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1、西伯利亞白刺果實花青素成分的分析鑒定 　　西伯利亞白刺( Niraria sibirica) 是我國白刺屬植物中分布范圍最廣的一種,除西北地區(qū)外,在東北和華北地區(qū)也有分布[1 -3],具有耐干旱、耐嚴寒、耐高溫、耐鹽堿和抗風沙等特性,適應環(huán)境能力極強,果實富含花青素,其生態(tài)和資源價值成為經(jīng)濟開發(fā)的備選目標,因此有必要進行深入研究[4 -5].花青素為天然水溶性色素,屬黃酮類化合物,是植物中廣泛存在的一大類天然多酚化合物的總稱[6],主要聚集于植物的花卉、果實及有色葉片等部位.花青素作為一種天然食用色素,安全、無毒、資源豐富,具有一定營養(yǎng)和藥理作用,在

2、食品、化妝品、醫(yī)藥等方面有著巨大的應用潛力.隨著對天然產(chǎn)物活性研究的不斷進展,大量研究表明,花青素類化合物具有抗自由基、改善視力、預防心血管疾病、提高認知能力、抗腫瘤、抗突變等活性[7 -8]. 　　目前,白刺屬植物果實中花青素組分的生物學功能已經(jīng)引起了人們的關注,但針對西伯利亞白刺果實的研究尚不多.本研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法,對產(chǎn)自內(nèi)蒙古西部地區(qū)的西伯利亞白刺果實花青素成分進行了系統(tǒng)分析與鑒定,為進一步豐富對白刺屬植物資源的開發(fā)利用提供科學依據(jù). 　　1 材料和方法 　　1. 1 植物材料及試劑 　　西伯利亞白刺果實采自庫布齊沙地北緣的獨貴塔拉( 4045 N,1086

3、0 E,海拔1 060 m) 和烏蘭布和沙地南緣的吉蘭泰( 3970 N,10570 E,海拔 1 100 m) .果實于 2012 年 7 月和 8 月間,分別采集未成熟的黃色果實、半成熟的紅色果實和完全成熟的紫色果實.采集時隨機選取 3 株白刺植株,并摘取不同高度枝條上的果實,果實迅速存于保鮮箱中,使用冰袋降溫,24 h 內(nèi)轉(zhuǎn)入 -80 ℃冰箱儲存. 　　試劑: 甲醇和乙腈( 色譜級) 購自美國飛世爾公司( Fisher Scientific,USA) .甲酸( 色譜級) 購自上海安譜科技公司,三氟乙酸( TFA,色譜級) 購自德國默克公司( Merck,Darmstadt,

4、Germany) .HPLC 級水由 Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備( Millipore,Billerica,MA,USA) .分析級甲醇和甲酸購自北京化工公司.花青素標準品: 矢車菊素 3-葡萄糖苷( Cyanidin 3-O-glucoside chloride,純度≥98% ) 購自成都普思生物科技公司,用于花青素定量分析. 　　1. 2 方法 　　1. 2. 1 花青素的提取 西伯利亞白刺果實花青素的提取方法參照 Zheng 等[9]方法略修改.取西伯利亞白刺紫果、紅果以及黃果各若干,去核,勻漿,各稱取 20 g 果漿,加入 10 mL 甲醇溶液( 含 2% 甲酸) ,室溫

5、避光提取 24 h,重復3 次,合并3 次離心后的上清液,用濾紙過濾除去蛋白質(zhì)、不溶物以及多糖.再經(jīng) 0. 22 μm 尼龍有機濾膜過濾后,用于定性和定量分析. 　　1. 2. 2 花青素的定性分析 采用 Agilent 1100 LC /MSD Trap XCT plus 液質(zhì)聯(lián)用儀進行花青素定性分析.電離源類型為 ESI,選擇正離子模式全掃描和自動二級離子掃描.掃描范圍: ( m/z) 100 ~900 u;正離子模式下質(zhì)譜參數(shù)為: 以氮氣作為干燥氣和噴霧氣,干燥氣溫度 350 ℃; 氮氣流速 11. 0 L/min,霧化氣壓 35 psi; 離子化方式為 ESI + ,所用的電離電壓為

