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1、高效液相色譜法,High Performance Liquid Chromatography （HPLC）,前言:,HPLC是70年代以后發(fā)展最快的一個分析化學分支，現(xiàn)已成為生化、醫(yī)學、藥物、化學化工、食品衛(wèi)生、環(huán)保檢測等領域最常用的分離分析手段。,我國：,開始僅為少數(shù)研究實驗室擁有， 現(xiàn)很多的生產(chǎn)、研究、質(zhì)檢部門。 廣泛應用于質(zhì)量控制、分析化驗、制備分離。例： 講課目的：入門 教材問題： 學習要求：,課時安排： 第一章：高效液相色譜的基本原理 6學時 第二章：高效液相色譜的儀器裝置 2學時 第三章：液固、液液、鍵合相色譜 4學時 第四章：離子交換色譜和離子對色譜 3學時 第

2、五章：凝膠滲透色譜 1學時 第六章：實驗技術和輔助實驗技術 2學時 機動 2學時 第3、5、7周實驗,參考書籍：,1.色譜理論基礎（盧佩章、戴朝政編） 2.高效液相色譜法（鄒漢法、張玉奎、盧佩章編著） 3.高效液相色譜方法及應用 （色譜技術叢書、化學工業(yè)出版社、 于世林編著),本課程基本要求：,1. 掌握色譜法的分類及有關術語； 2. 了解柱效的影響因素； 3. 掌握分離度的影響因素； 4. 了解定性、定量分析方法； 5. 掌握液相色譜儀的基本結(jié)構及功能； 6. 掌握常用的液相色譜法基本概念及分離 對象 7. 掌握液相色譜的基本操作技能；,第一章 高

3、效液相色譜法基本原理,1-1 概述 一.發(fā)展歷史: 100多年前俄國植物學家Tswett分離 植物色素時采用的實驗方法: Tswett用希臘語chroma(色)和graphos(譜) 描述他的實驗方法 即:Chromatography(色譜法),色譜法的發(fā)展,1906年正式命名 20世紀30年代開始廣泛研究和應用 (柱色譜,薄層色譜氣相色譜) 高效液相色譜法的廣泛應用始于20世紀70年代,,現(xiàn)代液相色譜分析方法。 經(jīng)典液相色譜法為基礎， 引入氣相色譜法的理論和實驗技術， 高壓輸送流動相， 高效固定相及高靈敏度檢測器.,二、色譜法概述,混合物最有效的分離、分析方法。 色譜法是一種分離

4、技術。 混合物分離過程：試樣中各組分在 色譜分離柱中的兩相間不斷進行著的 分配。 一相固定不動，稱為固定相。 另一相是攜帶試樣混合物流過固定 相的液體，稱為流動相。,高效液相色譜法的特性:,高壓、高效、高速、高靈敏。 適用：高沸點、熱不穩(wěn)定樣品,液相色譜儀,,,高效液相色譜儀流程圖,三、色譜法原理,,混合物中各組份在不同的兩相中溶解,吸附等化學作用性能的差異,當兩相相對運動時,使各組分在兩相中反復多次受到上述各作用力而達到相互分離 兩相中一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase), 一相是流動的,稱為流動相(Mobile Phase), (洗脫劑,溶劑

5、),分離原理:,分離是一個 物理過程。,,固定相(Stationary Phase) 流動相(Mobile Phase) 進樣 (Injection) 洗脫 (Elution) 相互作用(Interaction),當混合物進入色譜柱后，就在固定相、流動相之間不斷地進行分配平衡。不同的化合物，分子結(jié)構不同，理化性質(zhì)不同，所以在兩相中存在的濃度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，沖洗出柱子的時間就長，反之則短。這與分配系數(shù)K有關： K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用強，后流出柱子。,四、高效液相色譜法的特點,高壓 以液體作為流動相，液體流經(jīng)色譜柱時，受到阻力較大 必須對流動相施加高壓。

6、 一般可達到150300kgcm2， 甚至可達700kgcm2以上。,高速 所需的分析時間較經(jīng)典液體色譜少得多（交換速度快），流量可達l10mLmin,高效 氣相色譜的分離效能很高，高效液相色譜的柱效則更高（化學鍵合相），一般約可達 6000理論塔板米,高靈敏度 紫外檢測器的最小檢測量可達(10-9 g)； 熒光檢測器的靈敏度可達10-11g。 所需試樣很少；微升數(shù)量級 高選擇性 可分離不同類型化合物和異構體，也可分析在性質(zhì)上極為相似的化合物 (同位素、同分異構體、空間異構體、手性化合物）,,五、HPLC與GC區(qū)別,1分析對象的區(qū)別 GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點低的樣

7、 品， 占有機物的20% HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品. 對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差 樣品均可檢測 。 占有機物的80%,2流動相的區(qū)別 GC：流動相為惰性，組分與流動相無親合作用 力，只與固定相有相互作用。 HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用 力，能提高柱的選擇性、改善分離度. 對分離起主要作用。 3操作條件差別 4.分析樣品區(qū)別 GC：加溫操作 GC：破壞樣品，不能回收 HPLC：室溫；高壓 HPLC：不破壞樣品，能回收 說明：氣相、液相地位同樣重要 兩種互補不足的色譜方法 靈敏度：氣相液相 應用范圍：液相氣相,六、色譜法的分類,

