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1、免疫分析技術之ELISA,廣東省功能蛋白質(zhì)組學重點實驗室 王 娟,免疫學檢測技術,細胞水平,分子水平,基因水平,,,,體外（或體內(nèi)）測定各類細胞及其亞群的數(shù)量和效應，從而了解機體的細胞免疫水平,測定各類免疫球蛋白、補體、細胞因子及其受體、黏附分子的表達水平和生物活性，從而了解機體免疫因子間的相互關系,測定免疫應答相關基因的表達與調(diào)控、免疫分子的遺傳多態(tài)性及基因型別分析,ELISA 概念,酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）， 是在免疫酶技術(immunoenzymatic techniques) 上發(fā)展起來的一種新型免疫測定技術，

2、基礎是：抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，由此進行定性或定量分析。,酶免疫測定類型,這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定，簡稱ELISA。,1.1抗原抗體反應,1.1.1可逆性,抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應式為： Ag+AbAgAb 抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=AgAbAgAb ，AgAb的解離程度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均

3、能保持原有的結構和活性。,1.1.2特異性,抗原抗體的結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合位點之間?；瘜W結構和空間構型互補關系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。,,1.1.3敏感性,化學比色法的敏感度為mg/ml水平 酶反應測定法的敏感度約為5-10g/ml 免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿 標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。,1.2免疫測定在臨床檢驗中的應用 由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此

4、免疫測定的應用范圍極廣。,基本原理,使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析。 由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定

5、方法達到很高的敏感度。,2ELISA的類型,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑： （1）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）； （2）酶標記的抗原或抗體，稱為結合物（conjugate）； （3）酶反應的底物。 可設計出各種不同類型的檢測方法。,2.1雙抗體夾心法測抗原,A. 將抗體吸附于固相表面； B. 加抗原，形成抗原-抗體復合物； C. 加酶標抗體； D. 加底物。底物的降解量抗原量。,此法適用于檢測各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備

6、酶結合物而建立此法。,2.2 雙抗原夾心法測抗體,用特異性抗原進行包被和制備酶結合物。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。,2.3 間接法測抗體,傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。,A. 將抗原吸附于固相載體表面； B. 加抗體, 形成抗原-抗體復合物; C. 加酶標抗體； D. 加底物。 測定底物的降解量抗體量,2.4 競爭法測抗體,當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，

7、可用此法檢測特異性抗體。,2.5 競爭法測抗原,小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。,2.6 捕獲包被法測抗體,,,,IgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。,2.7 ABS-ELISA法,：固相支持物； ：樣品； ：特異性IgG；

8、：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ：辣根過氧化物酶HRP-酶標鏈親和素（Avidin）； ：DAB顯色液； ：顯色；,3. ELISA的試劑(A、B、C三部分),ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物 （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （2）酶標記的抗原或抗體（結合物）； （3）酶的底物； （4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品； （5）結合物及標本的稀釋液； （6）洗滌液； （7）酶反應終止液,ELISA的試劑準備A,固相載體 聚苯乙烯，具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。 聚氯乙烯，聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的

9、吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。,3.1.2 包被的方式,,將抗原或抗體固定的過程稱為包被(coating)。 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。,不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕

10、獲包被法。 親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。 脂類物質(zhì)無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。,天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。 合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。,3.1.3 包被用抗原,3.1.4 包被用抗體,IgG對聚苯乙烯有強

11、吸附力，其聯(lián)結發(fā)生在Fc段上，抗體結合點暴露于外。 取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。 腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。,3.1.5 包被的條件,pH 9.6碳酸鹽緩沖液 pH 7.2的磷酸鹽緩沖液 pH 7-8的Tris-HCL緩沖液 加入包被液后，在4-8冰箱中放置過夜，37中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。,3.1.6

