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1、第二章,,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,Structure and Function of Protein,蛋白質(zhì)的分子組成,1,蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化,2,3,4,,protein ？,,含量大,分布廣,種類多,功能繁雜,蛋白質(zhì)的重要性,1,,2,,3,,4,蛋白質(zhì)的生物活性,,催化作用,,調(diào)節(jié)作用,,免疫作用,,載體作用,,凝血作用,,收縮作用,,緩沖作用,,其它作用,第一節(jié),蛋白質(zhì)的分子組成,組成蛋白質(zhì)的元素,C、H、O、N和S,主要,少量,磷、鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬、碘,蛋白質(zhì)的含氮量平均為16,100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 ( g % ) = 每

2、克樣品含氮克數(shù) 6.25100,1/16%,一 氨基酸（amino acid）,氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位,自然界,300余種,人體,僅20種,除G外,均屬L--AA,,,NH2,H,R,COOH,C,,,,,（一）氨基酸的一般結(jié)構(gòu),,中心 碳原子,,羧基,,氨基,,氫原子,,側(cè)鏈,L-AA,D-AA,蛋白質(zhì)中為L(zhǎng)-AA,,,,（二）氨基酸的分類,非極性疏水性氨基酸,1,2,3,4,極性中性氨基酸,酸性氨基酸,堿性氨基酸,非極性疏水性氨基酸,極性中性氨基酸,堿性氨基酸,酸性氨基酸,,胱氨酸,,半胱氨酸,記憶口訣,,甘、丙、纈、亮、異，三、四碳烴基,丙、丁羥絲、蘇，（半）胱、蛋含有硫,酸有天冬

3、、谷，堿有精、賴、組,苯、酪、色、脯環(huán)，中性天、谷胺,要點(diǎn),,編碼AA 20種,除G外均為L(zhǎng)-型,P為環(huán)狀亞AA,含羥基AA：S、T、Y,含硫AA：C、M,芳香AA：F、Y、W,支鏈AA：V、L、I,酸性AA：D、E,堿性AA：R、K、H,（二）氨基酸的理化性質(zhì),1. 兩性解離及等電點(diǎn),解離程度取決于所處溶液的酸堿度,氨基酸是兩性電解質(zhì),等電點(diǎn)(isoelectric point, pI),,在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽(yáng)離子和陰離子的趨勢(shì)及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時(shí)溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。,,,,,,,,pH=pI,pHpI,pH

4、.紫外吸收,色氨酸、酪氨酸 最大吸收峰 280 nm,3.茚三酮反應(yīng),,在氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍(lán)紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。,氨基酸定量分析方法,二 肽（peptide）,肽 氨基酸通過(guò)肽鍵縮合而成的化合物,肽鍵(peptide bond) 一個(gè)氨基酸的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵。,,+,,,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,二肽 兩分子氨基酸,三肽 三分子氨基酸,寡肽(oligopeptide) 十個(gè)以內(nèi)氨基酸,多肽(polypeptide) 多個(gè)氨基酸,多肽鏈(polypeptide chain) 許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu),氨基酸殘基(r

5、esidue) 肽鏈中的氨基酸分子因?yàn)槊撍s合而基團(tuán)不全,氨基末端（N末端） 自由氨基的一端 羧基末端（C末端） 自由羧基的一端,多肽鏈有兩端,絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸 (ser-gly-tyr-ala-leu),肽單元（peptide unit）,,肽鍵中4個(gè)原子C、O、N、H和與之相鄰的 C1、 C2位于同一平面,,,肽鍵(C-N)具有部分雙鍵的性質(zhì),,天然存在的活性肽,,谷胱甘肽(glutathione, GSH),肽類激素及神經(jīng)肽,抗生素肽,,谷胱甘肽(glutathione, GSH),,還原劑,清除H2O2,結(jié)合有害物質(zhì),GSH生物活性,,GSH過(guò)氧化物酶,GSH還原