8、吸附色譜(Absorption Chromatography) 組分對固定相表面吸附力的不同而分離 分配色譜(Partition Chromatography) 組分在固定相和流動相中的溶解度不同而分離 離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography) 組份離子交換親和力的差異而分離 體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography) 組分分子量大小不同,對固定相的滲透力不同而分離,基本概念 一、色譜圖（chromatogram）,檢測器將流動相中各組分濃度變化轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳碾娦盘枴?記錄儀所記錄下的濃度對分離時間的函數(shù)，稱為色譜圖。,色譜過程特點

9、：,濃度對分離時間呈高斯曲線型 色譜條件一定時，各組分都有一特定時間在圖譜中出現(xiàn)，稱為組分的保留時間。 柱效一定時，組分保留值越小，峰越 窄；保留值越大，峰越寬。 相鄰峰的保留時間相差越大，越易分離。,常用術語： 1. 基線 : 僅有純流動相進入檢測器時的流 出曲 線。 2.色譜峰: 響應信號大小隨時間變化所形成的峰 形曲線。(正態(tài)分布),3.峰高與峰面積： 峰高：色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離 用h表示。,峰面積： 峰與峰底之間的面積 ，用A表示。 二、色譜保留,,1. 保留時間（tR） 從進樣開始到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時間，用tR表示。,2.分配系數(shù)

10、K,組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度比（單位：g/mL），稱為分配系數(shù)，用K 表示:,分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。,分配系數(shù)K 的討論,一定溫度下，組分分配系數(shù)K越大，出峰越慢； 每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同； 選擇適宜的固定相可改善分離效果； 各組分有不同K 值是分離的基礎（差移速度） 某組分的K = 0時，即不被固定相保留，最先流 出。,3.容量因子k (capacity factor),一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質(zhì)量比。,1.與k都是與組分及固定相的熱力學性質(zhì)有關 的常數(shù), 隨分

11、離柱溫度、柱壓的改變而變化 2.與k都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù) ，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。 3. 容量因子可以由實驗測得。,4. 容量因子與保留時間的關系,推導: ux：組分在分離柱內(nèi)的遷移速度； u：流動相在分離柱內(nèi)的遷移速度；,,組分和流動相通過長度L的分離柱，需要時間分別為tR和t0，則 tR = to(1+k),k太小---沒有充分利用填料的分離能力 k太大---分析時間太長 k范圍： k 1/0（0溶劑強度---使組分遷移快慢的能力） P310 表3-10,作業(yè)：,思考題: 1、2、3、4、5、6、8、9,5. 選擇性系數(shù),可用來衡量兩物質(zhì)的分離程度，

12、用表示。,色譜理論需要解決的問題？,色譜分離過程的熱力學和動力學問題。,組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？ 組分保留時間：色譜過程的熱力學因素控制； （組分和固定相的結(jié)構和性質(zhì)） 色譜峰變寬：色譜過程的動力學因素控制； （兩相中的運動阻力，擴散） 兩種色譜理論：塔板理論和速率理論。,1-3 色譜柱的分離效率,一、塔板理論,塔板理論認為: 一根柱子可以分為n段，每段內(nèi)組分在兩相間迅速達到平衡，把每一段稱為一塊理論塔板。 設柱長為L，理論塔板高度為H，則 H=L/ 為理論塔板數(shù)。,,,理論塔板數(shù)一N 色譜峰對稱 ： 說明： a. 在給定的操作條件下，N幾乎相同 b. N為常

13、量時，tw 隨 tR 成正比例變化 c. 與柱長有關: 比較不同長度色譜柱的柱效時， 應當比較它們在相同柱長下的N值。例 d. 是一種理想狀態(tài),,, 有拖尾峰時: 可用半峰寬來表示N： N554 ( tR / W1/2 ) 2 W1/2 -----半峰寬,例：測得tR=105mm、 W1/2 =4mm，求得N=3789，若此柱長為250mm,折成每米的理論塔板數(shù)約為15200.,,理論塔板高度H,物理意義：組分在兩相間達到一次平衡對應 的柱長 H愈小組分在兩相間平衡分配次數(shù)越多 柱效（不能說明分離一定實現(xiàn)）,說明：,大，固定相分離潛能大。 （分離與否，還取決于其

14、他色譜條件） 一定色譜條件下，對k有差異的組分，則柱效愈高，分離效果愈好。,塔板理論的特點和不足：,(1)當L一定時，N 越大(H 越小)，被測組 分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效越 高，所得色譜峰越窄。 (2)柱效不能表示被分離組分的實際分離 效果：如兩組分的分配系數(shù)K 相同， 無論該色譜柱的柱效多大，都無法 分離。,(3)塔板理論無法解釋同一色譜柱在 不同的流動相流速下柱效不同的 實驗結(jié)果，也無法指出影響柱效 的因素及提高柱效的途徑。,二.峰擴展和速率方程式,1.峰擴展--由于柱內(nèi)柱外各種因素引起的色譜峰變寬或變形，從而造成色譜柱效的降低 峰擴展程度：取決于組分在柱內(nèi)平衡分 配次

