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1、致病菌細(xì)胞的近紅外光譜鑒別方法研究,導(dǎo) 師：劉建學(xué) 答辯人：榮宗有,立題意義,致病菌可導(dǎo)致人類疾病或危害人類健康，污染食品可引起食物中毒與食源性感染，是食品安全的重大隱患。快速檢測出食品中的致病菌是人們迫切的心愿。 本文以沙門氏菌和單增李斯特菌為代表，利用對數(shù)期的沙門氏菌、單增李斯特菌的近紅外光譜和主成分投影判別分析技術(shù)（PCA），鑒別沙門氏菌和單增李斯特菌。 此項研究有可能對致病菌和有害微生物的鑒別測定提供一種快速簡便的檢測方法。,試驗方法, 采用平板劃線分離培養(yǎng)法和選擇性培養(yǎng)基 分離純種的沙門氏菌、單增李斯特菌。 采用光電比濁法，對沙門氏菌的對數(shù)生長期進(jìn)行研究，確定沙門氏菌的對數(shù)生長期。

2、根據(jù)不同濃度梯度的沙門氏菌、單增李斯特菌的全細(xì)胞、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的近紅外光譜圖譜，利用主成分投影判別分析技術(shù)，研究兩種菌的近紅外光譜鑒別方法。,結(jié)果分析,1、沙門氏菌的分離培養(yǎng)結(jié)果 取出亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板看到呈褐色，灰色或黑色，帶有金屬光澤的菌落。并且菌落周圍的培養(yǎng)基開始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時間的延長而變?yōu)榱撕谏?，即是典型的沙門氏菌菌落。接種到營養(yǎng)瓊脂試管斜面上放在冰箱中保存，以備下一步試驗用。,2、單增李斯特菌的分離培養(yǎng)結(jié)果 取出改良的MC Bride瓊脂（MMA）平板，斜光照射，可以看出菌落為灰藍(lán)或藍(lán)色、小的圓形菌落。挑取幾個發(fā)育良好的孤立菌落接種于三糖鐵（TSI）瓊脂和SIM動力培養(yǎng)

3、基，培養(yǎng)于25的恒溫培養(yǎng)箱中，觀察到有動力，且呈傘狀或月牙狀生長的菌落。這是單增李斯特菌的典型菌落。接種到（TSAYE）試管斜面上放在冰箱中保存，以備下一步試驗用。,3、 沙門氏菌的生長曲線,、比濁法測定的吸光度值 以未接種的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作空白對照，選用600nm波長進(jìn)行測定，按編號從小到大的順序依次進(jìn)行。沙門氏菌比濁測定的吸光度（OD）值見下表,、生長曲線圖,,、從生長曲線圖，可以看出0-5h為沙門氏菌的延緩期，5-16h為對數(shù)生長期，16h以后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。符合典型細(xì)菌生長曲線四個時期的劃分。本實(shí)驗選16h為沙門氏菌的培養(yǎng)時間，進(jìn)行下一步的試驗。,4、沙門氏菌、單增李斯特菌的鑒

4、別,沙門氏菌不同濃度全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜疊加圖,,,,,單增李斯特菌不同濃度全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜疊加圖,,,, 沙門氏菌、單增李斯特菌全細(xì)胞的鑒別分析,,從圖中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙門氏菌、單增李斯特菌全細(xì)胞的差異性信息。沙門氏菌第一組分得分范圍在-0.050.03之間，第二組分得分范圍在-0.13-0.02之間；單增李斯特菌第一組分得分范圍在-0.090.04之間，第二組分得分范圍在0.010.25之間。可見兩種菌的第一主分得分范圍幾乎完全相同，而第二主分得分范圍明顯不同。 不同的細(xì)菌，其細(xì)胞的物質(zhì)組成是不一樣的。不同的物質(zhì)在經(jīng)過近紅外光照射后會在不同的波段產(chǎn)

5、生紅外特異性吸收，且有著不同的吸收譜段，因此可以通過近紅外光譜法區(qū)分開來。,沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞壁的鑒別分析,,從圖中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞壁的差異性信息。沙門氏菌第一組分得分范圍在-0.100.05之間，第二組分得分范圍在-0.020.15之間；單增李斯特菌第一組分得分范圍在0.050.28之間，第二組分得分范圍在-0.30-0.02之間。可見兩種菌的第一主分和第二主分得分范圍完全不同。 沙門氏菌為革蘭氏陰性菌，單增李斯特氏菌為革蘭氏陽性菌。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁除了肽聚糖還含有外膜，包括脂多糖、脂質(zhì)雙層、脂蛋白三部分；革蘭氏陽性菌除了肽聚糖還含有

6、大量磷壁酸。其細(xì)胞壁組分不相同，不同的物質(zhì)在經(jīng)過近紅外光照射后會在不同的波段產(chǎn)生紅外特異性吸收，且有著不同的吸收譜段，因此可以通過近紅外光譜法區(qū)分開來。,沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞質(zhì)的鑒別分析,,從圖中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞質(zhì)的差異性信息。沙門氏菌第一組分得分范圍在0.040.12之間，第二組分得分范圍在-0.22-0.10之間；單增李斯特菌第一組分得分范圍在0.020.06之間，第二組分得分范圍在-0.030.12之間。兩種菌的第一主分得分范圍有相似的地方，第二主分得分范圍明顯不同。 細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)是指被細(xì)胞膜包圍的除核區(qū)以外的一切半透明、膠體狀、顆粒狀

7、物質(zhì)的總稱，主要成分為核糖體、貯藏物、各種酶類、中間代謝物、質(zhì)粒、各種營養(yǎng)物質(zhì)和大分子的單體等。兩種不同的細(xì)菌其細(xì)胞質(zhì)組成也不同，所以可以通過近紅外光譜法區(qū)分開來 。,總結(jié),1、采用平板劃線分離培養(yǎng)法和選擇性培養(yǎng)基可將沙門氏菌、單增李斯特菌從雜菌中很好的分離開來。 2、采用比濁法對沙門氏菌的生長曲線進(jìn)行研究，并繪制生長曲線圖。研究表明：5-16h為沙門氏菌對數(shù)生長期。所以可選取培養(yǎng)16h的沙門氏菌進(jìn)行后續(xù)試驗。,3、根據(jù)不同濃度梯度的沙門氏菌、單增李斯特菌的全細(xì)胞、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的近紅外光譜，利用基于主成分分析技術(shù)的投影判別分析，可以將沙門氏菌和單增李斯特菌區(qū)分開來。 4、近紅外光譜分析技術(shù)可以用于沙門氏菌、單增李斯特菌的分類鑒別。為建立一種快速的致病菌檢測方法提供依據(jù)。,5、但是，到底是什么物質(zhì)引起近紅外光產(chǎn)生特異性吸收還不知道，尚需進(jìn)一步研究，利用近紅外光譜分析技術(shù)對更多種類致病菌的檢測技術(shù)也需要進(jìn)一步研究。,講解完畢！,O(_)O 謝謝！??！,