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1、第十一章第十一章 高效液相色譜法高效液相色譜法(HPLC)11-1 概述概述高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相柱經(jīng)典液相柱色譜裝置色譜裝置高效液相色譜儀高效液相色譜儀經(jīng)典液相色譜經(jīng)典液相色譜 HPLC固定相粒徑固定相粒徑流動相驅(qū)動方式流動相驅(qū)動方式流動相流速流動相流速150-200 m重力或低壓泵重力或低壓泵很慢很慢3-10 m高壓泵高壓泵快快(1-10mL/min)例：分離例：分離20種氨基酸種氨基酸柱長：柱長：170 cm柱徑：柱徑：0.9 cmF：30 mL/ht分離分離:20 h經(jīng)典柱色經(jīng)典柱色譜譜HPLCt分離分離：1 h11-2 基本理論基本理論一

2、一 色譜柱柱效的基本關(guān)系式色譜柱柱效的基本關(guān)系式222/11654.5 WtWtnrreffeffeffnLH 二二 分離度分離度 14)()(22112effrrnWWttR三三 速率方程速率方程CuuBAH MDB 20 uB在大多數(shù)情況下，在大多數(shù)情況下，溶質(zhì)在液相流動相溶質(zhì)在液相流動相中的擴(kuò)散系數(shù)，約中的擴(kuò)散系數(shù)，約為氣相中擴(kuò)散系數(shù)為氣相中擴(kuò)散系數(shù)的萬分之一的萬分之一CuAH 流動相流速對板高的影響流動相流速對板高的影響1)小顆粒填料，填充均勻；小顆粒填料，填充均勻；2)選擇較低的流動相流速；選擇較低的流動相流速；3)選擇粘度小的溶劑作流動相，改善傳質(zhì)。選擇粘度小的溶劑作流動相，改善傳

3、質(zhì)。修正的速率方程：修正的速率方程：提高柱效提高柱效途徑途徑11-2 高效液相色譜分離方法高效液相色譜分離方法一一 吸附色譜法吸附色譜法1 分離原理分離原理nadnadadSXSXK X+nSadXad+SnKad值越大，保留時間越長。值越大，保留時間越長。2 固定相固定相硅膠強(qiáng)極性硅膠強(qiáng)極性氧化鋁弱極性氧化鋁弱極性活性炭非極性活性炭非極性分子篩分子篩強(qiáng)極性強(qiáng)極性高分子多孔微球高分子多孔微球(GDX)固體吸附劑固體吸附劑硅膠表面結(jié)構(gòu)硅膠表面結(jié)構(gòu)硅膠表面結(jié)構(gòu)經(jīng)熱處理發(fā)生的變化硅膠表面結(jié)構(gòu)經(jīng)熱處理發(fā)生的變化3 流動相流動相(洗脫劑洗脫劑)越大，越大，表明流動相溶劑分子對吸表明流動相溶劑分子對吸附劑

4、的親和能力越強(qiáng)，則越易從吸附附劑的親和能力越強(qiáng)，則越易從吸附劑上將被吸附的溶質(zhì)洗脫下來。劑上將被吸附的溶質(zhì)洗脫下來。溶劑分子在單位吸附劑表面上的溶劑分子在單位吸附劑表面上的吸附自由能吸附自由能。溶劑強(qiáng)度參數(shù)溶劑強(qiáng)度參數(shù)硅膠固定相分離苯，甲苯，硅膠固定相分離苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯乙苯，丙苯，丁苯流動相：流動相：干燥正庚烷干燥正庚烷1份水飽和的正庚烷份水飽和的正庚烷2份干燥正庚烷份干燥正庚烷水飽和的正庚烷水飽和的正庚烷改變流動相的改變流動相的組成可改變分離組成可改變分離的選擇性的選擇性4 應(yīng)用應(yīng)用具有具有不同官能團(tuán)的化合物不同官能團(tuán)的化合物具有相同官能團(tuán)，但數(shù)量不同的化合物具有相同官能團(tuán)，但數(shù)

