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1、8.5 不同類型內(nèi)含子的比較,8.5.1.1 型內(nèi)含子,概念: ：1980年代初，發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物四膜蟲 (Tetruhymenu) 的rRNA內(nèi)含子能夠自我剪接(self splicing)，這一類內(nèi)含子后被稱作型內(nèi)含子.后來(lái)在酵母菌的線粒體rRNA基因中也含有此類內(nèi)含子.,發(fā)現(xiàn)過(guò)程為: 1980年,科學(xué)工作者將四膜蟲rRNA基因克隆到質(zhì)粒中，并與E.coli 的RNA聚合酶一起保溫，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物除了有約400nt的rRNA內(nèi)含子外，還有一些小片段。從凝膠中回收rRNA前體，在無(wú)蛋白質(zhì)的條件下保溫培養(yǎng)，單一的rRNA前體依然可形成片段更小的電泳條帶，其中移動(dòng)最快的是39nt的條帶，測(cè)序發(fā)現(xiàn)，它

2、相當(dāng)于413nt的rRNA內(nèi)含子中的片段。將四膜蟲26S rRNA基因的一部分(第l個(gè)外顯子303bp + 完整的內(nèi)含子413bp + 第2個(gè)外顯子624bp)克隆到含噬菌體SP6啟動(dòng)子的載體內(nèi)，再轉(zhuǎn)錄該重組質(zhì)粒，將獲得的產(chǎn)物與 GTP一起保溫，可以得到剪接產(chǎn)物，但缺乏GTP時(shí)無(wú)剪接反應(yīng)，證明rRNA前體的確可以進(jìn)行有GTP參與的自我剪接。,8.5.1.2 型內(nèi)含子的剪接機(jī)制,(1) I型內(nèi)含子剪接的過(guò)程 I型內(nèi)含子剪接的第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，是由一個(gè)游離的鳥苷或鳥苷酸(GMP, GDP或GTP)啟動(dòng)的。鳥苷酸或鳥苷的3-OH親核攻擊內(nèi)含子5-端剪接點(diǎn)的磷酸二酯鍵，將G轉(zhuǎn)移到內(nèi)含子的5-端，同

3、時(shí)切割內(nèi)含子與上游外顯子之間的磷酸二酯鍵，在上游外顯子末端產(chǎn)生新的3-OH。在第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中，上游外顯子3-OH攻擊內(nèi)含子3-端剪接點(diǎn)的磷酸二酯鍵，將上游外顯子和下游外顯子連接起來(lái)，并釋放線性的內(nèi)含子。兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是連續(xù)的，即外顯子連接和線性內(nèi)含子的釋放同時(shí)進(jìn)行。因此，實(shí)驗(yàn)不能得到游離的上游外顯子和下游外顯子。,第三次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是線性內(nèi)含子的環(huán)化，發(fā)生在已切除的內(nèi)含子片段中，內(nèi)含子的3-OH攻擊其5-端附近的第15和第16核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從5-端切除15nt的片段，并形成399nt的環(huán)狀RNA。環(huán)狀RNA隨即被切割生成線狀RNA，由于切割位置與環(huán)化位置相同，生成的線狀RNA依然為399

4、nt。接著，再?gòu)?-端切去4個(gè)核苷酸，最終產(chǎn)物是395nt的線性RNA，由于這一產(chǎn)物比最初釋放的內(nèi)含子少19個(gè)核苷酸，因而被稱作L19。,(2) I型內(nèi)含子的結(jié)構(gòu) I型內(nèi)含子剪接的最重要特點(diǎn)是自我催化(self-catalysis)，I型內(nèi)含子的自我剪接活性依賴于RNA分子中的堿基配對(duì)。通過(guò)比較不同的I型內(nèi)含子序列，發(fā)現(xiàn)其中有9個(gè)主要的堿基配對(duì)區(qū)域，命名為P1P9，在I型內(nèi)含子中高度保守的雙鏈結(jié)構(gòu)有3個(gè)，即P1的內(nèi)部引導(dǎo)序列(internal guide sequence, IGS)，P4的保守短序列元件P/Q，和P7的保守短序列元件S/R，其他配對(duì)區(qū)的序列因內(nèi)含子不同而異。I型內(nèi)含子自我剪接

5、所需的最小催化活性中心由P3、P4、P6和P7組成。該結(jié)構(gòu)包括由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的催化核心，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)堿基配對(duì)區(qū)域構(gòu)成。包含上游外顯子末端序列和內(nèi)含子端IGS的P1，構(gòu)成底物結(jié)合位點(diǎn)，IGS是內(nèi)含子中能與外顯子進(jìn)行堿基配對(duì)的序列，這種配對(duì)使剪接位點(diǎn)暴露而易受攻擊，同時(shí)使剪接反應(yīng)具有專一性(圖8-16)。,,I型內(nèi)含子的特征 1.邊界順序?yàn)?UG 3; 2.具有中部核心結(jié)構(gòu)（Central core structure); 3.內(nèi)部引導(dǎo)順序(Internal guide seguence IGS); 4.剪接通過(guò)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)（Transesterification).,8.5.2.1 II型內(nèi)含

