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1、第三章 蛋白質(zhì)工程 習(xí)題 1、名詞解釋：蛋白質(zhì)工程：是基于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的認(rèn)識(shí)，進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，通過(guò)基因工程途徑定向地改造蛋白質(zhì)或創(chuàng)造合乎人類需要的新的突變蛋白質(zhì)的理論及實(shí)踐，是基因工程基礎(chǔ)上的延伸，是第二代基因工程。 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)：是為有目的的蛋白質(zhì)工程改造提供設(shè)計(jì)方案，即在知道了需要改造的蛋白質(zhì)的性能及其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之后，通過(guò)理論的方法，提出蛋白質(zhì)改造的設(shè)計(jì)方案。 嵌合抗體：用DNA重組技術(shù)將鼠源單抗的可變區(qū)(V區(qū))基因與人免疫球蛋白(Ig)的恒定區(qū)(C區(qū) )基因相連接,構(gòu)建成嵌合基因,導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),制成嵌合抗體。目前國(guó)內(nèi)外已制備了數(shù)十種嵌合抗體。 PDB

2、:蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)。 2、請(qǐng)列表總結(jié)基因工程和蛋白質(zhì)工程的相同點(diǎn)、不同之處（從結(jié)果、實(shí)質(zhì)、流程等方面）及其聯(lián)系。 基因工程 蛋白質(zhì)工程 相同點(diǎn) 操作環(huán)境——生物體外；操作對(duì)象——基因；操作水平——分子 結(jié)果 天然存在的蛋白 自然不存在的蛋白 實(shí)質(zhì) 基因重組 基因修飾或基因合成 流程 中心法則 中心法則逆推 聯(lián)系 蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上的延伸，是第二代基因工程 3、蛋白質(zhì)工程的基本目標(biāo)、基本途徑是什么？ 答：基本目標(biāo)：對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造,或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需要。

3、基本途徑：基因修飾或基因合成：借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、基因定點(diǎn)誘變和重組DNA技術(shù) 4、目前有哪些蛋白質(zhì)工程分子改造的常用方法？ 答：⒈基因定點(diǎn)突變技術(shù)（小改）：即通過(guò)在DNA水平上進(jìn)行堿基的取代、插入或缺失，達(dá)到改變基因，從而改變編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的技術(shù)，包括核苷酸引物誘變，盒式誘變，PCR誘變，隨機(jī)誘變。⒉基因剪切和融合（中改）：原理：將編碼某蛋白的部分基因移植到另種蛋白基因上，經(jīng)克隆、表達(dá)，產(chǎn)生新的融合蛋白?？蛇_(dá)到使蛋白易于表達(dá)、純化、細(xì)胞定位等，或使蛋白性質(zhì)改變。⒊基因全合成（大改）：合成DNA，然后表達(dá)出相應(yīng)蛋白。可以全部由人工控制，便于設(shè)計(jì)和改造，還適用于同時(shí)實(shí)現(xiàn)多處突變。 5、

4、蛋白質(zhì)工程中增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的基本途徑有哪些？ 答：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究表明，上述穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的因素是由蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中某一個(gè)或某一段氨基酸序列決定的，人工改變或修飾這些氨基酸殘基，有可能增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，又不影響其生物學(xué)活性。 設(shè)計(jì)目標(biāo) 解決辦法 熱穩(wěn)定性 引入二硫橋 增加內(nèi)氫鍵數(shù)目 改善內(nèi)疏水堆積 增加表面鹽橋 對(duì)氧化的穩(wěn)定性 把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser 把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu 把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr 對(duì)重金屬的穩(wěn)定性 把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser 把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu

5、 替代表面羧基 pH穩(wěn)定性 替換表面荷電基團(tuán) His、Cys以及Tyr的置換 內(nèi)離子對(duì)的置換 提高酶學(xué)性質(zhì) 專一性的改變 增加逆轉(zhuǎn)數(shù)(turnover number) 改變酸堿度 6、請(qǐng)簡(jiǎn)述PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變技術(shù)原理及優(yōu)缺點(diǎn)。 答：4種引物3次PCR。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，突變的成功率可達(dá)100%。缺點(diǎn)：①后續(xù)工作較復(fù)雜，PCR擴(kuò)增通常需要連接到載體分子上，然后才能對(duì)突變的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，翻譯等方面的研究。②不論是用普通的TaqDNA聚合酶還是高保真的Pfu酶，PCR方法產(chǎn)生的DNA片段都要經(jīng)過(guò)核苷酸序列測(cè)定，方可確證有無(wú)其他突變發(fā)生。 7、天然胰島素制劑在儲(chǔ)存中易

