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1、比較接種外源菌劑和自然堆肥的兩種堆肥處理效果 　　目前，堆肥是解決大量畜禽糞便經(jīng)濟(jì)有效的處理方法之一，不僅能解決環(huán)境污染問題，還能夠?qū)U棄物堆制成肥料或土壤調(diào)節(jié)劑，施入田中，起到改良土壤和增加肥效的作用。一些研究表明，在人工條件下通過添加外源菌劑可提高堆肥微生物數(shù)量，加速堆肥反應(yīng)進(jìn)程。 　　許多研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)木質(zhì)纖維素的降解是限制堆肥腐熟進(jìn)程，并影響堆肥產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素。 　　因此，向堆肥中添加木質(zhì)纖維素降解菌，并研究這些功能菌株對堆肥的促進(jìn)作用已經(jīng)成為近年來許多學(xué)者的研究課題。王偉東等人研究表明，接種木質(zhì)纖維素降解菌使牛糞堆肥中纖維素、半

2、纖維素、木質(zhì)素的降解率分別比對照提高了 12.8%、3.51% 和 4.78%;許修宏等人利用牛糞和稻草共發(fā)酵的研究表明，添加木質(zhì)素降解菌復(fù)合菌劑-黃孢原毛平革菌 (Phanero-chaete chrysosporium) 和變色栓菌 (Thametesversicolor)使堆肥中的纖維素酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶活性均有所增加。然而，目前關(guān)于堆肥中木質(zhì)纖維素降解菌數(shù)量變化的研究還相對較少。堆肥中微生物群落由于生境的改變，不斷進(jìn)行著自我調(diào)整，因此，堆肥的實(shí)質(zhì)也可以看成是微生物群落結(jié)構(gòu)演替的動(dòng)態(tài)過程。所以，研究堆肥過程中木質(zhì)纖維素降解微生物生理群的動(dòng)態(tài)變化，有助于全面了解堆肥化過程中木質(zhì)纖維

3、素的生物降解，進(jìn)而對提高堆肥效率具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)通過比較接種外源菌劑和自然堆肥的兩種不同堆肥處理，監(jiān)測堆肥中木質(zhì)纖維素酶活性和木質(zhì)纖維素含量變化，并結(jié)合木質(zhì)纖維素降解微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化，了解添加木質(zhì)纖維素降解菌劑對堆肥中木質(zhì)纖維素降解的強(qiáng)化作用，為接種劑開發(fā)和提高堆肥效率提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。 　　1、 材料與方法 　　1. 1 堆肥材料 　　堆肥材料為新鮮牛糞和水稻秸稈 (調(diào)理劑) 。將水稻秸稈鍘成5 cm 左右的小段，與鮮牛糞按照1∶3. 5的質(zhì)量比混合均勻，調(diào)節(jié)水分含量至 60% ～ 65%，堆成 1 m ×1 m ×1. 2 m 的發(fā)酵堆。該堆

4、料有機(jī)質(zhì)含量約為 59. 5%，C/N 約為 30∶ 1，木質(zhì)纖維素含量為 55. 59%，其中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素比例分別為 6. 84%、24. 37%和 24. 38%。 　　1. 2 堆肥接種及取樣方法 　　堆料分 A、B 組，A 組為對照樣，進(jìn)行自然堆肥; B 組添加菌劑 DN －1 (由本實(shí)驗(yàn)室選配) ，包括研究木質(zhì)素降解的模式菌株 － 黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) ; 兼具木質(zhì)素、纖維素、半纖維素3 種酶活性的灰略紅鏈霉菌 (Strepto-myces griseorubens) C － 5; 從堆肥中分離得到的具有木質(zhì)纖維素降

5、解能力且能使堆肥快速升溫的 3 株芽孢桿菌 (Bacillus sp. X9、Bacillus sp. L1 和 Bacillussp. L8) 。采用固態(tài)接種體，濃度為 1 × 109CFU / g，接種量為10 g/kg，邊建堆邊添加菌劑，接種后均勻混合堆體材料。 　　采用室內(nèi)好氧堆肥，自然通風(fēng)。當(dāng)溫度上升到45℃ 開始翻堆，每 3 d 翻堆 1 次，溫度下降到35℃后每 7 d 翻 1 次，直至堆體溫度下降至環(huán)境溫度時(shí)結(jié)束發(fā)酵。堆肥持續(xù) 46 d，根據(jù)堆體溫度變化分別在 1、3、12、18、22、31、46 d 取樣分析。采樣采取多點(diǎn)采樣法，均勻混合樣品后，用于測定各理化指

