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1、檸條酶解糖化的預(yù)處理方法 檸條酶解糖化的預(yù)處理方法 2015/04/23 1材料與方法 1.1試驗(yàn)材料(1)原料原料來(lái)自于寧夏固原的5年生檸條的平茬廢棄物，經(jīng)自然曬干、粉碎后過(guò)10目與20目標(biāo)準(zhǔn)篩，選擇粒徑介于0.85～2mm之間的粉末作為實(shí)驗(yàn)材料。(2)菌種微生物菌種選用模式菌黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，屬絲狀白腐真菌。(3)纖維素酶纖維素酶(固體)由寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司惠贈(zèng)，經(jīng)測(cè)

2、定其總纖維素酶活性(以濾紙為底物測(cè)定，pH4.8)約為64FPU/g。(4)培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基。檸條培養(yǎng)基按檸條︰自來(lái)水為1︰1.5(質(zhì)量/體積比，m/v)的比例向檸條中加入自來(lái)水?dāng)嚢杈鶆蛑瞥桑?21℃滅菌30min。 1.2試驗(yàn)方法(1)堿處理堿處理采用0.1%～5%的NaOH溶液以1︰20固液比在100℃下處理15min，用蒸餾水對(duì)照。處理后用200目濾布過(guò)濾，收集濾液用H2SO4調(diào)節(jié)pH值至中性并測(cè)定濾液中還原糖含量，濾渣用自來(lái)水沖洗至中性后烘至恒重。(2)酸處理酸處理采用0.025%～1%的硫酸以1︰20固液比在120℃下處理1h，用蒸餾水做對(duì)照。處理后用200目濾布過(guò)濾，收集濾液

3、用NaOH調(diào)節(jié)pH至中性并測(cè)定濾液中還原糖含量，濾渣用自來(lái)水沖洗至中性后烘至恒重。(3)微生物處理將菌種接種至PDA培養(yǎng)基上于28℃活化5～7天，活化后采用固體接種的方法挑取直徑為2～3mm的菌苔接種到檸條培養(yǎng)基上，每瓶接10塊。接種后置于28℃培養(yǎng)，分別在第3～6周取樣，于105℃干燥4h。(4)酶解糖化采用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.8)于50℃溶解固體纖維素酶，酶濃度為1.25g/mL。稱取0.160g預(yù)處理前后的樣品，按每克生物質(zhì)20FPU加入纖維素酶酶液，并用于pH值為4.8的醋酸－醋酸鈉緩沖液補(bǔ)充至反應(yīng)體系總體積為8mL，于48℃靜置酶解48h后用定性濾紙過(guò)濾，棄濾渣，采用DNS法

4、［13］測(cè)定濾液中還原糖含量。(5)木質(zhì)纖維素含量測(cè)定參照NＲEL的方法［14］測(cè)定纖維素、酸不溶木質(zhì)素(AIL)、酸溶性木質(zhì)素(L)和木質(zhì)素(AIL+L)含量，半纖維素含量采用中性洗滌纖維及酸性洗滌纖維法［15］測(cè)定。(6)轉(zhuǎn)化率與總還原糖得率的計(jì)算濾渣酶解糖化情況用轉(zhuǎn)化率表示，以酶解轉(zhuǎn)化出的還原糖質(zhì)量占酶解前生物質(zhì)質(zhì)量百分比表示，轉(zhuǎn)化率/%=酶解轉(zhuǎn)化的還原糖質(zhì)量酶解前稱取的樣品質(zhì)量100%總還原糖包含酸/堿水解出的還原糖及酶解產(chǎn)糖，以酸/堿水解產(chǎn)生的還原糖與酶解轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的還原糖質(zhì)量之和占酶解前生物質(zhì)質(zhì)量百分比表示，總還原糖利率/%=(酸/堿水解產(chǎn)生的還原糖質(zhì)量+酶解轉(zhuǎn)化的還原糖質(zhì)量)酶解前

5、稱取的樣品質(zhì)量100% 1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析方法采用Excel和SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(MSE)表示，對(duì)不同預(yù)處理的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)Duncan檢驗(yàn)比較差異，不同處理間的差異(p＜0.05)以小寫(xiě)字母表示。 2結(jié)果與分析 2.1不同預(yù)處理后樣品質(zhì)量損失和酶解轉(zhuǎn)化效率變化預(yù)處理是生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用的必要手段，其主要目的是通過(guò)預(yù)處理破壞木質(zhì)纖維素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，降低纖維素結(jié)晶度，提高纖維素酶的效率［16］。預(yù)處理過(guò)程中，不同方式對(duì)酶的催化作用有著不同的效果，酶解轉(zhuǎn)化效率能有效表征不同樣品對(duì)纖維素酶的敏感程度。轉(zhuǎn)化率反映了單位質(zhì)量生物質(zhì)酶解釋放可發(fā)酵糖的能力，因