5、量不同的化合物異構(gòu)體異構(gòu)體例：幾種取代位置不同的硝基例：幾種取代位置不同的硝基苯胺的分離。在硅膠吸附劑上苯胺的分離。在硅膠吸附劑上的滯留順序：的滯留順序：鄰位鄰位 間位間位 流動相極性流動相極性正相分配色譜正相分配色譜組分極性越大，組分極性越大，保留時間越長保留時間越長反相分配反相分配色譜色譜固定相極性固定相極性流動相極性流動相極性組分極性越小，組分極性越小，保留時間越長保留時間越長三三 離子交換色譜法離子交換色譜法陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂陽離子交換陽離子交換陰離子交換陰離子交換+RSO3-H+H+RSO3-M+M+RNR3+Cl-+X-RNR3+X-Cl-1 分離原理分離原理2 固定相固

6、定相陽離子陽離子：SO3H(強(qiáng)強(qiáng))CO2H(弱弱)陰離子：陰離子：N+R3(強(qiáng)強(qiáng))NH2(弱弱)基基質(zhì)質(zhì)合成樹脂合成樹脂纖維素纖維素硅膠硅膠離子交換劑離子交換劑3 流動相流動相水相水相緩沖液緩沖液+有機(jī)改性劑有機(jī)改性劑調(diào)節(jié)選擇性的調(diào)節(jié)選擇性的主要參數(shù)主要參數(shù)鹽種類及濃度鹽種類及濃度pH值值各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序：各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序：FOHCOOCHHCOOClSCNBrCrONOIOCSO324324224檸檬酸離子檸檬酸離子用檸檬酸離子洗脫比用氟離子洗脫快用檸檬酸離子洗脫比用氟離子洗脫快4 應(yīng)用應(yīng)用離子及可離解的化合物離子及可離解的化合物如氨基酸、核酸、蛋

7、白質(zhì)等如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等四四 化學(xué)鍵合相色譜化學(xué)鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相采用化學(xué)鍵合相的液相色譜的液相色譜固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因此它適用于種類繁多樣品的分離。此它適用于種類繁多樣品的分離。特點特點1.鍵合固定相制備鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相鍵合相硅膠硅膠十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非極性非極性硅烷化反應(yīng)硅烷化反應(yīng)使用使用pH范圍：范圍：2-8鍵合固定相類鍵合固定相類型型疏水基團(tuán)疏水基團(tuán)烷烴（烷烴（C8和和C18）、苯基等）、苯基等極性基團(tuán)極性基團(tuán)丙氨

8、基丙氨基氰乙基氰乙基醚和醇等醚和醇等離子交換基團(tuán)離子交換基團(tuán)胺基、季銨鹽胺基、季銨鹽磺酸、羧酸磺酸、羧酸2.鍵合相色譜法分類鍵合相色譜法分類反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜:常用固定相：常用固定相：C18分離對象分離對象非極性非極性中等極性化合物中等極性化合物常用流動相常用流動相甲醇甲醇-水水乙睛乙睛-水水反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜疏溶劑分離機(jī)制疏溶劑分離機(jī)制固定相極性固定相極性 流動相極性流動相極性離子性鍵合相色譜離子性鍵合相色譜將各種離子交換基團(tuán)化學(xué)鍵合到硅膠基質(zhì)將各種離子交換基團(tuán)化學(xué)鍵合到硅膠基質(zhì)表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相。其分離原理與離子

9、交換色譜類同。定相。其分離原理與離子交換色譜類同。例：甲苯和苯酚的分離。流動相：甲醇例：甲苯和苯酚的分離。流動相：甲醇-水水出峰順序：苯酚，甲苯出峰順序：苯酚，甲苯出峰順序：甲苯，苯酚出峰順序：甲苯，苯酚十八烷基十八烷基鍵合相鍵合相二醇基二醇基鍵合相鍵合相保留時間：保留時間：例：以例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇鍵合色譜柱、甲醇-水為流動相分離水為流動相分離以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。COOHOHOHCOOHOHOHHO沒食子酸沒食子酸3,4-二羥基苯甲酸二羥基苯甲酸固定相固定相:非極性非極性;流動相流動相:極性極性組分極性組分極性:3,4-二羥基苯甲酸二羥基苯

