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1、二維電泳應(yīng)用于糖蛋白的分離鑒定,目錄,,糖蛋白,1,,糖基化,2,,凝膠電泳—分離純化技術(shù),3,,基于PAS反應(yīng)的染色方法,4,糖蛋白（glycoprotein）,膜蛋白中的糖,膜蛋白分子中的糖,這些寡糖鏈常常是具分支的雜糖鏈，不呈現(xiàn)重復(fù)的雙糖系列，一般由2-10個(gè)單體（少于15）組成，未端成員常常是唾液酸或L-巖藻糖。,糖蛋白的結(jié)構(gòu),單糖的種類葡萄糖(Glu)半乳糖(Gal)甘露糖(Man)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)巖藻糖(Fuc)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc),連接方式,糖蛋白的結(jié)構(gòu),糖基化,糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾最重要的方式之一，是必需的生理過程，

2、對(duì)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的正確發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。糖蛋白的形成是糖基化的一種表現(xiàn)形式,糖基化,,,,,,,,,,,,生物活性,折疊,溶解度,半衰期,抗原性,蛋白質(zhì),,糖鏈,糖蛋白,分離純化及鑒定是糖蛋白研究的重要步驟,糖蛋白的分離純化方法,,,,,,Capillaryelectrophoresis,毛細(xì)管電泳,MLC,多維液相色譜,electroblottillg,電印跡技術(shù),gelelectrophoresis,凝膠電泳,,電泳技術(shù)的基本原理,電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中的定向移動(dòng)。,等電聚焦(IsoelectrofocusingIEF),原理Pr為兩性電解質(zhì)，不同Pr其aa的數(shù)量、種類及占比例不同

3、，因此pI不同，pI范圍窄且凈電荷為零，因此依pI分離Pr。EF是在凝膠中加兩性載體電解質(zhì)，通直流電后，可形成從陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH梯度(連續(xù)的,穩(wěn)定的,線性的pH)。,原理當(dāng)Pr在電場(chǎng)中遷移到它的PI時(shí)，由于凈電荷為零，不再移動(dòng)。如擴(kuò)散，附近的凝膠會(huì)使其荷電陽(yáng)、陰極會(huì)重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被濃縮成窄、穩(wěn)定的帶。稱這種濃縮效應(yīng)為聚焦。只要凝膠中的pH梯度范圍足夠窄。便可將pI相近的Pr分開，EF是電泳技術(shù)中分辨率最高的技術(shù)。,等電聚焦(IsoelectrofocusingIEF),,,等電聚焦(IsoelectrofocusingIEF),返回,聚丙烯酰胺凝膠電泳(

4、PAGE),聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethylethylenediamine，簡(jiǎn)稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O3，簡(jiǎn)稱AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2,C17H2O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophore

5、sis，簡(jiǎn)稱PAGE)。,電泳過程示意圖A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個(gè)區(qū)帶。,聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳,插入梳子,聚丙烯酰胺凝膠電泳,加緩沖液,加樣,聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳,剝膠,聚丙烯酰胺凝膠電泳,標(biāo)準(zhǔn)Marker蛋白的電泳圖譜,聚丙烯酰胺凝膠電泳,凝膠電泳,,可直接在膠上對(duì)糖蛋白進(jìn)行酸水解或酶解后進(jìn)行后續(xù)的鑒定分析或糖鏈的結(jié)構(gòu)分析。,,可以同時(shí)分離多個(gè)復(fù)雜混合物,,,,,優(yōu)勢(shì),雙向凝膠電泳（二維電泳）第一向采用等電聚焦根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分中各個(gè)蛋白質(zhì)的PI的不

6、同，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）就是按蛋白質(zhì)分子量的大小使其在垂直方向進(jìn)行分離。其結(jié)果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點(diǎn)狀。,二維電泳,,膠性PH9中電加解入質(zhì)了溶雙液PH3,加上電場(chǎng)后建立穩(wěn)定PH梯度,蛋白質(zhì)溶液加入，建立電場(chǎng),染色后，蛋白質(zhì)因PI值不同，沿PH梯度分離開,第一向等電聚焦,PI逐漸降低,等電聚焦膠放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠上,第二向SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳,分子量逐漸降低,PI逐漸降低,雙向凝膠電泳示意圖,二維電泳,染色,二維電泳,,,,,1,基于PAS反應(yīng)的染色方法,,,,,3,GelCode糖蛋白染色試劑盒,,,,,,,

7、,,,2,硼酸根熒光染料,二維電泳中糖蛋白的染色方法,基于PAS反應(yīng)的染色方法,PAS--periodicacid-Schiff’sbasemethod(高碘酸/過碘酸-席夫式堿方法)原理在過碘酸的作用下，糖蛋白中糖鏈上相鄰兩個(gè)碳原子上的羥基被氧化成醛基，醛基再與帶有紫外或熒光基團(tuán)的氨基形成席夫式堿，在紫外或熒光燈下檢測(cè)即可。席夫式堿——N原子和C原子雙鍵結(jié)合的一類化合物,基于PAS反應(yīng)的染色方法,,,,,酸性品紅,丹酰肼熒光試劑,丹磺酰甘氨酰肼熒光試劑,Pro-QEmerald類染料,過碘酸作用顯紫紅色對(duì)還有唾液酸的糖蛋白靈敏染色7天靈敏度低μg,高碘酸作用醛基與胺基反應(yīng)形成腙染色2天靈敏度低40ng反應(yīng)條件苛刻,酸性條件靈敏度低10-20ng糖蛋白染色專一性高，適用于未知樣品的鑒定分析和樣品純度的鑒定,美國(guó)新發(fā)明的一種糖蛋白鑒定試劑盒反應(yīng)條件溫和靈敏度極高糖基化位點(diǎn)表達(dá)程度圖譜熒光標(biāo)記物結(jié)構(gòu)尚未公開,ThankYou!,