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1、第九章原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交,原生質(zhì)體的獲得原生質(zhì)體的培養(yǎng)體細(xì)胞雜交,原生質(zhì)體的獲得,原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體的用途原生質(zhì)體的分離,原生質(zhì)體的概念,指植物細(xì)胞除去細(xì)胞壁以外的部分,原生質(zhì)體的用途,植物原生質(zhì)體是沒(méi)有細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，它在一些研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。原生質(zhì)體是研究細(xì)胞骨架、細(xì)胞壁的形成與功能、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、大分子物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的過(guò)程與機(jī)理等問(wèn)題的良好實(shí)驗(yàn)體系。遺傳轉(zhuǎn)化：原生質(zhì)體與外源DNA共培養(yǎng)時(shí)，原生質(zhì)體可以直接吸收外源DNA，并整合到染色體上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)植株再生就可以得到轉(zhuǎn)基因植物。,原生質(zhì)體的用途,體細(xì)胞雜交由于原生質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞壁，所以不同的原生質(zhì)體可

2、以相互靠近，發(fā)生融合，進(jìn)行細(xì)胞雜交。2個(gè)不同植物體細(xì)胞發(fā)生融合、形成新細(xì)胞的過(guò)程，稱為體細(xì)胞雜交。所得到的融合細(xì)胞為雜種細(xì)胞，再通過(guò)植株再生就可能創(chuàng)造出新的植物個(gè)體。,原生質(zhì)體的分離——機(jī)械法,高產(chǎn)量、高質(zhì)量的分離原生質(zhì)體是進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)和操作的前提。方法：機(jī)械法、酶解法機(jī)械法：通過(guò)對(duì)植物組織進(jìn)行切割、研磨等方法破壞植物細(xì)胞壁，使原生質(zhì)體游離出來(lái)的一種方法缺點(diǎn):效率極低、原生質(zhì)體破碎嚴(yán)重，完好的原生質(zhì)體數(shù)量少優(yōu)點(diǎn)：對(duì)原生質(zhì)體以后的負(fù)面影響小,原生質(zhì)體的分離——機(jī)械法,具體方法：Klercker（1982），大植物細(xì)胞置于高滲的蔗糖溶液中，使細(xì)胞質(zhì)壁發(fā)生分離，原生質(zhì)體收縮成球形，然后用利刃切割

3、，在切割的過(guò)程中，有些細(xì)胞只被切去了細(xì)胞壁，從而釋放出完整的原生質(zhì)體.適用范圍：某些植物的貯藏組織，如：胡蘿卜的根、洋蔥的鱗片等細(xì)胞高度液泡化的組織.,原生質(zhì)體的分離——酶解法,酶解法：1960年由英國(guó)的Cooking發(fā)明，是利用一些酶分解植物細(xì)胞壁而獲得原生質(zhì)體的一種方法。植物細(xì)胞壁組成：纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：分離原生質(zhì)體的效率很高，用少量的材料就可以得到大量完整的原生質(zhì)體，已成為分離原生質(zhì)體的最主要方法酶制劑：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶（離析酶）、崩潰酶（纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶）,具體步驟：,材料的選擇材料來(lái)源：細(xì)胞分裂旺盛的外植體，如幼嫩小苗的根、胚軸、子葉、幼葉等；處于

4、快速生長(zhǎng)期的愈傷組織或懸浮細(xì)胞.對(duì)于容易培養(yǎng)、再生那里較強(qiáng)的雙子葉植物（如煙草、菊花、胡蘿卜、矮牽牛等）也可用完全展開(kāi)的葉片作材料.用于分離原生質(zhì)體的植物材料要培養(yǎng)在最佳的光溫條件下.,原生質(zhì)體的分離——酶解法,酶解處理酶解處理對(duì)以后的原生質(zhì)體培養(yǎng)至關(guān)重要.原則：利用盡可能低的酶濃度和盡可能短的酶解時(shí)間來(lái)獲得大量有活力的原生質(zhì)體.酶解液的準(zhǔn)備：由于植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成的，所以，酶解液中一般含有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，濃度為0.5-2.0%,原生質(zhì)體的分離——酶解法,滲透壓的調(diào)節(jié)必要性：為了保持釋放出來(lái)的原生質(zhì)體的活力和膜穩(wěn)定性，必須使原生質(zhì)體處于一個(gè)等滲環(huán)境

