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1、第十三章 DNA芯片技術(shù)第一節(jié) 概 述一、DNA芯片技術(shù)的概念1DNA芯片技術(shù) DNA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成（in situ synthesis）寡核苷酸探針，或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析即可得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。DNA芯片又被稱為基因芯片（gene chips）、DNA陣列（DNA array）、cDNA芯片（cDNA chips）、寡核苷酸陣列（oligonucleotide array）等。,2生物芯片的概念及其種

2、類和作用。 生物芯片（biochip）是指通過微電子、微加工技術(shù)在芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、DNA、蛋白質(zhì)及其他生物組分的快速、敏感、高效的處理。生物芯片可以分為DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片和其他芯片三類。其中前兩者屬于檢測(cè)芯片： （1）DNA芯片可以通過雜交來檢測(cè)樣品中的核酸，也可以利用雙鏈DNA與蛋白質(zhì)的相互作用來檢測(cè)蛋白質(zhì)。 （2）蛋白質(zhì)芯片利用蛋白質(zhì)間的相互作用如抗原-抗體反應(yīng)或受體-配體之間的特異作用來進(jìn)行檢測(cè)。 （3）其他的生物芯片有樣品制備芯片、核酸擴(kuò)增芯片、毛細(xì)管電泳芯片等，即在芯片上分別進(jìn)行樣品的分離、擴(kuò)增、生化反應(yīng)等過程。 3廣義的生物芯片概念

3、。 廣義的生物芯片概念還包括縮微實(shí)驗(yàn)室，即通過采用類似集成電路制作過程中的半導(dǎo)體光刻加工的縮微技術(shù)，把生命科學(xué)研究中某些不連續(xù)的過程如樣品的分離，擴(kuò)增，生化反應(yīng)和檢測(cè)全部集成到芯片上，使其連續(xù)化和微型化，構(gòu)成所謂的縮微芯片實(shí)驗(yàn)室（laboratory on a chip，microlab）。這與xx將數(shù)間房屋大小的計(jì)算機(jī)縮微成現(xiàn)在的筆記本式計(jì)算機(jī)有異曲同工之妙。,二、DNA芯片的主要類型及其特點(diǎn)。 根據(jù)DNA芯片的制備方式可以將其分為兩大類： 原位合成芯片（synthetic gene chip） 采用顯微光蝕刻等技術(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片稱為原位合成芯片

4、。這種芯片的集成度教高，可達(dá)10萬40萬點(diǎn)陣/平方厘米。但合成的寡核苷酸探針長(zhǎng)度較短，一般為820個(gè)核苷酸殘基（nucleotide，nt），最長(zhǎng)為50nt，因此需要使用多個(gè)相互重疊的探針片進(jìn)行檢測(cè)，才能對(duì)基因進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。 DNA微集芯片（DNA microchips） 將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片稱為DNA微集芯片，又稱為DNA微集陳列（DNA microarray）。這類芯片集成度相對(duì)較低，可達(dá)1萬10萬點(diǎn)陣/平方厘米，但使用的探針組的來源比較靈活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用來自基因組的較長(zhǎng)的DNA片段；可以是雙鏈，也可

5、以采用單鏈的DNA或RNA片段，且技術(shù)實(shí)現(xiàn)未受到嚴(yán)格的專利控制，因而近年來發(fā)展很快。探針的長(zhǎng)度可達(dá)100500nt。,第二節(jié) DNA芯片技術(shù)的基本原理與方法 一、芯片的制備 芯片制備的基本原理。 芯片的制備包括支持物的預(yù)處理、原位合成芯片的準(zhǔn)備和DNA微集陳列的制備三個(gè)方面。 1.支持物的預(yù)處理 目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分為兩類：實(shí)性材料和膜性材料。實(shí)性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等。實(shí)性材料需要進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基等活性基團(tuán)。在合成寡核苷酸前，這些基因可與光敏材料的光敏保護(hù)基團(tuán)形成共價(jià)交聯(lián)而被保護(hù)起來，合成時(shí)在

6、光照下除去光敏保護(hù)基團(tuán)，該活性基團(tuán)又可以和活化的單核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。另一方面，這些活性基團(tuán)可與DNA分子中的羥基等基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸等，使其帶上正電荷吸附帶負(fù)電荷的DNA探針。,2.原位合成芯片的制備 原位合成芯片是采用顯微光蝕刻（photolithography）技術(shù)或壓電打?。╬iezoelectric printing）技術(shù)，在芯片的特定區(qū)域原位合成寡核苷酸而制成。顯微光蝕刻技術(shù)也稱為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（light-directed synthesis），它不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分

7、子。它是照相平板印刷技術(shù)（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸，多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是原位合成芯片的主要方法。壓電打印法的裝置與普通的彩色噴墨打印機(jī)相似，所用的技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。 3.DNA微集陳列的制備 DNA微集陳列的制備采用的是預(yù)先合成DNA或制備基因探針然后打印到芯片上的方式。,二、樣品的準(zhǔn)備 樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記等過程。 1樣品的分離純化 主要從活組織或血液中獲得DNA或mRNA，這個(gè)過程包括細(xì)胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸的過程。 2樣品的擴(kuò)增 測(cè)定時(shí)往往需要較多的樣品分子，因此對(duì)于分離獲得的基因組DNA通過P