15、數(shù) 例： 引起峰擴展因素：柱內(nèi)、柱外,柱外因素,檢測器流動池體積（盡量?。?柱出口到檢測器的連接管（盡量短） 進樣器死體積,2. 速率方程式（范弟姆特方程式）,H = A + B/u + Cu H：理論塔板高度， u：流動相流速(cm/s)。 減小A、B、C 三項可提高柱效。 A，B，C 三項各與哪些因素有關？,A 渦流擴散項,A = 2dp dp：固定相的平均顆粒直徑 ：固定相的填充不均勻因子,固定相顆粒越小dp，填充得越均勻，A，H，柱效。表現(xiàn)在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。,B/u 分子擴散項,B = 2 D D：試樣組分分子的擴散系數(shù)（cm2

16、s-1） (1) 存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴散; (2) 擴散導致色譜峰變寬，H()，分離變差; (3) B/u與流速有關：流速 滯留時間 擴散 (0.5ml/min) (4) 擴散系數(shù)D，B 值。 液相中，分子擴散可忽略,C u 傳質(zhì)項,傳質(zhì)溶質(zhì)分子在兩相間濃度不同，由濃度高的相不斷遷 移至濃度低的相，直到濃度達到平衡。 根據(jù)傳質(zhì)形式分：固定相傳質(zhì)和移動相傳質(zhì) C =（Cs + Cm） 固定相傳質(zhì)原因：進出固定相速度不同（固相，液相） 減小措施：使用薄的固定相層，小顆粒填料 移動相傳質(zhì)：遷移滯留 減小措施 填裝均勻緊密 使用小顆粒填料和表面多孔性填料,3. 速率理論的要點

17、:,(1)柱內(nèi)的峰擴展與渦流擴散、分子擴散、傳質(zhì)阻力有關。固液兩相間的分配平衡不能瞬間達到是造成色譜峰擴展、柱效下降的主要原因。,(2) 通過選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔６?、液膜厚度及流動相流速可提高柱效?(3) 為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和填料對柱效及分離的影響。 (4) 各種因素相互制約：流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使柱效下降； 選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。,4.獲得高柱效的幾種方法：,選用細的顆粒填料 流動相流速低 流動相粘度小 升高溫度 溶質(zhì)擴散系數(shù)與其結(jié)構有關 大分子，擴散系數(shù)小 小分子，擴散系數(shù)大,5. 影響分離的

18、因素與提高柱效的途徑 液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴散項B/u較小，可忽略不計，即 H = A + C u,降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。 氣相和液相區(qū)別,分離度,色譜分離目的：合理的時間內(nèi)將樣品中組分成功 分離 分離度：表示分離狀況的一種度量 分離度影響因素： 保留值之差色譜過程的熱力學因素； 峰的寬度色譜過程的動力學因素。,討論：,色譜分離中的四種情況：, 柱效較高，K(分配系數(shù))較大，完全分離。 K 不是很大，柱效較高，峰較窄，基本分離。 柱效較低，K 較大，但分離的不好。 K 小，柱效低，分離效果更差。,,一分離度的表達式：,R

19、=0.8：兩峰的分離程度可達89%； R=1：分離程度98%(達到定性定量分析的最低要求) R=1.5：達99.7%（相鄰兩峰達到基線分離）。,對濃度不同組分而言：,兩個組分的分離度會隨濃度比的增大而 減小 例： 對多組分而言： 整個色譜分離的分離度取決于Rs最小值的兩個峰。,二分離度影響因素 峰的寬度（峰寬越小， Rs越大） 峰的寬窄主要反映了色譜分離的動力學特性 兩峰的保留時間之差（tR越大， Rs越大） 反映了色譜分離的熱力學特性 分離度基本 關系式：,四控制分離度方法,改變k 調(diào)節(jié)溶劑強度可以改變k 增大---使用較弱溶劑 降低---使用較強溶劑 正相色譜---固定相極性大于移動相

20、 （溶劑極性大溶劑強度大洗脫能力強?。?反相色譜---固定相極性小于移動相 （溶劑極性大溶劑強度小洗脫能力弱大） 例： P307311,更換色譜柱（改變N）,措施： a.選擇長柱子(N=L/H) b.填料顆粒盡量小 c.低流速(溶質(zhì)傳質(zhì)阻力小，峰擴展小) d.低的溶劑粘度(提高柱效) e.提高柱溫,改變選擇性系數(shù),,（ =1， 不能實現(xiàn)分離),下列途徑改善： a.流動相(梯度洗脫) P279 （適用于極性范圍寬的樣品） b.固定相(換柱，改變填料） c.溫度（改變熱力學參數(shù)）,五. 分離度控制的一般原則:,開始k值很小，若要增大Rs，則首先應將k調(diào)整至1 k 10范圍，這樣

21、，不用改變其他條件，就可使Rs增大。 開始k已在1 k 10范圍，但Rs不大，則必須增大N來改善Rs。 k，N的改變都不能增大Rs時，再設法改變,作業(yè)：,思考題： 7，1017,第二章 儀器裝置 四大部件： 高壓輸液泵 進樣器 高效分離柱 檢測器,21 高壓輸液泵 作用：向色譜柱輸送一個連續(xù)、恒定的移動相。 一、對泵系統(tǒng)的要求 1.使用方便（易調(diào)節(jié)流量、過壓保護等） 2.更換洗脫液容易、死體積小 3.有最大工作壓力(20MPa，130MPa) 4.一定流量范圍（直徑小，流量小；速度快，流量大。）（0.110ml/min) 5.流量穩(wěn)定性好(流量噪聲、流量波動、流量漂 移） 6.流量