6、 +4 000 V; 毛細管出口電壓 106. 0 V; 八級射頻電壓振幅 171 Vpp; Skim 電壓 40. 0 V.色譜分析體系見 1. 2. 4. 　　1. 2. 3 花青素的定量分析 定量分析采用的HPLC 系統(tǒng)為 Waters 1525 高效液相色譜儀,系統(tǒng)配置包括: Waters 1525 泵、Waters 2998 DAD 檢測器、2707 自動進樣器.HPLC 所用色譜分析柱為 TSKgel ODS-80 Ts QA ( 150 mm × 4. 6 mm,5 μm i. d. ,Tosoh,Japan) .保護柱為 C18 柱( 10 mm ×

7、4. 6 mm,5 μm,Kromasil,Sweden) .HPLC 所用的流動相組成為: A 相為10%甲酸-水溶液( 含0. 1%TFA) ,B 相為15% 甲醇-乙腈溶液.梯度洗脫程序( B% ) : 0 min,8% ; 20 min,12% ; 30 min,9% ; 55 min,18% ; 70 min,18% ; 71 min,100% ; 81 min,100% ; 83 min,8% ;95 min,8% ; 流速 0. 8 mL / min; 柱溫 35 ℃ .檢測波長 525 nm.進樣體積 30 μL. 　　1. 2. 4 標準曲線的繪制 以矢車菊素 3-葡萄糖苷

8、( Cyanidin 3-O-glucoside chloride,Cy3G) 為半定量標準物用以建立標準曲線.稱取矢車菊素 3-葡萄糖苷標準品適量溶于 1% 鹽酸甲醇溶液中,配制成0. 32 mg / mL 的標準儲備液.取標準儲備液 0. 01,0. 02,0. 05,0. 06,0. 08,1. 00 mL 定容至 10 mL 的1% 鹽酸甲醇溶液中,配制成濃度分別為 0. 003 2,0. 006 4,0. 016 0,0. 019 2,0. 025 6,0. 032 0 mg / mL的系列標準溶液,按 1. 2. 3 所述色譜條件進行分析. 　　利用標準品建立的標準曲線為: Y(

9、 色譜峰面積) =1 419 332 490x( Cy3G 濃度) - 97 335,R = 0. 999 7,表明標準品濃度與吸光度在 0. 003 2 ~0. 032 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好.精密度分析 RSD =0. 5%,顯示儀器進樣精密度良好.將西伯利亞白刺果實樣品中測得花青素成分峰面積帶入標準曲線,花青素含量表述為每 100 g 去核鮮果中所含的毫升數(shù),所有樣品均測試 3 次. 　　1. 2. 5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用統(tǒng)計分析軟件 SAS9. 0 進行方差分析. 　　2 結果與分析 　　2. 1 花青素的鑒定 　　西伯利亞白刺果實中富含多種黃酮成分,黃酮和花青素在 2

10、70 ~ 280 nm 附近均有吸收,而花青素成分在 520 nm 附近波段為特征吸收[10],因此,采用520 nm 附近進行 DAD 掃描,可以有效識別果實提取物中的花青素,避免與黃酮混淆.西伯利亞白刺紫果 525 nm 下提取的色譜圖見圖 1. 　　 　　分析色譜峰對應的質(zhì)譜信號,結合保留時間和二級質(zhì)譜碎裂模式推測,與已有參考文獻進行比對,共識別到 12 個花青素組分,分屬 5 種花色素苷元:矢車菊素( Cyanidin,組分 1,2,8,9) 、矮牽牛素( Pe-tunidin,組分 3,5,12) 、芍藥素( Peonidin,組分 4,7,11) 、錦葵素 ( Malvidin

11、,組分 6 ) 和天竺葵素 ( Pelar-gonidin,組分 10) ( 表 1) . 　　組分 1,[M-H]-= m / z 611; MS / MS = m / z 287,與矢車菊素苷元相符,考慮出峰時間,該物質(zhì)應為矢車菊素的糖苷衍生物.中性丟失質(zhì)量 324 Da 為二糖基團.結合參考文獻,推測組分 1 為矢車菊素 3-槐糖苷( Cyanidin 3-O-sophoroside)[11].相似的,組分 4( m/z 625/301) 推測為芍藥素 3-槐糖苷( Peoni-din 3-O-sophoroside) . 　　組分 2,[M-H]-= m / z 449; MS /