5、中。因此，酶解液中必須加入滲透壓調(diào)節(jié)劑。常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑有：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，濃度一般為0.35-0.8mol/L。具體用什么濃度，要根據(jù)材料的水勢(shì)來(lái)確定。,原生質(zhì)體的分離——酶解法,加入其它物質(zhì)酶解液中加入較高濃度的Ca2+可以提高膜的穩(wěn)定性；加入葡聚糖硫酸鉀、KH2PO4也可以提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性和活力；加入牛血清蛋白可防止酶解過(guò)程對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞；在酶解液中加入pH緩沖劑有利于保持酶解液的酸堿環(huán)境的穩(wěn)定，增加原生質(zhì)體的釋放量和原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。,原生質(zhì)體的分離——酶解法,原生質(zhì)體的分離——酶解法,注意事項(xiàng)酶解液配制好后，要用過(guò)濾滅菌的方法進(jìn)行滅菌，并且隨配隨用.,原生質(zhì)體

6、的分離——酶解法,酶解就是將無(wú)菌材料放入酶解液中、釋放出原生質(zhì)體的過(guò)程。有菌材料，則必須進(jìn)行表面消毒處理。葉片、幼莖和根等材料要切成小片，葉片最好撕去下表皮。懸浮細(xì)胞則要離心后再酶解。,原生質(zhì)體的分離——酶解法,用量：材料與酶解液的比率為2-10g/100ml酶解液。溫度和光照：一般在252℃、黑暗中酶解，期間輕輕搖動(dòng)幾次，或放在50rpm的搖床上。時(shí)間：酶解時(shí)間因材料而異，2小時(shí)-10幾小時(shí)。,葉片的酶解法分離原生質(zhì)體,原生質(zhì)體的收集與純化過(guò)濾：酶解結(jié)束后，要及時(shí)的將酶解物通過(guò)孔徑為20-80m的不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，除去未被酶解的組織塊和細(xì)胞團(tuán)。離心：濾液轉(zhuǎn)到離心管中在50g下離心5min。反復(fù)

7、洗滌：離心結(jié)束后，棄去上清液，用培養(yǎng)基和原生質(zhì)體洗液重新懸浮沉淀的原生質(zhì)體，再離心。如此反復(fù)2-4次，就可以將殘留的酶液去掉。純化：如原生質(zhì)體不純（如含有較多的細(xì)胞碎片），可用含高濃度（21%）蔗糖的培養(yǎng)基進(jìn)行離心、純化，完整的原生質(zhì)體漂浮在上清液的上部。,原生質(zhì)體的分離——酶解法,完整的原生質(zhì)體,,原生質(zhì)體的分離——酶解法,原生質(zhì)體活力的測(cè)定原生質(zhì)體活力的高低對(duì)后來(lái)的原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合影響極大。測(cè)定原生質(zhì)體活力的方法常用熒光素雙醋酸酯（FDA）染色法。原生質(zhì)體活力（%）=發(fā)熒光的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)100,原生質(zhì)體的分離——酶解法,,,,,,,,,,,,,,,,原生質(zhì)體培養(yǎng),發(fā)育過(guò)程：原

8、生質(zhì)體在培養(yǎng)過(guò)程中，首先形成細(xì)胞壁（原生質(zhì)體由圓形變?yōu)橐欢ㄐ螤睿?，后?lái)進(jìn)行分裂、形成細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織、完整植株。,苜蓿,,夜來(lái)香,1天,5天,7天,10天,,4周,5周,7周,原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法,液體淺層培養(yǎng)將含原生質(zhì)體的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿底部，使其成一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。此種方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)原生質(zhì)體的損傷小，而且容易以后添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。但原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間粘連，從而影響其進(jìn)一步的生長(zhǎng)、分裂；同時(shí)，原生質(zhì)體的位置不能固定，所以不能跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體的生長(zhǎng)過(guò)程。,原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法,固體培養(yǎng)（平板培養(yǎng)）30-35℃的瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基與原生質(zhì)體溶液混合，搖勻，

9、倒入培養(yǎng)皿中，瓊脂或瓊脂糖凝固后，就成一薄層。平板培養(yǎng)時(shí)原生質(zhì)體都被固定，容易觀察、統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的分裂情況，但操作比較復(fù)雜。進(jìn)行平板培養(yǎng)時(shí)，要注意混合時(shí)培養(yǎng)基的溫度。溫度高對(duì)原生質(zhì)體的傷害大；溫度低，培養(yǎng)基凝固，原生質(zhì)體與培養(yǎng)基不能混勻。平板培養(yǎng)在以后添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物方面也要復(fù)雜些。,原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法,液體—固體結(jié)合培養(yǎng)液體淺層—固體平板培養(yǎng)雙層培養(yǎng)法：培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液倒入或滴入固體培養(yǎng)基表面。優(yōu)點(diǎn)是固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)可以緩慢釋放倒液體培養(yǎng)基中。如果在固體培養(yǎng)基中加入活性炭，還可以吸附培養(yǎng)物分泌的有毒物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的生長(zhǎng)和分裂。,原生質(zhì)體的