22、精度高,機械往復式柱塞泵的工作原理：,特點：,能連續(xù)供給恒定體積的移動相，不受整個色譜系統(tǒng)中其余部分稍有變化的影響。 死體積較小，約0.1ml，更換溶劑方便，適用于梯度洗脫。 缺點： 輸出有脈沖波動 二個因素：脫氣不完全 泵的周期性吸液 影響檢測靈敏度。（對紫外檢測器影響不大）,梯度淋洗裝置,外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。,內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,泵系統(tǒng)發(fā)展趨勢,高效：填料顆粒分離效率 柱壓降泵的工作壓力 分析時間短：更快流速柱壓降 (超快

23、速分析） 減少洗脫液用量(4.6mm1mm) 液相色譜的多元洗脫系統(tǒng) P277280,22 色譜柱,組成：精密管徑的不銹鋼管、填料、柱接頭 要求：柱管內(nèi)壁非常光滑 柱接頭設計要保證系統(tǒng)中引入最小 死體積（柱前、柱后） 能密封高壓液體 兩端加過濾片,柱體為直形不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長540 cm。減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,柱效的影響因素,填料的顆粒度及其均勻性 柱長、填裝的方法與技巧 常用：內(nèi)徑25mm（4.6mm) 柱效一定時，柱長與顆粒度成正比 例如：顆粒度510um、柱長1530cm 顆粒度35um、 柱長7.515cm P282283,23 進樣裝置,六

24、通進樣閥 P280281 結(jié)構如圖：,2-4 檢測系統(tǒng) 功能：連續(xù)地將色譜柱中流出的組分隨時間 變化的情況，轉(zhuǎn)變成大小不同的電信 號輸入到記錄儀中，得到色譜圖。 按檢測方式不同，分為： 總體性質(zhì)檢測器（通用型） 示差折射檢測器 溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型） 紫外檢測器、熒光檢測器、電導檢測器,檢測器的性能指標 一個理想檢測器，必須具備下列條件： 靈敏度高 不受溫度及流動相流速變化的影響 響應隨組分量的變化而線性地變化 穩(wěn)定性好，操作方便,衡量指標： 靈敏度 S=R/Q 噪音在沒有樣品情況下，檢測器輸出的最大 振幅（溫度、流量、泵） 漂移檢測器在一段時間內(nèi)，基線隨時間的增

25、 加而產(chǎn)生的偏離（電壓、流動相） 最小檢測限樣品產(chǎn)生兩倍于噪音信號時的濃度 （檢測下限） 線性范圍檢測信號呈線性變化時，最大和最 小進樣量之比,檢測器,紫外檢測器 （光電二極管陣列檢測器） 示差折光檢測器 熒光檢測器 電導檢測器,a. 紫外檢測器 應用最廣，對大部分有機化合物有響應。 特點：,靈敏度高； 線性范圍寬； 流通池可做得很小(1mm 10mm ，容積 8L)； 對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作 (波長范圍，常用波長） 200400nm 254nm、280nm 可用于梯度洗脫。,b. 光電二極管陣列檢測器,紫外檢測器的重要進展；

26、 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖。,光電二極管陣列檢測器,三維：光譜-色譜圖,,檢測原理 比爾定律： A=c L 紫外檢測器優(yōu)點： 靈敏度高（1010g/ml) 對梯度洗脫是一種理想檢測器 局限性： 不能檢測對紫外光沒有吸收的樣品 不能使用對紫外光有吸收的溶劑 P289293,第三章 液固色譜和鍵合相色譜,31 液固吸附色譜 一、原理: 固定相是極性吸附劑，不同組份官能團具有不同極性，因而對固定相的吸附能力不同。 極性越大，吸附能力越強；極性越低，吸附能力越弱而導致分離。,存在競爭吸附：吸附解吸平衡 溶質(zhì)、流動相分子之間 溶質(zhì)中

27、不同官能團之間 競爭的結(jié)果，導致了分離。 溶質(zhì)在柱內(nèi)受到兩種力作用： 固定相的吸附力 流動相的溶解力 當吸附力溶解力 k大 吸附力溶解力 k小,二分離對象：,官能團有差別的不同類型化合物 （烷基類吸附弱，不能分離） 幾何異構體 (固定相表面是剛性結(jié)構 溶質(zhì)分子官能團與吸附中心的相互作用隨分子的幾何形狀而改變）,三填料的類型及其選擇,按形狀分： a. 球形 b. 無定形 按多孔程度分： a. 多孔型 b. 薄殼型 按極性分： a. 極性（硅膠、Al2O3 、MgO、分子篩） b.非極性（活性碳）,四、硅膠的活性控制及標準化,硅膠的特點： 活性控制意義： 標準化方法： 市售未處理硅膠加