6、酶,NADPH+H+,NADP+,肽類激素,,促甲狀腺素釋放激素 (TRH),,第二節(jié),蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次圖,,分子結(jié)構(gòu),一級(jí)結(jié)構(gòu) （基本結(jié)構(gòu)）,高級(jí)結(jié)構(gòu) （空間結(jié)構(gòu)）,三級(jí)結(jié)構(gòu),四級(jí)結(jié)構(gòu),,,,-螺旋,-折疊,-轉(zhuǎn)角,不規(guī)則卷曲,二級(jí)結(jié)構(gòu),,蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) (primary structure),肽鏈中氨基酸的數(shù)目及排列順序 包括二硫鍵的數(shù)目和位置,定義,主要化學(xué)鍵,肽鍵 有些蛋白質(zhì)有二硫鍵,,牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu),,蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) (secondary structure),肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置 不涉及氨基殘基側(cè)鏈的構(gòu)象,定義,主要化學(xué)鍵,氫鍵,,-折疊,-轉(zhuǎn)

7、角,無(wú)規(guī)卷曲,-螺旋,蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式,,-螺旋,,要點(diǎn),,1,一圈3.6個(gè)氨基酸殘基，螺距0.54nm,2,螺旋穩(wěn)定靠氫鍵，與螺旋長(zhǎng)軸平行,呈右手螺旋,側(cè)鏈影響螺旋的形成和穩(wěn)定,3,4,,-折疊(反平行),,-折疊(平行),要點(diǎn),,1,順向平行和反向平行兩種構(gòu)象,2,呈伸展、鋸齒狀結(jié)構(gòu),折疊的穩(wěn)定靠氫鍵,3,4,側(cè)鏈影響折疊的形成和穩(wěn)定,,-轉(zhuǎn)角,,超二級(jí)結(jié)構(gòu)（模體motif）,多肽鏈內(nèi)順序上相互鄰近的二級(jí)結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)聚集體,,鈣結(jié)合蛋白,鋅指結(jié)構(gòu),,蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) (tertiary structure),整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相

8、對(duì)空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的整體排布,定義,主要化學(xué)鍵是次級(jí)鍵,疏水鍵、離子鍵、氫鍵 和 Van der Waals力,,,肌紅蛋白（Mb）的三級(jí)結(jié)構(gòu),,血紅素,鐵原子,,,結(jié)構(gòu)域(domain),結(jié)構(gòu)域是是超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的一個(gè)或數(shù)個(gè)球狀或纖維狀的區(qū)域，能各行使其功能；是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位,,細(xì)胞表面蛋白CD4分子4個(gè)相似結(jié)構(gòu)域,,蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu) (quaternary structure),兩條或多條肽鏈蛋白質(zhì)的每一條具有完整三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱為亞基,亞基,化學(xué)鍵,主要 疏水作用 次要 離子鍵、氫鍵,定義,亞基的空間排布,,血紅蛋白（Hb）的四級(jí)結(jié)構(gòu),,鏈,鏈,

9、,,血紅素,,蛋白質(zhì)的分類,根據(jù)組成,,結(jié)合蛋白質(zhì),單純蛋白質(zhì),,蛋白質(zhì)部分,非蛋白質(zhì)部分,,根據(jù)形狀,,球狀蛋白質(zhì),纖維狀蛋白質(zhì),,根據(jù)功能,,調(diào)節(jié)蛋白,酶蛋白,運(yùn)輸?shù)鞍?結(jié)構(gòu)蛋白,,根據(jù)分布,,核蛋白質(zhì),膜蛋白質(zhì),第三節(jié),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu) 與功能的關(guān)系,一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ),一級(jí)結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ),一級(jí)結(jié)構(gòu)改變與分子病,,一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ),,,天然RNaseA（有活性）,天然RNaseA（有活性）,變性RNaseA（無(wú)活性）,,,8M尿素,去掉尿素,,分子伴侶(chaperon) 是一類幫助新生多肽鏈正確折疊的蛋白質(zhì),,防止肽段錯(cuò)誤聚集,使錯(cuò)誤聚集肽段正確

10、折疊,保證二硫鍵的正確形成,分子伴侶功能,,一級(jí)結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ),結(jié)構(gòu)相似，功能相似,胰島素,細(xì)胞色素c,促腎上腺皮質(zhì)激素和促黑激素,,一級(jí)結(jié)構(gòu)改變與分子病,分子病,由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病,案 例,鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血,,,,（a）正常紅細(xì)胞,（ b）鐮型紅細(xì)胞,,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu) 與功能的關(guān)系,空間結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ),,胰島素原轉(zhuǎn)變成胰島素,蛋白質(zhì)的功能依賴于特定的空間結(jié)構(gòu),胰島素原 （一條肽鏈）,胰島素 （兩條肽鏈）,C肽,,肌紅蛋白,血紅蛋白,血紅蛋白的空間構(gòu)象變化與結(jié)合,,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,,協(xié)同效應(yīng) 一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響其 中另一個(gè)