6、標(biāo)，所有分析取樣均采集 3 個(gè)平行樣。 　　1. 3 測定項(xiàng)目及方法 　　使用 LNI － T UT325 數(shù)字電子溫度計(jì)每天測定環(huán)境溫度和距堆體頂端 30 cm 處溫度。pH 值測定:各時(shí)期取 1 g 樣品，準(zhǔn)確加入 10 mL 蒸餾水，稍作振蕩后，放入 120 r/min 搖床振蕩 1 h，然后倒入離心管，在6 000 r/min 下離心15 min，將上層清液倒入小燒杯，用數(shù)顯型 pH 儀測定，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，取平均值。木質(zhì)素漆酶活性測定采用 ABTS 法;纖維素和半纖維素酶活性測定采用 DNS 法。木質(zhì)纖維素含量利用 ANKOM220型纖維分析儀分析測定。木質(zhì)素和纖維素 (半纖維

7、素) 降解菌數(shù)量分別采用愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法和剛果紅染色平板計(jì)數(shù)法分析測定。 　　2、 結(jié)果與分析 　　2. 1 堆肥過程中的溫度變化 　　溫度是影響微生物生長的重要因素，溫度變化能很好地反映堆肥的進(jìn)程。由圖 1 可知，堆體的溫度變化經(jīng)歷了快速升溫、持續(xù)高溫、降溫和腐熟穩(wěn)定4 個(gè)階段。添加菌劑的堆肥在第3 d 進(jìn)入高 溫 期 (＞ 45℃) ，高 溫 期 持 續(xù) 20 d (3 ～22 d) 。自然堆肥雖然也在第 3 d 進(jìn)入高溫期，但高溫期僅持續(xù)14 d，而且高溫期的平均溫度低于菌劑堆肥。由此可見，加入菌劑可延長堆肥的高溫期，提高堆體溫度，這樣可以更有效地殺死堆肥中的寄生蟲和病原

8、微生物，達(dá)到無害化目的，促進(jìn)堆肥腐熟。 　　2. 2 堆肥過程中 pH 值的變化 　　pH 值的大小對微生物的生長有重要影響，也是提示堆肥分解程度的標(biāo)志之一。一般認(rèn)為，堆肥pH 值在 8 左右可獲得最大堆肥速率，由圖 2 可知，不同堆肥處理的 pH 值均在 7. 8 ～9. 0 之間，可滿足好氧堆肥對 pH 值的要求。兩種處理在堆肥初期均呈先下降后上升的趨勢，這可能是由于初期可利用的有機(jī)質(zhì)較多，微生物生命活動(dòng)旺盛，產(chǎn)生大量有機(jī)酸，降低了堆體 pH 值水平; 隨后有機(jī)酸隨著溫度的升高而揮發(fā)，同時(shí)含氮物質(zhì)降解產(chǎn)生 NH+4的不斷積累，從而使堆體的 pH 值又逐漸升高。在整個(gè)堆肥過程中菌劑處

9、理的 pH 值均略低于自然堆肥，說明加入菌劑可降低堆料 pH 值，這樣可以減少發(fā)酵過程中的氨揮發(fā)，有助于提高堆肥肥效。 　　2. 3 堆肥過程中木質(zhì)纖維素酶活性變化 　　堆肥中的一切生物化學(xué)過程都是在酶的參與下進(jìn)行的，酶的活性大小可以反映有機(jī)物料堆制中各種生物化學(xué)過程的方向和強(qiáng)度。 　　2. 3. 1 羧甲基纖維素酶和濾紙酶活性的變化 　　由圖 3 可見，雖然兩種處理中纖維素酶活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但菌劑堆肥的纖維素酶活性在各時(shí)期均高于自然堆肥，說明加入菌劑能更有效地提高堆肥中的纖維素酶活性。菌劑堆肥中 CMC酶和濾紙酶活性的最高值分別為 1 120、268 U/L，而自然堆肥中僅