8、CR技術(shù)直接擴(kuò)增，對(duì)于mRNA則需要逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。 3.樣品的標(biāo)記 標(biāo)記物主要有熒光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素等。帶有標(biāo)記的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通過DNA或cDNA擴(kuò)增的過程，摻入靶分子序列。也可以在制備引物時(shí)，摻入標(biāo)記的核苷酸，擴(kuò)增靶序列后，使擴(kuò)增產(chǎn)物末端帶有標(biāo)記物。膜性載體可以用于檢測(cè)同位素標(biāo)記的樣品。 樣品分子標(biāo)記的質(zhì)量影響芯片檢測(cè)的靈敏度，因此，核酸的提取，反轉(zhuǎn)錄以及標(biāo)記等各環(huán)節(jié)要求嚴(yán)格操作。熒光標(biāo)記分辨率高于同位素標(biāo)記，而且可以采用雙色，如對(duì)照樣品標(biāo)紅色，待檢樣品標(biāo)綠色，有助于結(jié)果分析與判斷。,

9、三、分子雜交 芯片雜交是應(yīng)用標(biāo)記的待測(cè)樣品（靶序列）與固定在載體表面的探針進(jìn)行的復(fù)雜過程。 依據(jù)探針長(zhǎng)度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應(yīng)時(shí)間。通常采用的條件是：42，50%甲酰胺，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt試劑。也可采用65，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt試劑或者65，10%SDS，7%PEG-800。 雜交過程類似Northern或Southern雜交，如封閉液預(yù)雜交、雜交、清洗、干燥與檢測(cè)。 四、檢測(cè)分析 芯片雜交信號(hào)的檢測(cè)可應(yīng)用熒光檢測(cè)法、質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法以及生物傳感器法。其中激光共聚焦熒光檢測(cè)法是最常應(yīng)用的方法

10、：激光從芯片的背面切入，聚焦于芯片與靶溶液的相互作用面，與探針雜交的靶序列標(biāo)記物被激發(fā)產(chǎn)生熒光，經(jīng)過棱鏡聚焦而被檢測(cè)器檢測(cè)。樣品靶序列與探針嚴(yán)格配對(duì)雜交的分子發(fā)生強(qiáng)熒光信號(hào)，不完全雜交顯示較弱的信號(hào)。,第三節(jié) DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用 DNA芯片使用的基本流程。 DNA芯片使用包括待測(cè)樣品準(zhǔn)備、分子雜交和檢測(cè)分析3個(gè)步驟。 1.待測(cè)樣品的準(zhǔn)備 樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記。 首先采用常規(guī)方法從組織細(xì)胞中分離純化樣品核酸、DNA或mRNA，由于目前芯片檢測(cè)儀器的靈敏度有限，要求對(duì)樣品中靶序列進(jìn)行高效而特異地?cái)U(kuò)增。樣品的標(biāo)記主要采用熒光法，也可以用生物素，放射性核素標(biāo)記法。

11、 2.分子雜交 待測(cè)樣品經(jīng)擴(kuò)增和標(biāo)記處理后，即可與DNA芯片上的探針陳列進(jìn)行分子雜交。芯片雜交與傳統(tǒng)的Southern印跡等雜交方法類似，屬固-液雜交。探針分子固定于芯片表面，與位于液相的靶分子進(jìn)行反應(yīng)。芯片雜交的特點(diǎn)是探針的量顯著大于靶基因片段，雜交動(dòng)力學(xué)呈線形關(guān)系。雜交信號(hào)的強(qiáng)弱與樣品中靶基因的量成正相關(guān)。 3.檢測(cè)分析 芯片雜交及清洗后，未雜交分子被清除，帶有熒光標(biāo)記的靶DNA（雜交分子）與其互補(bǔ)的DNA探針形成雜交體，在激光的激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光。以掃描儀對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析，通過陳列上DNA探針的原始序列將靶DNA的信息反映出來。,DNA芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

12、 DNA芯片用于基因診斷、DNA序列測(cè)定、臨床藥物篩選、法醫(yī)鑒定、 食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極大的潛力。 1.基因診斷 應(yīng)用DNA芯片技術(shù)可以在DNA水平檢測(cè)與疾病相關(guān)的內(nèi)源性或外源性基因；應(yīng)用表達(dá)芯片可以在mRNA水平分析同一組織在不同的發(fā)育階段，正常及病理狀態(tài)基因表達(dá)的差異，也可以分析不同組織同一基因在正常及病理狀態(tài)下表達(dá)的差異，從而為疾病診斷與分類，病原微生物分型提供科學(xué)依據(jù)。 2.DNA序列測(cè)定 任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解成一系列堿基數(shù)固定、錯(cuò)落而且重疊的寡核苷酸，如GTACTCGAATGC分解成GTACTAGA、TACTCGAA、ACTCG

13、AAT、CTCGAATG、TCGAATGC五個(gè)錯(cuò)開1個(gè)堿基但是可重疊7個(gè)堿基的8體亞序列，當(dāng)然也可以分解成7體，9體或其他整數(shù)（n體）亞序列。如果用某種方法將5個(gè)亞序列全部測(cè)定出來，就可以重新組建原來的核苷酸排列順序。應(yīng)用這一原理，可以合成或應(yīng)用已知序列的所有可能的n體寡核苷酸，并將其固定在芯片表面，然后與標(biāo)記的待測(cè)靶序列雜交，經(jīng)過重新組合，即可得到待測(cè)的DNA序列。 3.臨床藥物篩選 臨床許多細(xì)菌對(duì)藥物具有抗藥性，但是不同的亞型對(duì)同一藥物的敏感性不同。DNA芯片技術(shù)已被用于鑒定結(jié)核菌及非典型分支桿菌的基因型與耐利福平的相關(guān)性以及HIV產(chǎn)生抗藥性與其逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因突變的相關(guān)性。這為臨床選擇敏感藥物提供了有效手段。 4.其他領(lǐng)域 法醫(yī)鑒定、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面，DNA芯片技術(shù)也將具有極大的潛力。,