《分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)-第十章 生物芯片技術(shù)》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)-第十章 生物芯片技術(shù)（32頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、第十章第十章 生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)概概 述述一、一、DNA芯片技術(shù)的概念芯片技術(shù)的概念基因芯片基因芯片(Gene chip)Gene chip)技術(shù)是指通過技術(shù)是指通過微陣微陣列列(MicroarrayMicroarray)技術(shù)將高密度技術(shù)將高密度DNADNA片段片段陣列通過高速機(jī)器人或原位合成方式以陣列通過高速機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNADNA探探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測等方面研究的最新革的基因表達(dá)及監(jiān)測等

2、方面研究的最新革命性技術(shù)。命性技術(shù)。DNA Chip TechnologySolid support(glass,plastic,metal,silicon)Miniaturized array of DNA(genetic material)Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybridizationHybridized probes(DNA molecules)are fluorescently labeled通常用計算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所通常用計算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為以稱為DNA芯片芯片。DNA芯片為生物芯片的一種

3、：芯片為生物芯片的一種：生物芯片包括：生物芯片包括：DNA芯片芯片蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片其它芯片其它芯片按用途分按用途分 樣品制備芯片樣品制備芯片 生化反應(yīng)芯片生化反應(yīng)芯片 檢測芯片檢測芯片芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)最終目標(biāo)二、二、DNA芯片的主要類型芯片的主要類型按制備方式分：按制備方式分：原位合成芯片原位合成芯片：采用顯微光蝕刻等技術(shù)：采用顯微光蝕刻等技術(shù)在特定部位原位合成寡核苷酸而制備在特定部位原位合成寡核苷酸而制備的芯片。的芯片。探針較短探針較短DNA微集陣列微集陣列：將預(yù)先制備的：將預(yù)先制備的DNA片片段以顯微打印的方式有序地固化于支段以顯微打

4、印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。持物表面而制成的芯片。探針的來源探針的來源較靈活較靈活Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based assays is a function of:Probe and target DNA/RNA(Complexity)Chip surface(autofluorescence&non-spec.bkg)Attachment chemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridization efficiency

5、(lots of factors)Detection technology(signal type,efficiency,noise)第二節(jié)第二節(jié) DNA芯片技術(shù)的芯片技術(shù)的基本原理與方法基本原理與方法一、芯片的制備一、芯片的制備（一）支持物的預(yù)處理（一）支持物的預(yù)處理實(shí)性材料實(shí)性材料：硅芯片、玻片和瓷片：硅芯片、玻片和瓷片需進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、需進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基活性基團(tuán)。氨基活性基團(tuán)。膜性材料膜性材料：聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維：聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維膜膜通常包被氨基硅烷或多聚賴氨酸通常包被氨基硅烷或多聚賴氨酸（二）原位合成芯片的制備（二）原位合成芯片的制

6、備1.顯微光蝕刻技術(shù)顯微光蝕刻技術(shù)支持物表面活性基團(tuán)連接有光敏保護(hù)基團(tuán)支持物表面活性基團(tuán)連接有光敏保護(hù)基團(tuán)（X）受到保護(hù)。）受到保護(hù)。產(chǎn)率較低產(chǎn)率較低 原位合成原位合成(In Situ Synthesis)Light directed oligonucleotide synthesis.A s o l i d s u p p o r t i s derivatized with a covalent linker molecule terminated w i t h a p h o t o l a b i l e protecting group.Light is directed thro

7、ugh a mask to deprotect and activate s e l e c t e d s i t e s,a n d protected nucleotides couple to the activated sites.The process is repeated,activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.2.壓電打印法壓電打印法 壓電毛細(xì)管噴射器壓電毛細(xì)管噴射器產(chǎn)

8、率較高產(chǎn)率較高噴墨打印技術(shù)噴墨打印技術(shù)（三）（三）DNA微集陣列的制備微集陣列的制備方式方式：預(yù)先合成：預(yù)先合成DNA或制備基因探針然后或制備基因探針然后打印到芯片上打印到芯片上1.探針的制備探針的制備已克隆的基因片段已克隆的基因片段PCR，RT-PCR擴(kuò)增的基因片段擴(kuò)增的基因片段人工合成的人工合成的DNA片段片段單鏈、雙鏈、單鏈、雙鏈、DNA或或RNA 均可作為探針均可作為探針2.打印打印噴墨打?。ǚ墙佑|式點(diǎn)樣）噴墨打印（非接觸式點(diǎn)樣）優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)針式打?。ń佑|式點(diǎn)樣）針式打印（接觸式點(diǎn)樣）優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)針式打印法（接觸式點(diǎn)樣）針式打印法（接觸式點(diǎn)樣）3.探針的固化探針的固化打