10、分別為 161、59 U/L。其中 CMC酶活性明顯高于濾紙酶活性，這是由于酶對水溶性底物 (CMC － Na) 有較高的活性，而濾紙與酶是多相催化，所以反應(yīng)的空間阻礙較大。 　 　　2. 3. 2 半纖維素木聚糖酶活性變化 　　木聚糖酶是促進(jìn)半纖維素降解的主要生物催化劑，可將其主要成分木聚糖降解為木糖或低聚糖。從圖 4 中可見，接菌處理的堆肥在發(fā)酵的前 12 d 內(nèi)，木聚糖酶活性達(dá)到整個(gè)發(fā)酵過程的最高值 1 681 U/L，直到發(fā)酵結(jié)束，仍然有高達(dá) 1 210 U/L 的活性。而自然堆肥過程中木聚糖酶活性最高值僅為 770 U/L?？梢?，菌劑中微生物具有持續(xù)高產(chǎn)木聚糖酶的特性，顯示了對

11、堆肥中半纖維素成分很強(qiáng)的降解能力。另外，由于半纖維素與木質(zhì)素以化學(xué)鍵連接存在，組成木質(zhì)素 － 碳水化合物復(fù)合體，半纖維素酶催化水解復(fù)合體的碳水化合物部分，這也同時(shí)有利于復(fù)合體的溶出。 　　因此，菌劑中微生物持續(xù)高產(chǎn)半纖維素木聚糖酶的特性對于堆肥中木質(zhì)素的降解也起到重要作用。 　　 　　2. 3. 3 漆酶活性變化 　　漆酶是一種含銅多酚氧化物，能夠催化酚類物質(zhì)氧化還原，在木質(zhì)素降解中發(fā)揮重要作用。 　　由圖 5 可見，菌劑堆肥中的漆酶活性變化呈較明顯的雙峰; 1 ～18 d 緩慢升高，并在第 18 d 達(dá)到最高值 4 666 U/L (自然堆肥僅為 1 700 U/L) ，之后逐漸下

12、降; 在第 31 d 又達(dá)到第二次峰值 3 666 U/L，由此可以推測，木質(zhì)素在堆肥穩(wěn)定期很可能又有較高強(qiáng)度的降解。而自然堆肥的漆酶活性除了在堆肥前期略有提高，整個(gè)堆肥過程中的酶活性始終保持在1 000 U/L左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于菌劑堆肥中的酶活性。說明加入菌劑能夠大大提高堆肥中的漆酶活性，更加有利于木質(zhì)素的分解。 　　 　　2. 4 堆肥中木質(zhì)纖維素降解菌數(shù)量及木質(zhì)纖維素降解率變化 　　微生物是好氧堆肥過程的工作主體，在堆肥反應(yīng)中對有機(jī)物的降解起著主導(dǎo)作用。在該過程中每一個(gè)微生物種群都在相對較短時(shí)間內(nèi)適應(yīng)生長繁殖的環(huán)境條件，并對某一種或某一類特定的有機(jī)質(zhì)的分解起作用。木質(zhì)纖維素降解微生物種

13、群的測定對了解堆肥各個(gè)階段木質(zhì)纖維素降解機(jī)理及降解主導(dǎo)者有著重要意義，其中木質(zhì)纖維素降解菌的數(shù)量是一個(gè)必不可少的研究參數(shù)。 　　圖 6、7、8 所示為堆肥過程中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素降解菌數(shù)量的變化動(dòng)態(tài)。由圖可知，添加菌劑的堆肥在各時(shí)期木質(zhì)纖維素分解菌的數(shù)量均高于自然堆肥，表明接種功能菌劑，能夠明顯增加堆層中降解木質(zhì)纖維素的微生物總數(shù)。接菌處理中木質(zhì)素降解菌數(shù)量呈現(xiàn)階段性變化，分別在第12和 31 d 達(dá)到兩次峰值 (圖 6) ; 纖維素和半纖維素分解菌數(shù)量均在第 3 d 達(dá)到峰值，明顯早于木質(zhì)素降解菌 (圖 7 和圖 8) ，這一變化與木質(zhì)纖維素酶活性峰值變化較一致。 　 　　表 1