12、 封閉,封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封閉？,ELISA的試劑準備B,3.2 結合物,即酶標記的抗體（或抗原）是ELISA中關鍵的試劑 1 酶的催化活性 2 抗體（或抗原）的免疫活性 3 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 結合物尚要有良好的穩(wěn)定性,3.2.1 結合物用的抗原和抗體,制備結合物時所用純度較高的Ig

13、G，以免在與酶聯(lián)結時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。,,3.2.2酶,純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。 酶結合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。 在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 辣根過氧化物酶HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結

14、合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。,酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。 （1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結。有效（結合率達60%-70%）和重復性好。 交聯(lián)反應是隨機的，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。 （2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結合。簡便有效.,3.2.3 結合物的制備,結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因此制備的酶結合

15、物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。 制得結合物，最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。,酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉）。,3.2.4 結合物的保存,用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐溫20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，

16、使用時不需再行稀釋，在4-8保存期可達6個月。,3.2.5 結合物的稀釋,試劑準備 C 酶的底物,3.3 酶的底物,3.3.1 HRP的底物,OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。,TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液。酶反應終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。 ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。 HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物

17、(urea peroxide)。,AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。,4 對照設定,陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。 陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較

18、，可以估計標本物質(zhì)的量。,參考標準品 定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。,陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。,5 標本的采取和保存,體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。 以血清標本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應用。 血清標本應避免溶血：紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中，可能會增加非特異性

19、顯色。,加樣 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。,基本操作注意事項,保溫 抗原抗體完成反應的保溫過程稱為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育？ 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度。,洗滌 洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。 ELSIA洗滌：達到分離游離的和結合的酶標

20、記物的目的。 清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。 可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。 洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：,（1）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。 （2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結合

21、是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。,顯色,顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。 TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。,比色,拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。 以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底

22、物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。 結果以光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。,酶標比色儀,酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀ELISA光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測

23、范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為1%，重復性達0.5%。 操作時室溫宜在15-30，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。 各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。,6 結果判斷,6.1 定性測定 定性測定的結果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。

24、 在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應的結果判斷方法不同，分述于下。,A.陽性判定值： （cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)(0.05)，以此作為判斷結果陽性或陰性的標準。 B.標本/陰性對照比值：在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值,。,間接法和夾心法,（2）競爭法,因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。 a. 陽性判定值法 陰性判定值=0.4NCX+0.

25、6PCX 陽性 A陽性判定值 陰性 A陽性判定值 b. 抑制率法 抑制率（%）= （陰性對照A值-標本A值）100%/陰性對照 陽性 抑制率50%為 陰性 50%,4.7.2 定量測定,ELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。 測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。,4. ELISA的操作要點,嚴謹?shù)脑O計，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確

26、的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。 嚴格遵照規(guī)定操作，必能得出準確的結果。,,,免疫分析技術之 液相芯片技術及應用,廣東省功能蛋白質(zhì)組重點實驗室 王 娟,,,liquichip 液相芯片系統(tǒng)___,液相芯片系統(tǒng)有機地整和了有色微球（color-coded microsphere or bead）、激光技術、流體學、最新的高速數(shù)字信號處理器和計算機運算法則，造就了Luminex 100無與倫比的檢測特異性和靈敏度。,Benefits,Applications,Future,Technology,Principle,Most bioassays consist of two or mor

27、e biomolecules interacting,Principle,Using LiquiChip-Technology these biological interactions take place on small, microscopical beads these beads are fluorescent (red ),Principle,Detection and Quantitation of these biological interactions is made by fluorescent detection reagents,Beads 球形基質(zhì),Capture

28、 molecule 探針分子,Analyte 待檢測物,Reporter molecule 報告分子,,,,Assays on Uniform Polystyrene(聚苯乙烯) Beads,Diameter 5.6 m,Two internal Dyes for Bead Classification,,,Defined Mixture Dying in Shrinking in of both Dyes Organic Solvent Aqueous Solvent,Two-Color Bead-Coding,Based on xMAP technology By using 10