28、熱46小時，活化去水，再加進定量水分，使吸附劑含水量保持恒定。 （100m2表面積含水0.020.03g為佳）,吸附強度分類,根據(jù)化合物結(jié)構類型，可將它們 在硅膠上 的吸附強度排序：P315 歸納： 官能團不同極性不同吸附強度不同 幾何異構體空間位置不同吸附強度不同 P314-316 P331-333,分子空間效應。 與官能團相鄰的大烷基可能降低保留能力；（位阻效應） 順式化合物的保留能力可能比反式化合物強； 對位化合物的保留能力可能比鄰位化合物強。,五樣品分子結(jié)構對保留的影響,對吸附色譜來說, 主要取決于樣品分子所含的官能團的類型及其數(shù)目。 常見官能團的吸附強度： 不吸附：烷烴 弱吸附：烯烴

29、、硫醇、硫醚、單環(huán)或雙環(huán)芳 烴、鹵代芳烴 中等吸附：多環(huán)芳烴、醚、腈、硝基物、大多 數(shù)羰基化合物 強吸附：醇、酚、胺、酰胺、亞楓、酸和多 官能團化合物,六、 液相色譜的流動相,1. 流動相實用要求 （1）溶劑的純度和化學特性必須滿足 色譜過程的穩(wěn)定性和重復性要求。,（2）避免使用與固定相發(fā)生不可逆反應溶劑。 （使用AI2O3-避免酸、使用硅膠避免堿）,（3）溶劑應不干擾使用檢測器的正常工作，與檢測器相匹 配。 使用的溶劑應當易于除去，不干擾對分離組分的回收。,2. 流動相分類,按流動相組成分：單組分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：一般淋洗和梯度

30、淋洗。 常用溶劑： 正相:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、 正戊烷 正庚烷 反相: 甲醇、乙腈、水溶液。,LSC 流動相的選擇,在吸附色譜中, 對溶質(zhì)保留值和分離選擇性起主導作用的是溶質(zhì)與固定相的作用, 流動相主要是調(diào)節(jié)溶質(zhì)的保留值在適當范圍內(nèi)。 溶劑強度洗脫能力 k 液固吸附色譜的流動相值要適當， 常用正己烷、正庚烷, 添加少量CH2Cl2、CHCl3、CH3CN和CH3OH。 (混合后的溶劑強度在兩種純?nèi)軇┲g）,液固色譜的應用特點： 對具有不同極性取代基的化合物表現(xiàn)出較高的選 擇性，但對同系物的分離能力較差 對強極性或離子型樣品，因有時會發(fā)生不可逆 吸附，液固色譜常不能獲得滿意的分離結(jié)果

31、。 吸附劑的含水量對吸附劑活性、樣品容量和保 留值有較大影響 液固吸附色譜主要應用于: 結(jié)構異構體、幾何異構體的分離。,,思考：在液固色譜中，以硅膠為固定相，對以下四 組分進行分離，流出色譜柱的順序可能是： a.鄰苯二胺 b對苯二胺 c間苯二胺 a. 苯酚 b. 對羥基苯胺 c. 苯胺 d. 苯,1 2,作業(yè),思考題： 19、20、2225、2729、3144,3-2 反相鍵合相色譜,,鍵合相色譜是目前HPLC中最常見的分離模式, 約80%的HPLC是采用反相鍵合相色譜。 烷基苯同系物分離分析 多環(huán)芳烴分離分析,反相鍵合相色譜 定義固定相通過某種化學反應將有機分 子以共價鍵結(jié)合在色

32、譜擔體的表面， 這種色譜類型稱之。 制備硅膠基質(zhì)化學鍵合固定相注意點： 鍵合反應前，將硅膠表面硅氧烷全部水 解為硅烷醇。 除去硅膠表面吸附水，使表面完全呈自 由硅醇基。,形成化學鍵合固定相 具備條件： 所用基質(zhì)材料 應有某種化學反應活性 有能與基質(zhì)表面發(fā)生 化學反應的官能團,化學鍵合固定相 (P303),a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水，耐光，耐有機溶劑，應用最廣 c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN,化學鍵合固定相的特點：,（1）傳質(zhì)快: 表面無深凹陷。 （2）壽命長: 化學鍵合，耐流動相沖擊； 穩(wěn)定。

33、（3）選擇性好: 可鍵合不同官能團，提高選 擇性 （4）有利于梯度洗脫。 由于產(chǎn)生弱極性固定相，因而擴展了反相色譜分離技術的應用。反相色譜正相色譜,存在著雙重分離機制：,由鍵合基團的覆蓋率決定 高覆蓋率：分配為主； 低覆蓋率：吸附為主。 常用反相鍵合固定相： C18、C8 P300P302,反相色譜保留機理,兩種觀點: 疏溶劑理論 （溶質(zhì)與極性溶劑疏遠） 雙保留機理 （殘留羥基）,影響溶質(zhì)保留的因素 流動相 組分的保留隨流動相極性的減少而減少, ln k H2O % , 有機溶劑% 增大, 極性下降, k值隨之下降。,思考：在ODS柱上，用70%甲醇/水或60%甲醇/水洗脫苯系物，

34、哪一種流動相使苯系物的保留值大，為什么？, 鍵合固定相： a.烷基覆蓋量增加，k值隨之增大。 b.烷基鏈長增加, k值隨之增大。 思考： 同樣是70%甲醇流動相，苯在C18比C8柱上的保留值大，為什么？, 溶質(zhì) 非離子化合物：極性大, k值小 非極性化合物：分子表面積大, k值大 同系物：鏈長增大, k值增大 苯系物：環(huán)數(shù)增大, k值增大; 若化合物的非極性部分相同, 極性官能團增 加, 則k值下降 幾何異構體：能形成內(nèi)氫鍵的異構體的化合 物 k值大。,,反相色譜中流動相選擇,水有機改善劑 常用：甲醇、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán) 極性：有機改善劑水 洗脫能力：有機改善劑水 極性順序：甲