14、 為木質(zhì)素、纖維素和半纖維素在堆肥各個(gè)時(shí)期的降解率變化，最終添加菌劑的堆肥中木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解率分別為 42. 54%、62. 57% 、67. 14% ，分別高出自然堆肥 14. 33% 、31. 31% 、19. 57% 。此結(jié)果表明，添加菌劑明顯提高了堆肥中木質(zhì)纖維素的降解程度。 　 　　3、 討論 　　木質(zhì)素含量在堆制過程中升高是很多研究所得的結(jié)果，原因在于木質(zhì)素較其他有機(jī)質(zhì)難以降解。木質(zhì)素是由苯丙烷單元通過醚鍵和碳碳鍵連接而成的聚酚類三維網(wǎng)狀高分子芳香族化合物，其與半纖維素側(cè)鏈共價(jià)結(jié)合，是微生物降解碳水化合物的障礙之一。而且，木質(zhì)素的障礙作用不僅表現(xiàn)為物理屏障，其中

15、含有的酚類化合物還可以抑制微生物的降解活性。有些研究者甚至據(jù)此認(rèn)為木質(zhì)素在堆肥化過程中不發(fā)生降解。 　　事實(shí)上，本研究中木質(zhì)素發(fā)生了顯著的降解。在添加菌劑的堆肥中，堆制前 3 d 木質(zhì)素幾乎不被降解(降解率僅為 0. 73%) ，但當(dāng)溫度開始逐漸升高，木質(zhì)素降解率也逐漸增加，高溫期 (3 ～ 22 d) 結(jié)束時(shí)，木質(zhì)素降解率為 29. 97%，顯然，高溫期是木質(zhì)素加快降解的時(shí)期，之后隨著溫度的降低，木質(zhì)素降解逐漸減緩。但進(jìn)入二次發(fā)酵后期(31 ～ 46d) ，木質(zhì)素含量又有較大程度降低，最終降解率高達(dá) 42. 54%。郁紅艷在研究農(nóng)業(yè)廢物堆肥的過程中也得到木質(zhì)素降解主要發(fā)生在高溫以及二次發(fā)酵

16、后期的相似的結(jié)論。此外，本實(shí)驗(yàn)菌劑處理的木質(zhì)素酶 (漆酶) 活性在第 18 d 和第 31 d 出現(xiàn)兩次峰值; 木質(zhì)素降解菌的數(shù)量在第 12 d 和第 31 d 出現(xiàn)兩次峰值，二者變化都與木質(zhì)素降解率的變化較一致，這樣也從微生物生理和生態(tài)角度進(jìn)一步印證了高溫期和二次發(fā)酵后期是木質(zhì)素降解較為活躍的階段。 　　4、 結(jié)論 　　堆肥過程中加入菌劑可提高堆體溫度，延長堆肥高溫期，降低堆肥 pH 值。 　　添加菌劑可有效增加堆層中木質(zhì)纖維素降解微生物總數(shù); 明顯提高木質(zhì)纖維素酶活性; 堆肥結(jié)束時(shí)，添加菌劑的堆肥中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別比對照提高了 31. 31%、19. 57% 和14. 33% ，其中木質(zhì)素降解主要發(fā)生在高溫期和二次發(fā)酵后期。 　　參考文獻(xiàn):　?。?］ 張曉倩，許修宏，王晶，等． 添加木質(zhì)素降解菌對堆肥中酶活性的影響 ［J］． 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào) . 2012，31 (4) :843 － 847．　?。?］ 李婉，許修宏． 外源微生物對堆肥理化性質(zhì)及酶活影響的研究 ［J］． 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29 (3) : 592 －596．　?。?］ 李國學(xué)，李玉春，李彥富． 固體廢物堆肥化及堆肥添加劑研究進(jìn)展 ［J］． 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22 (2) : 252 －256．