9、印探針后，需要將其固定在支持物表打印探針后，需要將其固定在支持物表面，同時也要封閉支持物上未打印區(qū)面，同時也要封閉支持物上未打印區(qū)域以防止核酸樣品的非特異性固定域以防止核酸樣品的非特異性固定二、樣品的準(zhǔn)備二、樣品的準(zhǔn)備樣品的分離純化樣品的分離純化DNA,mRNA擴(kuò)增擴(kuò)增PCR,RTPCR，固相，固相PCR標(biāo)記等過程標(biāo)記等過程熒光標(biāo)記（常用熒光標(biāo)記（常用Cy3、Cy5），生物素、放射），生物素、放射性標(biāo)記性標(biāo)記三、分子雜交三、分子雜交樣品與樣品與DNA芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：1.雜交時間短，雜交時間短，30分鐘內(nèi)完成分鐘內(nèi)完

10、成2.可同時平行檢測許多基因序列可同時平行檢測許多基因序列影響雜交反應(yīng)的因素：影響雜交反應(yīng)的因素：鹽濃度、溫度、反應(yīng)時間、鹽濃度、溫度、反應(yīng)時間、DNA二級二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)肽核酸肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)是一類以氨基酸替代糖是一類以氨基酸替代糖-磷酸主鏈的磷酸主鏈的DNA類似物，骨架由重復(fù)的類似物，骨架由重復(fù)的N-甘氨酸甘氨酸通過酰胺鍵相連構(gòu)成，堿基則通過甲通過酰胺鍵相連構(gòu)成，堿基則通過甲叉碳?；c骨架相連。叉碳?；c骨架相連。1.PNA分子內(nèi)不會形成二級、三級結(jié)構(gòu)分子內(nèi)不會形成二級、三級結(jié)構(gòu)2.DNA與與PNA雜交不需要鹽離子雜交不需要鹽離子四、檢測分析四、檢測分

11、析1.激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)片段發(fā)射熒光射熒光2.激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點(diǎn)的信號各雜交點(diǎn)的信號3.軟件進(jìn)行進(jìn)行圖象分析和數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行進(jìn)行圖象分析和數(shù)據(jù)處理 Research UseFrom Sequence to function計算Ratio 值(=Cy3/Cy5)。在 0.5-2.0 之外的定義為在兩樣本中有明顯差異表達(dá)。進(jìn)而獲取初步功能信息。Clustering。第三節(jié)第三節(jié) DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用芯片技術(shù)的應(yīng)用DNA測序測序；雜交測序（；雜交測序（SBH）基因表達(dá)分析基因表達(dá)分析：基因組研究基因組研究：

12、作圖、測序、基因鑒定、基：作圖、測序、基因鑒定、基因功能分析因功能分析基因診斷基因診斷：尋找和檢測與疾病相關(guān)的基因：尋找和檢測與疾病相關(guān)的基因及在及在RNA水平上檢測致病基因的表達(dá)水平上檢測致病基因的表達(dá)藥物研究與開發(fā)藥物研究與開發(fā)：cDNA microarray expression patterns of small(S)and large(L)neurons 應(yīng)用之一應(yīng)用之一 基因表達(dá)譜（基因表達(dá)譜（gene expression pattern)紅色紅色 上調(diào)上調(diào)黃色黃色 不變不變綠色綠色 下調(diào)下調(diào)基因表達(dá)譜芯片基因表達(dá)譜芯片的應(yīng)用最為廣泛，技的應(yīng)用最為廣泛，技術(shù)上也最成熟。這種芯片可

13、以檢測整個術(shù)上也最成熟。這種芯片可以檢測整個基因組范圍的眾多基因在基因組范圍的眾多基因在mRNA表達(dá)水表達(dá)水平的變化。它能對來源于不同個體、不平的變化。它能對來源于不同個體、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生理病理、不同刺不同分化階段、不同生理病理、不同刺激條件下的組織細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況進(jìn)激條件下的組織細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況進(jìn)行對比分析。從而對基因群在個體特異行對比分析。從而對基因群在個體特異性、組織特異性、發(fā)育特異性、分化特性、組織特異性、發(fā)育特異性、分化特異性、疾病特異性、刺激特異性的變化異性、疾病特異性、刺激特異性的變化特征和規(guī)律進(jìn)

14、行描述，特征和規(guī)律進(jìn)行描述，進(jìn)一步闡明基因的相互協(xié)同、抑制、互進(jìn)一步闡明基因的相互協(xié)同、抑制、互為因果等關(guān)系。有助于理解基因及其編為因果等關(guān)系。有助于理解基因及其編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，并從已知生碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，并從已知生物學(xué)功能的基因推論未報道基因的生物物學(xué)功能的基因推論未報道基因的生物學(xué)意義。同時，還可在基因水平上解釋學(xué)意義。同時，還可在基因水平上解釋疾病的發(fā)病機(jī)理，為疾病診斷、藥效跟疾病的發(fā)病機(jī)理，為疾病診斷、藥效跟蹤、用藥選擇等提供有效手段蹤、用藥選擇等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表達(dá)譜芯片的研癌、前列腺癌、肝癌等表達(dá)譜芯片的研究究。基因芯片的優(yōu)點(diǎn)基因芯片的優(yōu)點(diǎn)：1.高通量高通量2.大規(guī)模大規(guī)模3.高度平行性高度平行性4.快速高效快速高效5.高靈敏度高靈敏度6.高度自動化高度自動化