29、different levels of each of two fluorescent dyes, an array of 100 beads, each with a unique color signature, is created,為了便于探針分子的固定，在球形基質(zhì)的表面進行了一系列的修飾，可適合各種蛋白，肽，核酸等生物分子的固定,“Liquid Array” Technology,Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single we

30、ll,“Liquid Array” Technology,Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well,“Liquid Array” Technology,Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well,反應主要包括3個步驟,探針分子的固定 將這種標記好探針的球形基質(zhì)與

31、樣品反應。探針可以與相應的目的分子特異性的結合，帶有綠色報告熒光的報告分子與目的分子特異性的結合，對反應進行定量 反應結果的檢測,LiquiChip Workstation,Flow cytometer-based technology Measures fluorescence Components: Reader Microplate Handler Fluid Module,Flow Cytometer based Analysis,Beads are aligned in a single file stream by hydrodynamic focusing Two lasers

32、are used for excitation of fluorescence,Principle of Detection,The red laser is used to identify the bead code The green laser is used to identify the reporter signal,利用這100種球形基質(zhì)，可以標記上100種不同的探針分子，同時對一個樣本中的100種不同的目的分子進行檢測。,,A,F,H,E,B,G,C,D,,Benefits,系統(tǒng)的優(yōu)點,靈活性好，可適用于各種蛋白質(zhì)分析，可以接受實驗室已有的實驗方案，使用者可以自行設計分析方案

33、，也可使用成套試劑盒 通量大，可對同一樣本中的多種不同目的分子同時進行分析；在35-60分鐘內(nèi)可對96個不同樣本進行檢測 液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構象，也更有利于探針和被檢測物的反應 靈敏度高，信噪比好，只需要微量的樣品即可進行檢測 操作簡便，耗時短，成本低,,,,Liquichip和ELISA靈敏度的比較分別用ELISA和liquichip 對硫氧還蛋白進行定量測定得到的標準曲線I：使用liquichip測定得到的標準曲線II、III：使用ELISA測定得到的標準曲線,,,,Compared to ELISA:,樣本需求量小: EL ISA 每次實驗均至少需要100200l 外周血，

34、而采用液相芯片只需50l 血液即可在一支試管中完成所有檢測項目,總體可節(jié)約80 %以上的樣本，這對外周血極難提取的早產(chǎn)新生兒尤有意義; 操作流程簡化:由于EL ISA 工作曲線的置信區(qū)間僅23 對數(shù)級，因而對于較高濃度的細胞因子的檢測,其樣本必須經(jīng)不同程度的稀釋以滿足實驗精確度，而液相芯片采用熒光分析，其置信區(qū)間可達45 對數(shù)級，活性范圍可10 倍于EL ISA ,從而省略了繁瑣的稀釋和洗滌步驟; 高效性:液相懸浮狀態(tài)下更有利于蛋白質(zhì)間的空間結合，其結合效率大大高于EL ISA 固相沉底。,Measuring the level of many human or mouse cytokines

35、 in a single sample,Ready-to-use Broad-Range Kinase kits for measuring kinase activity,Ser/Thr Kinase, Tyr Kinase Kit Kinase/Phosphorylated Protein,no washing steps faster higher throughput quantitative assay results no hazardous gels / radioactivity Sensitivity: higher than ECL/colorimetric assays,

36、 comparable to or better than radioactive assays,Advantages compared to Western blot procedures,Applications,When to use the LiquiChip System?,The LiquiChip System is used for a large variety of protein assays: Immunoassays Enzyme Assays Protein-protein interaction Assays Receptor ligand Assays Prot

37、ein nucleic acid assays,Assay Types,Immunoassays,Enzyme assays (kinase, protease),DNA-hybridization assays,Interaction assays,Realize the Power of Suspension Arrays,Assay system that offers: multiplexing of assays up to a factor of 100 a mix-and-measure procedures (no washing) suspension enzyme assa