35、醇乙腈二氧六環(huán)四氫呋喃 洗脫能力：水甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫 呋喃,反相鍵合相色譜的優(yōu)點：,流動相可選用水溶性 樣品的溶解度范圍提高 流動相可變性大 柱重現(xiàn)性好 固定相表面化學能低 平衡容易 梯度洗脫 固定相選擇多 固定相耐溶劑沖洗 熱穩(wěn)定性好,缺點：,流動相PH范圍要控制（PH28） pH太低：Si-C鍵易斷裂 pH太高：硅膠基質(zhì)易溶解 游離的硅羥殘基影響分離（封尾） P328-331,思考 烷基苯同系物分離分析 多環(huán)芳烴分離分析,出峰順序？ 如何選擇色譜條件？ 如何優(yōu)化分離？,第四章、離子交換色譜，離子對色譜,離子交換色譜： 適用于離子型物質(zhì)的分離和分析,,,4-1 離子交換色譜

36、 一.原理：用離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動相，樣品中各離子依據(jù)它們與離子交換劑的交換能力大小來進行分離的色譜方法。,原理：流動相(溶質(zhì)離子)+離子交換劑(反離子), 平衡時，平衡常數(shù)為,控制k可以改變流動相的離子強度注：只有當溶質(zhì)呈離子狀態(tài)時，才能在離子 交換柱上有保留(流動相p和溶質(zhì)都是很重要的參數(shù)),二、離子交換劑 陽離子交換劑帶負電荷官能團 -SO3-(磺酸型）、 -COO-(羧酸型） 陰離子交換劑帶正電荷官能團 NH3（氨基型）、NR3（季胺型）,常見：硅膠為基體的鍵合相離子交換劑 例,pH對交換容量的影響：,強酸、強堿性離子交換劑，交換性能不受

37、pH影響，交換容量恒定。 弱酸性陽離子交換劑，在較高pH條件下 弱堿性陰離子交換劑，在較低pH條件下 發(fā)生離子交換 pH與交換容量關系圖,三、離子交換色譜的影響因素,流動相PH的影響 例：弱酸 ：HAH++A- PHA- 交換能力tR PHA- 交換能力tR 弱堿：-NH2+H+-NH3+ PHNH3+ 交換能力tR PHNH3+ 交換能力tR 對分離不同PKa的酸堿是個有利因素 例,流動相中反離子的 形式和濃度 交換平衡常數(shù)KB/A： 反映了溶質(zhì)和交換劑的親和力大小 親合力影響因素： a.電荷數(shù)親合力 b.離子的水合體積親合力 c. 離子極化率親合力,對磺酸型陽離子交換樹脂，

38、一價陽離子的洗脫強度順序： Cs+Rb+ K+NH4+ Na+H+ Li+ 二價陽離子的洗脫強度順序： Ba2+Pb2+ Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+ 對季胺型陰離子交換樹脂，陰離子的洗脫強度順序： ClO4- I- HSO4- SCN- NO3- Br- NO2- CN- Cl- BrO3- OH- HCO3- H2PO4- IO3- CH3COO- F- 注：調(diào)節(jié)離子強度常用Na2SO4、NaNO3, 不采用NaCI 增加離子強度類似于增加洗脫強度,三者相互作用力關系： .溶質(zhì)對R+的親合力交換能力 tR .流動相離子對R+親合力 洗脫能力 tR 有機溶劑影響 有機溶劑溶劑

39、強度 洗脫能力 k P335337,作業(yè)：,思考題： 21、4651、59、60,四.離子抑制法,定義在反相色譜中，通過調(diào)節(jié)流動相pH 值，抑制組分解離，增加其在固定相上 的保留，以達到分離的目的。,分離對象：弱酸、弱堿性物質(zhì) k影響因素：與流動相pH值有關 弱酸 HA: pHHA 疏水締合tRk pHHA 疏水締合tRk 弱堿A: pHHA+ tR k pHHA+ tR k pH- k關系曲線圖 但對強酸，強堿不適合。為什么？,4-2 離子對色譜 P333335,定義-將一種與溶質(zhì)離子電荷相反的離子(反離子)，加 到流動相中與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對，能 夠在兩相之

40、間進行分配。 反相離子對色譜： 非極性的疏水固定相(C18柱)，含有反離子Y+的甲醇-水或 乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性離子對X-Y+。 X+水相 + Y-水相 = X+Y-有機相,基本原理：,X+水相 + Y-水相 = X+ Y-有機相 形成的離子對化合物X+Y-，在兩相間進行分配 平衡常數(shù)：,溶質(zhì)的容量因子k為：,容量因子隨KXY和Y-水相的增大而延長，而KXY取決于反離子和固定相的性質(zhì)，則控制流動相中加入的反離子特性和濃度可以調(diào)節(jié)組分保留時間，達到提高色譜分離選擇性的目的。,常見：固定相：化學鍵合相 流動相：緩沖溶液（含反離子) 有機改善劑