6、此以轉(zhuǎn)化率表示不同預(yù)處理方法對(duì)生物質(zhì)的改性程度。為了評(píng)價(jià)3種預(yù)處理方法對(duì)檸條酶解效果的差異，比較了預(yù)處理前后檸條的轉(zhuǎn)化率變化情況，同時(shí)考查了預(yù)處理對(duì)樣品重量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1～3。經(jīng)不同濃度稀H2SO4處理的樣品失重率與酶解轉(zhuǎn)化率如圖1所示。由圖1可以看出，稀硫酸處理導(dǎo)致檸條重量損失顯著，樣品失重率隨稀H2SO4濃度增加呈上升趨勢(shì)，硫酸處理后固體殘?jiān)拿附廪D(zhuǎn)化率與硫酸濃度無(wú)顯著相關(guān)性。稀硫酸能夠有效去除木質(zhì)纖維素中的半纖維素成分，因此0.1%H2SO4處理即可引起檸條失重率達(dá)15.1%，處理程度增加也會(huì)導(dǎo)致部分纖維素組分的水解，1%硫酸處理時(shí)失重率達(dá)到40.8%。從酶解轉(zhuǎn)化率來(lái)看，一定濃度的稀

7、硫酸預(yù)處理雖然能夠促進(jìn)檸條酶解糖化，但對(duì)檸條酶解效率的提高幅度不大，小于0.5%的硫酸處理時(shí)，酶解效率隨硫酸濃度增加而升高;經(jīng)0.5%H2SO4處理后的固體殘?jiān)附庑侍岣咦铒@著，酶解轉(zhuǎn)化率比對(duì)照提高了20.3%;但隨著硫酸濃度進(jìn)一步提高，半纖維素被消化的越多，固體殘?jiān)心举|(zhì)素含量相對(duì)升高，不利于酶解，酶解效率反而降低。因此，0.5%H2SO4是檸條酸法預(yù)處理的適宜濃度。經(jīng)不同濃度NaOH處理的樣品失重率與酶解轉(zhuǎn)化率變化如圖2所示。從失重率的變化可以看出，隨著NaOH濃度的升高檸條失重率逐漸升高，當(dāng)NaOH濃度提高至2.5%時(shí)，繼續(xù)提高NaOH處理的濃度，檸條的失重率基本維持不變。轉(zhuǎn)化率隨Na

8、OH處理濃度的變化顯示，堿處理能夠顯著提高檸條酶解轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率隨堿用量增加而持續(xù)升高，5%NaOH處理后的檸條酶解轉(zhuǎn)化率最高，比未經(jīng)處理的原材料提高了147.3%，達(dá)13.6%。經(jīng)黃孢原毛平革菌處理不同時(shí)間的樣品失重率與酶解后還原糖轉(zhuǎn)化率如圖3所示。由圖3可知，白腐真菌處理后檸條平茬廢棄物的失重率持續(xù)升高，最高為處理6周的樣品，失重率達(dá)42.4%;酶解轉(zhuǎn)化率也均顯著高于對(duì)照，最高的是處理6周的樣品，比未經(jīng)處理的原料提高了48.6%，其次是處理3周的樣品提高了38.1%。因此，白腐真菌處理6周是檸條平茬廢棄物微生物法預(yù)處理的適宜時(shí)間。綜合比較圖1～3可以發(fā)現(xiàn)，從處理后固體殘?jiān)拿附廪D(zhuǎn)化效率來(lái)看

9、，三種預(yù)處理方法對(duì)酶解效率的影響程度順序是:堿＞白腐真菌＞酸;其中，5%NaOH處理后樣品的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)13.6%，比原材料提高了147.3%。 2.2預(yù)處理前后檸條的木質(zhì)纖維素含量為探究各樣品酶解轉(zhuǎn)化率提高的關(guān)鍵因素，進(jìn)一步測(cè)定了原料和經(jīng)不同預(yù)處理后樣品的木質(zhì)纖維素成分，各組成分含量見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，檸條平茬廢棄物的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素等3種主要成分占90%以上，近似于木材，其中半纖維素含量最高達(dá)34.1%，其次是木質(zhì)素32.7%。檸條中的可轉(zhuǎn)化底物(纖維素與半纖維素)含量略高于玉米(Zeamayz)秸稈［17］，具有潛在的能源化利用價(jià)值。檸條為多年生灌木樹(shù)種，其木質(zhì)素含量遠(yuǎn)高