10、甲酸沒食子酸沒食子酸五五 尺寸排阻尺寸排阻(凝膠凝膠)色譜法色譜法排阻色譜分離示意圖排阻色譜分離示意圖相對分子質(zhì)量差別相對分子質(zhì)量差別大于大于10的化合物的化合物才可以分離才可以分離1 分離原理分離原理2 固定相固定相是一種經(jīng)過是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體，其中含網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體，其中含有大量液體（一般是水），有大量液體（一般是水），柔軟而富于彈性。柔軟而富于彈性。凝膠凝膠3 流動相流動相不采用改變流動相組成的不采用改變流動相組成的方法控制分離度方法控制分離度分離方法的選擇分離方法的選擇11-3 高效液相色譜儀高效液相色譜儀高壓泵高壓泵流動相流動相溶劑溶劑廢液廢液色譜

11、柱色譜柱進(jìn)樣口進(jìn)樣口檢測器檢測器一一 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)1 高壓泵高壓泵要求要求輸出壓力高輸出壓力高平穩(wěn)、脈沖小平穩(wěn)、脈沖小流量穩(wěn)定可調(diào)流量穩(wěn)定可調(diào)耐腐蝕耐腐蝕2 梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置 低壓梯度低壓梯度 高壓梯度高壓梯度 通過改變流動相的組成來調(diào)整通過改變流動相的組成來調(diào)整組分的組分的k k值，改變分離因子值，改變分離因子值，值，以達(dá)到最短時間內(nèi)得到最佳分以達(dá)到最短時間內(nèi)得到最佳分離的目的。離的目的。梯度洗脫梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫梯度洗脫梯度洗脫的特點的特點改善分離改善分離,加快分析速度；加快分析速度；改善峰形改善峰形,減少拖尾減少拖尾;可能引起可能引起基線漂移

12、基線漂移分配比變化范圍寬的分配比變化范圍寬的復(fù)雜樣品應(yīng)采取復(fù)雜樣品應(yīng)采取梯度洗脫方式分離梯度洗脫方式分離3 貯液瓶及流動相貯液瓶及流動相1)對樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。對樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。2)適用于所選擇的檢測器。適用于所選擇的檢測器。3)化學(xué)惰性好，以免破壞固定相?；瘜W(xué)惰性好，以免破壞固定相。4)低粘度，增加樣品的擴(kuò)散系數(shù)，提高柱效。低粘度，增加樣品的擴(kuò)散系數(shù)，提高柱效。5)純度高。溶劑不純會增加檢測器噪聲，產(chǎn)生偽峰。純度高。溶劑不純會增加檢測器噪聲，產(chǎn)生偽峰。對流動相溶劑對流動相溶劑的一般要求的一般要求二二 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 準(zhǔn)備狀態(tài)準(zhǔn)備狀態(tài) 進(jìn)樣狀態(tài)進(jìn)

13、樣狀態(tài)六通閥進(jìn)樣六通閥進(jìn)樣 裝置裝置自動進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器 三三 色譜柱色譜柱內(nèi)徑：內(nèi)徑：16 mm，柱長：柱長：530 cm；柱填料粒徑：柱填料粒徑：5m 分離柱分離柱四四 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)1 紫外吸收檢測器紫外吸收檢測器(a)可變波長紫外檢測器可變波長紫外檢測器(b)二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器氘燈氘燈光柵光柵流通池流通池測量光電二極管測量光電二極管參比光電二極管參比光電二極管2 二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器兩種檢測器的色譜圖兩種檢測器的色譜圖(a)：可變波長紫外檢測器；可變波長紫外檢測器；(b)：二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器(b)(a)nm254 紫外檢測器紫外檢測器靈敏度高，

14、靈敏度高，精密度及線性范圍較好精密度及線性范圍較好 ，可用于梯度洗脫。可用于梯度洗脫。流動相選擇有限制。流動相選擇有限制。一些常用溶劑的紫外截止波長一些常用溶劑的紫外截止波長溶劑溶劑CS2氯仿氯仿 四氫四氫呋喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截紫外截止波長止波長/nm380245212210 1902051873 熒光檢測器熒光檢測器靈敏度高，選擇靈敏度高，選擇性好，可用于梯度性好，可用于梯度洗脫。洗脫。4 示差折光檢測器示差折光檢測器利用組分與流動利用組分與流動相的折射率之差進(jìn)相的折射率之差進(jìn)行檢測。行檢測。通用性好，靈敏通用性好，靈敏度較低，不適用于度較低，不適用于梯度洗脫。梯度洗脫。5 化學(xué)發(fā)光檢測器化學(xué)發(fā)光檢測器6 電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器安培檢測器安培檢測器7 質(zhì)譜檢測器質(zhì)譜檢測器