41、 離子對試劑:,陰離子分離：常用烷基銨類（十六烷 基三甲胺、四丁基胺） 陽離子分離：常用烷基磺酸鹽(己烷磺 酸鈉、高氯酸鹽)。,四、影響反相離子對色譜分離選擇性因素,1.溶劑極性的影響 極性有機溶劑比例洗脫強度k 2.離子強度的影響 水溶液中離子強度 洗脫能力 k 3.PH值的影響 弱酸：PH值接近7組分完全電離最易形成 離子對k最大 PHX-HX 固定相中離子對減少k 一般：PH=27.4 PH8 硅膠溶解,,4.離子對試劑性質(zhì)和濃度的影響 離子對試劑烷基鏈疏水性締合物 k 無機鹽離子對試劑疏水性減少締合物k 離子對試劑濃度：10-410-2mol/L 5.溫度的影

42、響 流動相粘度大, 溫度柱效,思考: 1.反相離子對色譜中，那些因素影響組分的保留？如何影響？ 2.離子交換色譜中，溶質(zhì)、固定相、流動相三者間具有怎樣的關系？它們是如何影響組分的保留的？,第五章: 體積排阻色譜法 (凝膠色譜法),根據(jù)化合物分子大小和形狀差別進行分離的方法 分離對象: 高分子化合物、生物大分子樣 品、蛋白質(zhì)樣品。 固定相：凝膠(具有一定大小孔徑分布),原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快； 凝膠色譜的校正曲線 MV關系曲線 (分子量越小，滲透越深，洗脫體積越大）,凝膠色

43、譜特點：,a.樣品峰全部在溶劑的保留時間前洗脫 b.柱內(nèi)的峰擴展較小 c.峰較窄，有利于檢測 d.采用示差檢測器 不足：a.峰容量小 b.不能分離大小相似、分子量接近 的組分,固定相,（1）半剛性凝膠 高交聯(lián)度的聚苯乙烯，孔徑范圍較寬。常以有機溶劑作流動相。 孔徑10nm 分子量103 孔徑10200nm 分子量50107 （2）剛性凝膠 多孔硅膠，它既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作，但易拖尾。,凝膠的選擇:,滲透極限可以分離的最高分子量 （與孔徑有關: 孔徑大，滲透極限大） 分離范圍校正曲線的線性部分 不同凝膠有不同的滲透極限和分離范圍,移動

44、相選擇 P321326, 339 341,a.能溶解樣品 b.不應造成填料太大的溶脹或收縮 c.控制PH和離子強度，可消除非排除機理的影響 （離子強度0.050.1 常用磷酸鹽或硫酸鹽 PH接近中性為宜） d.盡量降低溶劑粘度（加電介質(zhì)） e.選擇與樣品折射率差別大的溶劑，提高靈敏度 樣品濃度：0.010.5% 常用：甲苯、苯、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、四氫呋 喃、水溶液,色譜分離方法的選擇,要正確地選擇色譜分離方法，必須做到 了解樣品的有關性質(zhì). 熟悉各種色譜方法的主要特點及其應用范圍。 選擇色譜分離方法的主要依據(jù)： 樣品的分子量的大小， 在水中和有機溶劑中的溶解度，極

45、性和穩(wěn)定程 度 化學結(jié)構等物理、化學性質(zhì)。,一、分子量 對于分子量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進行分析。 分子量在2002000的化合物，可用液固吸附、鍵合相色譜和離子交換色譜法。 分子量高于2000，則可用排阻色譜法。,二、溶解度 水溶性樣品最好用離子交換色譜法和離子對色譜法； 微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法； 油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。,三、化學結(jié)構 若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，可首先考慮用離子交換色譜。 異構體的分離可用液固色譜法； 同系物可用反相鍵合相

46、色譜法； 對于高分子聚合物，可用體積排阻色譜法,小結(jié):,a.已知結(jié)構試樣查閱文獻資料以其他色譜分離技術作參考 b.分子量較大（M2000）蛋白質(zhì)、高聚物凝膠色譜法 c.分子量較?。?M2000）試樣多種溶劑中溶解度情況決定分離類型、填料、流動相 由于試樣組分的復雜性，還需對試樣的來源、性質(zhì)等作詳細了解，以作選擇參考。,分離類型選擇,,應用 目前已普及于幾乎所有重要的分析學科領域和許多科研生產(chǎn)部門，高效液相色譜能較理想地分離和分析與生物醫(yī)學有關的大分子和離子型物質(zhì)，各種高分子化合物和不穩(wěn)定化合物。,例如：蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖、顏料極性類脂肪化合物、藥物、染料、表面活性劑、農(nóng)藥、甾族化合

47、物、多環(huán)芳烴、合成聚合物、瞟吟、維生素、除銹劑、防老劑等等。,,農(nóng)藥的分析,作業(yè):,思考題: 54，55，56，57，58,第六章、實驗技術和輔助實驗技術,61 定性和定量分析 一、定性分析 利用保留值定性 a.與標準物對照 b.將標準物加入樣品中 c.二極管陣列檢測器 聯(lián)機定性 收集洗脫液后定性分析,二、定量分析,標準曲線法（外標法） 是一種簡便、快速的絕對定量方法。 步驟： 用標準樣品配制成不同濃度的標準系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，準確進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準工作曲線。 特點： 適用于大量分析色譜條件完全相同,歸一化法（所有組分都出峰,并在