6、子的特點(diǎn) II型內(nèi)含子主要存在于某些真核生物的線粒體和葉綠體rRNA基因中，也具有催化功能，能夠完成自我剪接.幾乎所有的細(xì)菌II型內(nèi)含子能夠編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，并可作為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的衍生物高頻率插入特定區(qū)域，或低頻率插入其它區(qū)域。II型內(nèi)含子是由內(nèi)含子靠近3-端的腺苷酸2-羥基攻擊5-磷酸基啟動(dòng)剪接過(guò)程，經(jīng)過(guò)兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)連接兩個(gè)外顯子，并切除形成套索結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子(圖8-17)。,8.5.2.2 II型內(nèi)含子的剪接機(jī)制,II型內(nèi)含子的5-端和3-端剪接位點(diǎn)序列為5GUGCGYnAG3，符合GUAG規(guī)則。II型內(nèi)含子的空間結(jié)構(gòu)保守而復(fù)雜，其自我剪接的活性有賴于其二級(jí)結(jié)構(gòu)和進(jìn)一步折疊的

7、構(gòu)象，因此在細(xì)胞內(nèi)的存在受到限制。在II型內(nèi)含子特有的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，有6個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成的結(jié)構(gòu)域(dld6)，在空間上靠近的d5和d6，構(gòu)成催化作用的活性中心(圖8-18)。,在II型內(nèi)含子剪接過(guò)程中，首先由內(nèi)含子靠近3-端d6結(jié)構(gòu)中的分支點(diǎn)保守序列上A的2-OH向5-剪接位點(diǎn)的磷酸二酯鍵發(fā)動(dòng)親核攻擊，形成外顯子1的3-OH，內(nèi)含子5-端的磷酸基與分支點(diǎn)A的2-OH基形成2, 5-磷酸二酯鍵，產(chǎn)生套索結(jié)構(gòu)，完成第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。接著，外顯子1的3-OH親核攻擊3-剪接位點(diǎn)，切斷3-剪接位點(diǎn)的磷酸二酯鍵，并形成外顯子1與外顯子2之間的3, 5-磷酸二酯鍵，完成第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。經(jīng)過(guò)兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，兩個(gè)外顯

8、子被連接在一起，并釋放含有套索結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子。,II型內(nèi)含子主要的轉(zhuǎn)座事件是歸巢(homing)，歸巢的實(shí)質(zhì)是以內(nèi)含子RNA作為模板，將逆轉(zhuǎn)錄合成的DNA插入靶位點(diǎn)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由與RNA內(nèi)含子結(jié)合的RT催化，屬于靶位點(diǎn)為引物的逆轉(zhuǎn)錄(target-primed reverse transcription)。如圖8-20所示，歸巢反應(yīng)開始于雙鏈DNA外顯子連接點(diǎn)上RNA內(nèi)含子在靶位點(diǎn)的反拼接(reverse splicing)插入，這一步由RNA催化，RT協(xié)助，相當(dāng)于由成熟酶協(xié)助的拼接反應(yīng)的逆反應(yīng)。隨后，RT的En結(jié)構(gòu)域在下游9 bp10 bp的位置切開DNA的另一條鏈，再由RT催化，以被切開的D

9、NA鏈作為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。最后，通過(guò)DNA的修復(fù)合成和連接完成內(nèi)含子的插入過(guò)程。,Splicing releases a mitochondrial group II intron in the form of a stable lariat.,8.5.3 內(nèi)含子剪接機(jī)制的比較,從內(nèi)含子的剪接機(jī)制來(lái)看，I型內(nèi)含子、II型內(nèi)含子和核pre-mRNA剪接的III型內(nèi)含子是相似的，只有tRNA的IV型內(nèi)含子剪接機(jī)制完全不同。 I型內(nèi)含子剪接與核Pre-mRNA剪接體切除內(nèi)含子的主要區(qū)別是，剪接體內(nèi)含子使用內(nèi)含子自身的一個(gè)核苷酸，而I型內(nèi)含子的剪接反應(yīng)使用外源核苷酸，即鳥苷酸或鳥苷，因此在剪接過(guò)程