38、ys (kinase, phosphatase and protease assays),,,A utoimmune,ASCA Human beta-2 Microglobulin Human Mouse Centromere B Human Chromatin Human ENA Profile 4 (SSA, SSB, Sm, RNP) Human ENA Profile 5 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70) Human ENA Profile 6 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1) Human Histone Human Histon

39、e H1 Human Histone H2A Human Histone H2B Human Histone H3 Human Histone H4 Human HSP-27 pS82 General HSP-27 Total General HSP-32 Human HSP-65 Human HSP-71 Human HSP-90 a Human,HSP-90 b Human Jo-1 Human PCNA Human Mouse PR3 Human PR3 (cANCA) Mouse Ribosomal P Human Mouse RNP Human Mouse RNP-A Human R

40、NP-C Human SCF Human Mouse Scl-70 Human Mouse Serum Amyloid P Human SLE Profile 8 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribosome-P, chromatin) Human Sm General Human Smith Mouse Human SSA Human Mouse SSB Human Mouse Streptolysin O Human TPO Human Mouse,Allergy Testing,Alternaria (Mold) Human Bermuda Gra

41、ss Human Cat Dander Human Egg White Human Milk Human Mite Pternoyssinus Human Mountain Cedar Human Short Ragweed Human Timothy Grass Human Wheat (food) Human,Cancer Markers,alpha Fetoprotein Human Cancer Antigen 125 Human Carcinoembryonic Antigen Human PSA, Free Human,Cardiac Markers,Creatine Kinase

42、-MB Human Endothelin-1 Mouse PAP Human SGOT Human Mouse TIMP-1 Human Mouse,Cytokines,BDNF Human CREB pS133 General CREB Total General DR-5 Human EGF Human Mouse ENA-78 Human Eotaxin Mouse Human Fatty Acid Binding Protein Human FGF-basic Human Mouse G-CSF Human Mouse GCP-2 Mouse GM-CSF Human Mouse Ra

43、t GRO-KC Rat HGF Human Mouse ICAM-1 Human IFN-alpha Human IFN-gamma Human Mouse Rat IL-10 Human Mouse Rat IL-11 Mouse IL-12 Human Mouse IL-12 p40 Human Mouse IL-12 p40/p70 Mouse Rat IL-12 p70 Human Mouse Rat IL-13 Human Mouse IL-15 Human Mouse IL-16 Human IL-17 Human Mouse,IL-18 Rat IL-1alpha Mouse

44、Human Rat IL-1beta Human Mouse Rat IL-1ra Human IL-1ra/IL-1F3 Human IL-2 Human Mouse Rat IL-3 Human Mouse IL-4 Human Mouse Rat IL-5 Human Mouse IL-6 Human Mouse Rat IL-7 Human Mouse IL-8 Human IL-9 Mouse IP-10 Human Mouse JE/MCP-1 Mouse KC Mouse KC/GROa Mouse LIF Mouse Lymphotacin Human Mouse M-CSF

45、Mouse MCP-1 Human Mouse Rat MCP-1(MCAF) Human MCP-3 Mouse MCP-5 Mouse MDC Human Mouse,MIG Human Mouse MIP-1 alpha Human Mouse MIP-1 beta Human Mouse MIP-1 gamma Mouse MIP-2 Mouse MIP-3 beta Mouse OSM Mouse PDGF-BB Mouse RANTES Human Mouse Rb (pT821) Human Rb (total) Human Rb pSpT249/252 Human Tau (p

46、S214) Human Tau (pS396) Human Tau (total) Human Tissue Factor Human Mouse TNF-alpha Human Mouse Rat TNF-beta Human TNF-RI Human TNF-RII Human VCAM-1 Mouse VEGF Human Mouse,Endocrine,Adiponectin Human Rat Amylin Mouse Rat Human C-Peptide Human Calcitonin Human CRF Human FGF-9 Mouse GLP-1 Human Mouse