48、檢測器上都 有信號） 內(nèi)標法（選取合適內(nèi)標物.準確度,精密度較 好） 標準加入法（加入標準樣品，利用加入 前后峰面積變化計算）,三、影響定量分析結(jié)果準確度因素,樣品制備 a. 樣品溶劑與洗脫液互溶性好 b. 將干擾組分盡可能分離 c.含量低時必須富集 回收率試驗：標準物加入到已知含量被測樣 品中用制備樣品同樣方法處理定量 測定，得回收率。 回收率（測定值樣品值）/加入量 目的：檢驗被測組分在制備中是否100%定量 轉(zhuǎn)化,儲存條件：低溫、干燥、避光 樣品制備方法：a.溶解（超聲波、離心） b.濃縮 c. 萃取 d.預分離 e.衍生化 進樣技術 影響因素：a.進

49、樣裝置的準確度和精度 b.分析人員對進樣技術的熟練程度 進樣六通進樣閥（定量進樣管34倍）,檢測器特性 穩(wěn)定性和線性范圍直接影響定量準確性 a.被測組分濃度和響應值呈線性關系 b.進樣量不能超出線性范圍 注：定量分析不宜采用梯度洗脫（基 線易漂移）,62 HPLC實驗技術,一、色譜柱的保養(yǎng) 新柱要作凈化處理 平時使用： a.正式進樣前，先用流動相沖平衡 b.一種流動相換另一種時，需互溶 柱的儲存： 儲存于相對惰性溶劑中（反相柱用甲醇） 對復雜樣品或易污染樣品，應裝預柱 實驗結(jié)束時，當洗脫液用緩沖液，應先水沖柱甲醇保護,二、流動相的處理,流動相的脫氣 原因：a.高柱壓下流動相中空氣，會在

50、柱 的洗脫 液流中形成氣泡，干擾檢測器信號。 b.除去氧（氧易與固定相、流動相反應， 不利于柱 穩(wěn)定） 脫氣方法：a.真空脫氣法 b.惰性氣體吹脫法 c.超聲波脫氣法,,流動相的純化 a.將溶劑通過干燥的多孔硅膠漏斗（0.45) b.在進樣器之前設置預柱，將雜質(zhì)吸附掉 流動相配制 a.先配制再脫氣，或先脫氣再配制 b.對含量少的溶劑必須用移液管精確量取 c.如用緩沖液，濃度應盡量低些 （0.0010.01mol/L）,三、樣品的預處理,目的：除去微粒 減少干擾雜質(zhì) 微量組分濃縮 改善分離效果 儀器和色譜柱得到保護 對樣品預處理，達到以下要求：

51、 樣品全部轉(zhuǎn)化為溶液 溶液濃度低 溶劑洗脫強度低于流動相，與流動相相溶,預處理常用方法,萃取法 水溶液試樣被分析物質(zhì)用有機溶劑萃取 常用：CHCl3、CH2Cl2、正己烷、二乙醚、 苯、乙酸乙酯 脂溶性非離子型化合物雜質(zhì)形成鹽萃取到 水相 吸附法:a.薄層吸附： 吸附劑硅膠、氧化鋁 b.預柱吸附：(被分析物吸附到柱上） 膜過濾法：去除蛋白質(zhì) 衍生化法：,63 HPLC輔助實驗技術,一、化學衍生化技術 柱前衍生化被測組分通過衍生化反應，生成衍生化產(chǎn)物，然后通過色譜柱進行分離、測定。 優(yōu)點：不受反應條件限制、允許較長反應時 間、試劑過量易除去 缺點：反應后易產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物，給分

52、 離帶來困難,,柱后衍生化樣品先通過色譜柱流出的組分分別與衍生化試劑反應，衍生化產(chǎn)物進入檢測器 優(yōu)點：可自動連續(xù)進行、操作簡便，不會 因衍生化反應給色譜分離帶來困難 缺點：儀器結(jié)構復雜、要求反應時間短， 重現(xiàn)性好、柱后死體積大 無論柱前、柱后，都要求： a.反應定量進行 b.副反應和過量試劑不影響檢測,二、柱切換技術,應用范圍：分離分析極性范圍很寬的多組 分樣品，可用梯度洗脫代替。 該技術: 樣品富集、純化、制備、切割 柱切換閥要求： a.能承受無數(shù)次切換循環(huán) b.死體積小 c.閥材料無吸附性、耐腐蝕,三、制備色譜,分析色譜在樣品分離基礎上， 作定性、定量分析 （進樣量小） 制備色譜在分離基礎上，獲得 純物質(zhì)（進樣量大）,液相制備色譜儀,遇到的典型問題,獲得最大制備量的途徑,微量和痕量組分的分離制備,再循環(huán)技術將含有重疊峰的組分洗脫液從檢測器出口泵色譜柱，進行第二、三次分離，能得到良好分離效果對儀器要求：制備數(shù)mg以下分析色譜儀，3mg為最大進樣量制備數(shù)十mg制備型色譜儀，內(nèi)徑：23.4mm、流量10ml/min樣品濃度：a.制備色譜：0.110% b.分析色譜：0.050.5,