12、 MS = m / z 287,為矢車菊素花青素,中性丟失質(zhì)量 162 Da,可知含有 1 個已糖基團,常見的已糖配基包括葡萄糖基( -glucoside) 和半乳糖基( -galacoside) ,現(xiàn)有信息無法確定配基,組分 2 推測為矢車菊素 3-己糖苷[12].組分 7( m/z 463/301) 與組分 2 質(zhì)譜模式相似,鑒定為芍藥素 3-己糖苷[12]. 組分 3,質(zhì) 譜 數(shù) 據(jù) ( m/z 787/641/625/479/317) ,為矮牽牛素苷元,存在 2 種碎裂方式: 787→641( - 146)→479( -162)→317( -162) ;

13、787→625( -162)→479( -146)→317( -162) ; 因此,該物質(zhì)含有2 個已糖基團和1 個戊糖基團,上述特殊的碎裂方式根據(jù)已有報道[13]推測組分 3 為矮牽牛素 3-蕓香糖-葡萄糖苷( Petunidin 3-O-rutinoside-glucose) . 　　組分 5,m/z 463/317,中性丟失質(zhì)量 146 Da,組分 6,m/z 463/331,中性丟失質(zhì)量 132 Da,分別推測為矮牽牛素 3-鼠李糖苷( Petunidin 3-O-rhamnoside)和錦葵素3-阿拉伯糖苷( Malvidin 3-O-arabinos

14、e) ,后者為白刺屬植物果實花青素成分中首次報道. 　　組分 8 與組分 9,[M-H]-= m / z 757,MS / MS =m / z 287,皆為矢車菊素苷元,分子量相同且保留時間接近,推測為一對同分異構體[14].根據(jù)丟失質(zhì)量470 Da = 324 + 146,結合洗脫時間分析,推測該物質(zhì)含有 2 個已糖和 1 個香豆酸基團[9],二糖基團因被?；?MS/MS 條件下易從苷元上完整脫落,獲得單一產(chǎn)物離子碎片[15].互為異構的?；ㄇ嗨刂?順式構型的極性強于反式構型,故其保留時間更短[16 -17],因此,組分 8 推斷為矢車菊素 3-順式-香豆酰二 葡 萄 糖 苷 ( C

15、yanidin 3-O-( cis-p-coumaroyl) -diglucoside) ,組分 9 指認為矢車菊素 3-反式-香豆酰二葡 萄 糖 苷 ( Cyanidin 3-O-( trans-p-coumaroyl) -diglucoside) . 　　組分 10,MS/MS = m/z 271,為天竺葵素衍生物,組分 12 MS/MS =317,為矮牽牛素衍生物,兩組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)均與組分 8、9 相似,據(jù)此可以推斷兩物質(zhì)同樣含有 2 個已糖基和 1 個香豆酸作為酰化基團[18],因未找到對應異構體,不足以確認順反構型,故指認為天竺葵素 3-香豆酰二葡萄糖苷( Pelargoni-din

16、 3-O-( p-coumaroyl) -diglucoside) 和矮牽牛素 3-香豆酰 二 葡 萄 糖 苷 ( Petunidin 3-O-( p-coumaroyl) -diglucoside) . 　　組分 11,[M-H]-= m / z 549,MS / MS = m / z301,丟失質(zhì)量為 248 Da,根據(jù)洗脫順序和碎裂方式推測為芍藥素3-丙二酰葡萄糖苷( Peonidin 3-O-mal-onyl-glucoside)[19],這也是花青素丙二酰基衍生物在白刺屬植物果實中的首次報道. 　　2. 2 花青素含量的測定 　　通過矢車菊素 3-葡萄糖苷標準品對各樣品中花青素

17、進行半定量分析,獲得各組分相對含量,結果見表 2. 　　 　　由表 2 可見,每 100 g 吉蘭泰、獨貴塔拉的西伯利亞白刺紫果樣品花青素總含量分別為 45. 83 mg和 40. 12 mg,矢車菊素苷元衍生物在所識別 5 種苷元中數(shù)量最多,吉蘭泰紫果樣品中矢車菊素占花青素總含量的 70. 4%,獨貴塔拉樣品中占 85. 6%; 芍藥素花青素含量比例為 15. 4% ( 吉蘭泰) 和 6. 68%( 獨貴塔拉) ; 矮牽牛素花青素含量比例為 11. 6%( 吉蘭泰) 和 5. 1% ( 獨貴塔拉) ; 天竺葵素和錦葵素花青素各有 1 種,含量比例均低于 2%.在花色素母核取代方式上,?；?/p>