10、培養(yǎng)方法,瓊脂糖珠培養(yǎng)用移液管吸取含原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基，滴在培養(yǎng)皿或三角瓶中，待其凝固后，再加入適量的液體培養(yǎng)基，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。也可以等含原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基凝固后，用刀將其切成小塊，再放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這種方法改進(jìn)了培養(yǎng)物的通氣和營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，從而促進(jìn)可以促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂及細(xì)胞團(tuán)的形成。,,看護(hù)培養(yǎng),原生質(zhì)體的生長(zhǎng)、分裂,在適宜的培養(yǎng)條件下，原生質(zhì)體數(shù)小時(shí)后開(kāi)始形成新的細(xì)胞壁。這時(shí)，在顯微鏡下可見(jiàn)原生質(zhì)體由圓球形逐漸變?yōu)榉叫?、多邊形等。約24-36h后，原生質(zhì)體開(kāi)始發(fā)生第一次分裂；以后隨著細(xì)胞分裂，原生質(zhì)體就形成細(xì)胞團(tuán)。但是，在細(xì)胞分裂開(kāi)始以后，培養(yǎng)基中的甘露醇或山梨醇的濃度要逐漸降

11、低，否則會(huì)影響細(xì)胞的繼續(xù)生長(zhǎng)、分裂。待原生質(zhì)體形成的細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）達(dá)到1mm時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。所形成的愈傷組織就可以按照普通的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)和植株再生。,影響原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的因素,原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的好壞，也可以用植板率來(lái)衡量。植物材料：用于分離原生質(zhì)體的植物材料對(duì)原生質(zhì)體后來(lái)培養(yǎng)的效果影響極大。不同的植物、同一植物不同的品種，其遺傳組成存在差異，原生質(zhì)體的培養(yǎng)效果也就必然有差異。如Yamada曾用26個(gè)水稻品種的種子誘導(dǎo)出愈傷組織，再建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，以懸浮細(xì)胞分離原生質(zhì)體，結(jié)果只有1個(gè)品種的原生質(zhì)體再生了植株。一般來(lái)說(shuō)，容易培養(yǎng)的植物、外植體，其原生質(zhì)體也容

12、易培養(yǎng)，反之，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。,培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基不同植物原生質(zhì)體要求有不同的基本培養(yǎng)基。使用什么基本培養(yǎng)基，可以參照相應(yīng)培養(yǎng)愈傷組織或細(xì)胞的培養(yǎng)基。一般認(rèn)為，原生質(zhì)體培養(yǎng)基種的大量元素應(yīng)比愈傷組織培養(yǎng)基中的大量元素濃度低。由于Ca2+影響到膜的穩(wěn)定性，因此較高Ca2+濃度的對(duì)原生質(zhì)體分裂有利。,培養(yǎng)基,有機(jī)成分：同培養(yǎng)細(xì)胞、愈傷組織相比，培養(yǎng)原生質(zhì)體時(shí)要求培養(yǎng)基有更豐富的有機(jī)成分，如氨基酸、維生素、CW，YE，LH，CH、小牛血清等。大量的結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺有利于原生質(zhì)體的分裂。激素：培養(yǎng)基中要加入一定濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素。由于2,4-D促進(jìn)

13、細(xì)胞分裂能力很強(qiáng)，所以培養(yǎng)基中大都要加2,4-D。條件化培養(yǎng)基：使用條件化培養(yǎng)基可以大大促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中的滲透壓：原生質(zhì)體無(wú)細(xì)胞壁，所以培養(yǎng)基中必須使用滲透壓調(diào)節(jié)劑（甘露醇、山梨醇等），以維持原生質(zhì)體的穩(wěn)定。但滲透壓調(diào)節(jié)劑濃度較高往往會(huì)抑制細(xì)胞分裂和后來(lái)的細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，培養(yǎng)基中滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度不能太高，并且在后來(lái)的培養(yǎng)過(guò)程中要逐漸降低甘露醇或山梨醇的濃度，以利于細(xì)胞的持續(xù)分裂和生長(zhǎng)。,體細(xì)胞雜交,原生質(zhì)體由于沒(méi)有細(xì)胞壁的限制，所以2個(gè)原生質(zhì)體可以彼此靠近，通過(guò)膜的融合而融為一體。如果2個(gè)相同的原生質(zhì)體發(fā)生融合，則可以實(shí)現(xiàn)染色體加倍；如果2個(gè)原生質(zhì)體不同，則就可以實(shí)現(xiàn)將2種不同植物的遺傳物質(zhì)組合在一起，形成一個(gè)新的雜種細(xì)胞，此雜種細(xì)胞通過(guò)植株再生，則可以得到雜種植株。2個(gè)不同體細(xì)胞發(fā)生融合的過(guò)程，稱為體細(xì)胞雜交。所得到的融合細(xì)胞為雜種細(xì)胞，再通過(guò)植株再生就可以創(chuàng)造出新的植物個(gè)體。,