47、Rat Glucagon Mouse Rat Human Growth Hormone Human Mouse Insulin Human Mouse Rat Leptin Human Mouse Rat Lipoprotein (a) Human Resistin Human Mouse Rat T3 Human T4 Human TBG Human Thyroglobulin Human TSH Human,Genotyping,FlexMAP General Mitochondrial DNA Screening General Tag-It Mutation Detection Kit

48、 General Y-SNP Identification General,Infectious disease,Adenovirus Human Mouse Bordetella pertussis Human Campylobacter jejuni Human Chlamydia pneumoniae Human Chlamydia trachomatis Human Cholera Toxin Human Cholera Toxin b Human Clostridium piliforme (Tyzzers) Mouse Cytomegalovirus Human Mouse Dip

49、htheria Toxin Human Ectromelia virus Mouse EDIM (Epidemic diarrhea of infant mice) Mouse Encephalitozoon cuniculi Mouse Epstein-Barr EA Human Epstein-Barr NA Human Epstein-Barr VCA Human HBV Core Human HBV Envelope Human HBV Surface (Ad) Human HBV Surface (Ay) Human HCV Core Human HCV NS3 Human HCV

50、NS4 Human HCV NS5 Human Helicobacter pylori Human Hepatitis A Human Hepatitis D Human,HIV-1 gp41 Human HIV-1 p24 Human HPV Human HSV-1 gD Human HSV-1/2 Human HSV-2 gG Human HTLV-1/2 Human Influenza A Human Influenza A H3N2 Human Influenza B Human Leishmania donovani Human Lyme disease Human Lymphocy

51、tic choriomeningitis virus Mouse M. pneumoniae Human M. tuberculosis Human Minute virus Mouse Mumps Human Mycoplasma pulmonis Mouse Parainfluenza 1 Human Parainfluenza 2 Human Parainfluenza 3 Human,Parvovirus Mouse Pneumonia virus of mice Mouse Polio Virus Human Polyoma virus Mouse Reovirus-3 Mouse

52、RSV Human Rubella Human Rubeola Human Sendai virus Mouse T.cruzi Human T.pallidum 15kd Human T.pallidum p47 Human Tetanus Toxin Human Theilers mouse encephalomyelitis virus Mouse Toxoplasma Human Varicella zoster Human HEV orf2 3KD Human HEV orf2 6KD Human HEV orf3 3KD Human HIV-1 gp120 Human,Isotyp

53、ing,IgA Human Mouse IgE Human Mouse IgG1 Mouse IgG2alpha Mouse IgG2beta Mouse IgG3 Mouse IgM Human Mouse light chain (kappa or gamma) Mouse,Kinase/Phosphorylated Protein,Akt General Akt/PKB (total) General Akt/PKBpS473 General ATF2 (Thr71) General Erk-2 General Erk1 (Thr202/Tyr204) General Erk1/Erk2

54、 (Thr202/Tyr204) General Erk2 (Thr202/Tyr204) General GSK-3beta General IkappaB-alpha pS32 General IkappaB-alpha Total General JNK (pTpY183/185) General JNK Total General JNKp (Thr183/Y182) General,MAPKAP K2 General p38 (total) General p38 MAPK pT180/pY182 General p53 (total) General p53 pS15 Genera

55、l PKB-alpha General PKC General SAPK1 General SAPK1a/JNK2 General SAPK4 General STAT1 pY701 General STAT1 Total General STAT3 (Tyr705) General ZAP-70 General,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0,4000,8000,12000,16000,20000,,Control,,LPS,IP-10,KC,MCP-1,MIG,MIP-1,GM-CSF,IFN-,IL-10,IL-12,IL-1,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,TNF-,圖1. BALB/c小鼠內(nèi)毒素休克后3 h肝臟組織中細胞因子的表達譜改變,MFI,1/2,Future,Spectral - not Spatial Separation,Questions?,