18、化形式比單純糖基取代方式占優(yōu)勢,在所測定的 12 種花青素成分中,?；煞钟?5 種,含量占花青素總含量的 65. 7% ( 吉蘭泰)和 80. 0%( 獨貴塔拉) .上述特征最突出的代表是矢車菊素 3-反式-香豆酰二葡萄糖苷( Cyanidin 3-O-( trans-p-coumaroyl) -diglucoside) ,該組分在西伯利亞白刺果實 3 個成熟階段含量均為最高.隨著果實的成熟,果實顏色逐漸加深,花青素含量也顯著增高,采自吉蘭泰的紫色果實中花青素總量是黃色果實的 30 倍,是紅色果實的 3 倍,采自獨貴塔拉的紫色果實中花青素含量是黃色果實的 18 倍,是紅色果實的近 4 倍.

19、質(zhì)譜指認的 12 種花青素組分均可在紫色果實中測得,而在紅色和黃色果實中花青素組分數(shù)目遞減. 　　花青素的大量積累可能與西伯利亞白刺特殊的生境條件有關[20].果實轉(zhuǎn)色到成熟階段正值夏季,日照強烈,紫外線對果實組織的損傷較重.花青素的積累能夠增強果實組織對紫外線脅迫的耐受能力.本研究中西伯利亞白刺果實花青素總含量低于柴達木盆地唐古特白刺,其中矢車菊素 3-反式-香豆酰二葡萄糖苷測得的含量每 100 g 達 215 mg[9],為本研究中含量的近 8 倍,兩種白刺屬間果實花青素含量的差異可能受物種和分布地域等多方面的影響.本研究通過多因素方差分析對成熟階段和采集點 2 個因素進行了探討,結果見

20、表 3.　　 　　方差分析反映了 2 個地點、3 個成熟階段對花青素組分含量的影響,結果顯示,西伯利亞白刺花青素不同組分間含量有顯著性差異( P =0.002 0) ,不同顏色果實的花青素含量有顯著性差異( P =0. 002 7) ,而 2 個采樣地之間花青素含量無顯著性差異( P =0. 558 8) ,這可能是由于采樣地處于相近緯度,對花青素合成影響較為明顯的光照因素差異有限造成的,對花青素含量和組成的深入分析需要進一步擴大采集的范圍,而未來比較同一地點采集的不同種白刺將有助于分析物種間差異對花青素含量的影響. 　　3 討論 　　西伯利亞白刺作為白刺屬植物中分布范圍較廣的一種,在中

21、國東北、西北、華北多個省區(qū)市均有分布,具有廣泛的適應性[1],在資源植物選育開發(fā)和抗逆生物學機理等方面都具有研究價值[21].現(xiàn)有白刺屬植物的花青素研究較多針對唐古特白刺,對西伯利亞白刺的重視不夠[3].HPLC-ESI-MS/MS 是植物提取物組分識別和結構鑒定的有力工具,本研究通過液質(zhì)聯(lián)用手段結合已有報道,定性了內(nèi)蒙古西部兩地點采集的西伯利亞白刺 3 個成熟階段的果實中 12 種花青素成分,并對各成分進行了半定量分析.結果顯示,西伯利亞白刺果實花青素組分包括5 種常見苷元,取代類型豐富,?；腔〈贾鲗?同時存在單糖基取代和多糖基取代,不同組分間含量有顯著差異; 在果實成熟的 3 個階段

22、花青素含量變化明顯且受地點的影響不顯著.針對西伯利亞白刺廣泛分布的特點,在今后的研究中應選取更多采樣點對西伯利亞白刺中花青素等活性成分進行分析,從而充分挖掘和實現(xiàn)這一資源植物的經(jīng)濟和生態(tài)價值. 　　參考文獻: 　　[1] 潘曉云,小 平,秋 實,等. 多倍化-白刺屬的系統(tǒng)分類、進化特征及應用前景[J]. 植物學通報,2003,20( 5) : 635 -638. 　　[2] 楊秀艷,張華新,唐 欣,等. 我國白刺植物資源及其開發(fā)利用[J]. 世界林業(yè)研究,2013,26( 5) : 63 -68. 　　[3] 潘曉玲,沈觀冕,陳 鵬. 白刺屬植物的分類學及系統(tǒng)學研究[J]. 云南植物研

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