11、亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象,協(xié)同效應(yīng)(cooperativity),正協(xié)同效應(yīng)(positive cooperativity) 促進(jìn)作用,負(fù)協(xié)同效應(yīng)(negative cooperativity) 抑制作用,,,,,配體與亞基結(jié)合后引起亞基構(gòu)象變化的效應(yīng),變構(gòu)效應(yīng)(allosteric effect),蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變與疾病,,蛋白質(zhì)構(gòu)象?。╬rotein conformational diseases）,因蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或折疊導(dǎo)致構(gòu)象異常變化引起的疾病,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變與疾病,,朊病毒蛋白(prion protein, PrP),第四節(jié),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化,,蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),

12、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( isoelectric point, pI) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為pI,（一）兩性電離及等電點(diǎn),,pH=pI,pHpI,pH

13、質(zhì)的改變和生物活性的喪失。,,變性因素,變性本質(zhì),破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵 不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等,,理化性質(zhì)變化,黏度增大,溶解度降低,易被蛋白酶水解,,應(yīng)用,消毒,雞蛋要煮熟吃,疫苗保存,,蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能,蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation),,天然RNaseA（有活性）,天然RNaseA（有活性）,變性RNaseA（無(wú)活性）,,,8M尿素,去掉尿素,,蛋白質(zhì)從溶液中析出,蛋白質(zhì)沉淀,沉淀本質(zhì),破壞水化膜,中和電荷,,中性鹽,沉淀方法,有機(jī)溶劑,生物堿試劑,重金屬離子

14、,,應(yīng)用,重金屬中毒口服牛奶或生雞蛋,,變性與沉淀的關(guān)系,,變性,沉淀,,,容易,不一定,,蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中,蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation),,（四）蛋白質(zhì)的光譜吸收與呈色反應(yīng),280nm最大吸收峰 OD280 ：Y、W,蛋白質(zhì)的光譜吸收,,雙縮脲反應(yīng),蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng),酚試劑呈色反應(yīng),,蛋白質(zhì)的分離和純化,方法 鹽析 有機(jī)溶劑沉淀 調(diào)節(jié)pH 改變溫度,（一）改變蛋白質(zhì)的溶解度,,將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀,鹽析(salt precipitati

15、on),,低溫(04 0C) 快速,有機(jī)溶劑沉淀,,方法 離心 透析 超濾 凝膠過(guò)濾,（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離,,利用機(jī)械的快速旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，將不同密度的物質(zhì)分離,離心（centrifugation）,蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示,,利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法,透析(dialysis),純化蛋白質(zhì) 濃縮蛋白質(zhì),作用,,超濾,利用超濾膜在一定壓力下使大分子蛋白質(zhì)滯留，而小分子物質(zhì)和溶劑濾過(guò),,凝膠過(guò)濾（gel-filtration chromatography）,按照天然蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小

16、進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱為分子篩層析或排阻層析,,,方法 離子交換層析 電泳,（三）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)分離,,離子交換層析 （ion exchange chromatography）,利用蛋白質(zhì)兩性解離特性和等電點(diǎn)作為分離依據(jù),,,電泳(elctrophoresis）,帶點(diǎn)粒子在電場(chǎng)作用下向所帶電荷相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象,支持物的不同分為薄膜電泳、凝膠電泳,,SDS-PAGE,,SDS-PAGE 可測(cè)定蛋白質(zhì)分子量,,蛋白質(zhì)含量測(cè)定與純度鑒定,凱氏定氮法,（一）蛋白質(zhì)含量測(cè)定,紫外線吸收法,考馬斯亮藍(lán)染色法,Folin-酚試劑法,,蛋白質(zhì)純度常用某一特定成分與總蛋白之比來(lái)表示，如每毫克蛋白質(zhì)含多少活性單位,（二）蛋白質(zhì)的純度鑒定,,多肽鏈中氨基酸序列分析,測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成,測(cè)定多肽鏈的氨基末端與羧基末端,將肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析,Edman降解法測(cè)定各肽段的氨基酸排列順序,,,,比較多種水解法產(chǎn)生的肽鏈，通過(guò)組合排列對(duì)比，確定完整肽鏈中的氨基酸順序,,,Edman降解法測(cè)定氨基酸序列,,,