽性; 部分菌株頂部呈黑 色。,AHM,吲哚試驗,在長有細(xì)菌的A H M鑒別培養(yǎng)基頂部， 滴加3 -4 滴K o v a c s 試劑，若沿試管內(nèi)壁出現(xiàn)紅色環(huán)者，表明產(chǎn)生吲哚，判為陽性。 嗜水氣單胞菌應(yīng)為陽性,糖發(fā)酵試驗,分別接種葡萄糖、 蔗糖、 阿拉伯搪、 七葉苷及水楊苷等5 種糖發(fā)酵試驗管, 嗜水氣單胞菌可發(fā)酵以上5 種糖類。,嗜水氣單胞菌致病性鑒定,脫脂奶平板試驗,用鉑金耳取A H M鑒別培養(yǎng)基表面菌落少許,接種劃線于1 %脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板。 2 8 培養(yǎng)2 4 h 若菌落周圍出現(xiàn)清晰、透明的溶蛋白圈，判為陽性。,脫 脂 奶 平 板 試 驗,脫 脂 奶 平 板

16、試 驗,斑點酶聯(lián)免疫試驗,用鉑金耳取A H M鑒別培養(yǎng)基表面菌落少許。接種蔗糖胰蛋白胨肉湯, 2 8 搖床( 3 0 r / mi n ) 培養(yǎng)4 8 h。1 0 0 0 0 r / mi n離心 1 0 mi n ， 取上清。 用微量加樣器取5 L點樣于硝酸纖微素膜光面，3 7 烘干。 置2 0 %脫脂奶中， 3 7 封閉1 h 。 用含吐溫- 2 0的磷酸鹽緩沖液洗5次，每次 2 min。 置1：5 0 兔抗嗜水氣單胞菌蛋白酶抗血清中， 3 7 作用 1 h。,斑點酶聯(lián)免疫試驗,用含吐溫- 2 0的磷酸鹽緩沖液洗5 次，每次2min ，置1：1 0 酶標(biāo)羊抗兔抗血清中， 3 7 作用 1

17、h 。 用含吐溫- 2 0的磷酸鹽緩沖液洗5 次，每次2 mi n 。 加 3 , 3 -二氨基聯(lián)苯胺-過氧化氫中顯色。 待斑點明顯后，用去離子水終止顯色。 設(shè)無菌肉湯作陰性對照。 以出現(xiàn)明顯棕色斑點者判為陽性。,試驗結(jié)果分析判定,符合以下特性者應(yīng)判為致病性嗜水氣單胞菌: 在普通瓊脂平板上， 2 8 培養(yǎng)2 4 h后的菌落為光滑、 微凸、圓整、無色或淡黃色，有特殊芳香氣味; 在A H M鑒別培養(yǎng)基中，頂部仍為紫色，底部為淡黃色; 細(xì)菌沿穿刺線呈刷狀生長，即運動力陽性; 部分菌株頂部呈黑色; 氧化酶試驗陽性，革蘭氏染色為陰性短桿菌; 吲哚試驗陽性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷及水楊苷等5 種糖類; 脫脂奶平板試驗陽性或斑點酶聯(lián)免疫試驗陽性。,謝謝！,