10、中不能形成套索結(jié)構(gòu)。 III型內(nèi)含子的剪接體內(nèi)snRNA的整體形態(tài)和II型內(nèi)含子自我剪接時(shí)的形態(tài)類似，特別是剪接體的snRNA和II型內(nèi)含子的催化部位之間的結(jié)構(gòu)和功能十分相似?？梢哉J(rèn)為，這些snRNA可能來(lái)自早期自我剪接系統(tǒng)的II型內(nèi)含子,I型內(nèi)含子與II型內(nèi)含子都能夠完成自我剪接，不像III型內(nèi)含子那樣需要結(jié)構(gòu)復(fù)雜的剪接體。正因?yàn)槿绱耍琁型內(nèi)含子與II型內(nèi)含子剪接的效率和調(diào)控遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上III型內(nèi)含子。I型內(nèi)含子的剪接反應(yīng)使用外源鳥苷酸或鳥苷，II型內(nèi)含子的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)無(wú)需游離鳥苷酸或鳥苷的啟動(dòng)，由內(nèi)含子內(nèi)部的腺苷酸引起，也許II型內(nèi)含子剪接的效率和精確度比I型內(nèi)含子更好一些。,8.6 核酶,8.

11、6.1 核酶的發(fā)現(xiàn) 1982年Cech等研究原生動(dòng)物嗜熱四膜蟲rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工，發(fā)現(xiàn)rRNA的前體可以在鳥苷與鎂離子存在下切除自身的內(nèi)含子，將兩個(gè)外顯子拼接為成熟的rRNA分子，該反應(yīng)不需要任何蛋白質(zhì)類型的酶參與，因此Cech認(rèn)為該rRNA前體具有催化功能，并將其命名為核酶(ribozyme). Cech和Altman因發(fā)現(xiàn)Ribozyme而獲得1989年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,,1985年Cech等通過(guò)進(jìn)一步研究，從切除的內(nèi)含子中分離得到L19RNA，可參與如轉(zhuǎn)核苷酸反應(yīng)、水解反應(yīng)、轉(zhuǎn)磷酸反應(yīng)等。L19RNA催化的轉(zhuǎn)核苷酸反應(yīng)如圖8-21所示，可以看出，L19RNA既可從寡聚C切除核苷酸

12、(圖8-21和)，也可在寡聚C上添加核苷酸(圖8-21和)，其催化過(guò)程具備酶的所有基本特征。,,核酶作用的特點(diǎn)： 1，化學(xué)本質(zhì) RNA 2，底物 RNA 肽鍵-葡聚糖分子酶 3，反應(yīng)特異性 4，催化效率低 5，產(chǎn)物,,Reactions catalyzed by RNA have the same features as those catalyzed by proteins, although the rate is slower. The Km gives the concentration of substrate required for half-maximum velocity;

13、this is an inverse measure of the affinity of the enzyme for substrate. The turnover number gives the number of substrate molecules transformed in unit time by a single catalytic site.,核酶的分類,8.6.3 核酶的結(jié)構(gòu) 核酶的催化功能與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，已知有多種不同結(jié)構(gòu)的核酶。例如，I型和II型自我剪接內(nèi)含子、錘頭型、RNaseP的Ml RNA、發(fā)夾型、丁型肝炎病毒(hepatitis delta v

14、irus, HDV)的基因組和反基因組等。錘頭型、發(fā)夾型和HDV正負(fù)鏈核酶均能促使自身或底物RNA裂解，產(chǎn)生2, 3-環(huán)磷酸酯和5-OH,,錘頭結(jié)構(gòu)(hammerhead structure)。錘頭結(jié)構(gòu)包含3個(gè)莖環(huán)區(qū)以及13個(gè)保守核苷酸構(gòu)成的催化中心，可以由一條RNA鏈回折形成(圖8-22a)，也可由底物鏈和催化鏈共同構(gòu)成(圖8-22b)，兩種形式的錘頭結(jié)構(gòu)都可構(gòu)成如圖8-22c所示的空間結(jié)構(gòu)，即酶的活性中心。事實(shí)上無(wú)論自我剪切型的核酶，或者酶與底物RNA之間，只要能形成錘頭二級(jí)結(jié)構(gòu)，并具備1113nt的保守序列，就能在錘頭結(jié)構(gòu)GUN序列的3-端自動(dòng)發(fā)生剪切反應(yīng)。,核酶的活性部位是暴露在分子表面的一段保守核苷酸區(qū)域，無(wú)論RNA分子形成的是二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，都使得這個(gè)區(qū)域保持一種特定的分子環(huán)境，能使自身RNA分子斷裂，或者使另一底物分子的磷酸二酯鍵斷裂，或在切割一個(gè)磷酸二酯鍵的同時(shí)，形成另一個(gè)新的磷酸二酯鍵。核酶RNA與底物RNA之間的相互作用依賴于堿基配對(duì)，形成一種催化環(huán)境。,核酶是一種金屬離子依賴酶,金屬離子的結(jié)作用： 特異的結(jié)構(gòu)作用或參與活性部位的化學(xué)過(guò)程 促進(jìn)RNA整體折疊 二價(jià)金屬離子（Mg2+)與底物活性部位直接相互作用或參與過(guò)渡中間復(fù)合物的產(chǎn)生,