6、形成二聚體和六聚體，延緩胰島素從注射部位進(jìn)入血液，從而延緩了其降血糖作用，也增加了抗原性，其結(jié)構(gòu)如下。將胰島素B9殘基上極性的Ser置換為帶電荷Asp，同時(shí)把B27極性的Thr置換為帶負(fù)電荷的Glu，由此可制成速效胰島素。請(qǐng)闡述其原理。 答：已知二體形成過(guò)程中，兩個(gè)分子的結(jié)合面上SerB9與β鏈α螺旋上的Glu B13側(cè)鏈相靠近，兩個(gè)分子間的Glu B13相靠近，并且側(cè)鏈上帶有相同電荷，它們本身就有互斥作用。如果將臨近的Ser B9置換為Asp，可在二體間形成連續(xù)4個(gè)帶負(fù)電的側(cè)鏈，在六體中這種互斥的接觸重復(fù)三次，應(yīng)該有利于降低胰島素分子的締合作用。經(jīng)過(guò)這樣的改造，雙突變Ser B9 Asp/

7、Thr B27 Glu有效地使二體在毫摩爾濃度下解聚為單體，它進(jìn)入血液的吸收率也比天然胰島素提高了三倍。核磁共振譜研究表明它也保持了與天然蛋白相同的只要結(jié)構(gòu)特征。 8、枯草桿菌蛋白酶BNP不含二硫鍵，用蛋白質(zhì)工程引入二硫鍵時(shí)，會(huì)有怎樣的效果？ 答：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，二硫鍵的形成迫使同一或不同肽鏈的不同區(qū)域的氨基酸殘基向一起靠攏聚合，由此肽鏈迅速折疊并形成穩(wěn)定的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，該區(qū)域的氨基酸殘基數(shù)量是高度密集的；同時(shí)疏水氨基酸殘基圍繞的二硫鍵，可形成局部疏水中心，拒絕水分子進(jìn)入肽的內(nèi)部破壞氫鍵，利于形成穩(wěn)定的高級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。 9、舉例說(shuō)明蛋白質(zhì)工程在醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用成果。 答

8、：1、抗體工程：①臨床用鼠源單抗，面臨免疫排斥問題，引起失效和過(guò)敏，因此興起了抗體工程。有嵌合抗體、重構(gòu)抗體、單鏈抗原結(jié)合區(qū)、單功能域抗體及全套抗體研究,其主要目的是使鼠源性抗體“人源化”。 ②嵌合抗體——用DNA重組技術(shù)將鼠源單抗的可變區(qū)(V區(qū))基因與人免疫球蛋白(Ig)的恒定區(qū)(C區(qū) )基因相連接,構(gòu)建成嵌合基因,導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),制成嵌合抗體。目前國(guó)內(nèi)外已制備了數(shù)十種嵌合抗體。 ③該抗體 的“人源化”使其免疫原性大為降低。在初期臨床試驗(yàn)中,人源化嵌合抗體能夠解決一些問題,且半衰期可以延長(zhǎng)許多倍。但尚不能全部解決免疫原性問題, 有的嵌合抗體仍引起免疫反應(yīng)。 ④重構(gòu)抗體——是將動(dòng)

9、物抗體中的高可變區(qū),又稱補(bǔ)體決定區(qū)與人抗體相應(yīng)的區(qū)域交換而重新構(gòu)建抗體的補(bǔ)體決定區(qū),以進(jìn)一步“人源化”、降低單抗的免疫原性。現(xiàn)已構(gòu)建成功數(shù)種重構(gòu)抗體，它們的抗原結(jié)合能力得以保持。 2、改良枯草桿菌蛋白酶的性質(zhì)：①218位Asn，變成Ser，用65℃的失活半衰期衡量，從59分鐘增到223分鐘，酶的穩(wěn)定性顯著增加。 ②1985年Wells證明若用其他氨基酸取代Met222，可以提高枯草桿菌蛋白酶的氧化穩(wěn)定性而又保持高催化活性。 ③枯草桿菌蛋白酶可作為洗滌劑的添加劑，但底物作用范圍過(guò)窄（針對(duì)Phe羧基所形成的肽鍵），用Lys取代位于活性中心166位的Gly，使其底物作用范圍拓寬。 3、改良胰

10、島素: 天然胰島素制劑在儲(chǔ)存中易形成二聚體和六聚體，延緩胰島素從注射部位進(jìn)入血液，從而延緩了其降血糖作用，也增加了抗原性，這是胰島素B23-B28氨基酸殘基結(jié)構(gòu)所致。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改變這些殘基，則可降低其聚合作用，使胰島素快速起作用。該速效胰島素已通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)。 4、改良生長(zhǎng)激素:生長(zhǎng)素有時(shí)會(huì)結(jié)合催乳激素受體，引起副作用，18位、21位氨基酸改造，可能有望降低這種副作用。 5、改良治癌酶:改良皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶有殺死癌細(xì)胞功能，有人篩選到6個(gè)AA替換后（活性部位附近），催化能力大大提高。 6、改良T4溶菌酶: 將T4溶菌酶的第3位異亮氨酸變成半胱氨酸，后者與第97位的半胱氨酸形成二硫鍵，從而穩(wěn)定了兩個(gè)結(jié)構(gòu)域所形成的活性中心，使酶在高溫下的穩(wěn)定性大大提高。如果將該酶的第51位蘇氨酸換成脯氨酸，可使酶的活性提高25倍。