10、于1年生的玉米秸稈，也高于多年生常綠樹(shù)種毛竹(Phyllostachysheterocyclacv.pubescens)［18］，不利于可轉(zhuǎn)化底物的釋放和利用，這是檸條作為飼料的利用率低下的關(guān)鍵原因。檸條的高木質(zhì)素含量可能與檸條生長(zhǎng)在干旱半干旱的環(huán)境有關(guān)，研究表明干旱脅迫時(shí)植物可以通過(guò)提高木質(zhì)素含量來(lái)減少水分損失，抵御干旱帶來(lái)的不利影響。2#和3#為硫酸處理后的樣品，硫酸處理后檸條中的纖維素和木質(zhì)素含量升高，而且隨著處理強(qiáng)度增加，硫酸對(duì)纖維素的水解程度增加，半纖維素含量顯著降低，其中樣品3#的半纖維素含量最低，為2.4%，比對(duì)照降低了93.0%，說(shuō)明0.5%硫酸處理已經(jīng)基本完全除去了檸條中的半

11、纖維素，進(jìn)一步增加硫酸濃度對(duì)預(yù)處理效果影響不大。4#～6#為堿處理的樣品，經(jīng)堿處理后，檸條中纖維素含量顯著升高，酸不溶性木質(zhì)素AIL含量顯著降低，其中，樣品6#的纖維素含量最高，達(dá)50.2%，AIL木質(zhì)素含量最低，為21.0%，說(shuō)明2.5%NaOH處理能夠有效去除檸條中木質(zhì)素，導(dǎo)致纖維素含量相對(duì)增加。經(jīng)白腐真菌處理后，纖維素和半纖維素含量均降低，說(shuō)明白腐真菌降解檸條中的纖維素與半纖維素來(lái)獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);L含量顯著高于所有處理后樣品及原料，說(shuō)明白腐真菌能使檸條木質(zhì)素顯著改性，該過(guò)程主要是以微生物胞外酶為主導(dǎo)的酶促反應(yīng)，條件溫和，速度緩慢。不同預(yù)處理后檸條中的半纖維素含量均顯著降低，L含量均有所增加

12、，說(shuō)明檸條中的半纖維素比較容易被破壞，不同預(yù)處理均能改性木質(zhì)素。結(jié)合不同預(yù)處理后酶解轉(zhuǎn)化率和主要成分的變化情況可以發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理后木質(zhì)素的脫除與改性是提高檸條酶解效率的關(guān)鍵因素。 2.3不同預(yù)處理樣品的總還原糖得率除酶解轉(zhuǎn)化率外，樣品的質(zhì)量損失在預(yù)處理方法評(píng)價(jià)中也是需要考慮的重要因素，因?yàn)閹缀跛械哪举|(zhì)纖維素預(yù)處理方法都無(wú)法避免樣品質(zhì)量損失，造成可轉(zhuǎn)化底物的流失?？傔€原糖得率以預(yù)處理前生物質(zhì)質(zhì)量為基礎(chǔ)，綜合考慮預(yù)處理后從液體部分和固體部分酶解所獲取的總還原糖量?？傔€原糖得率的計(jì)算過(guò)程引入了預(yù)處理引起的質(zhì)量損失，能夠從可轉(zhuǎn)化物質(zhì)產(chǎn)出的角度綜合評(píng)價(jià)不同預(yù)處理方法。稀硫酸處理樣品后，半纖維素(主要多

13、糖是木聚糖)被水解生成單糖和可溶性低聚糖［20］，因此水解液中會(huì)含有木糖等還原糖，經(jīng)稀H2SO4處理后總還原糖得率需要同時(shí)考慮水解液中糖得率和濾渣經(jīng)酶解后糖得率。收集水解液用DNS法測(cè)其中還原糖含量并根據(jù)處理前樣品質(zhì)量計(jì)算水解液中還原糖得率，結(jié)果見(jiàn)圖5(A)。由圖5(A)可知，稀硫酸處理水解液中還原糖得率也隨H2SO4濃度增大而增加。H2SO4濃度從0.1%增加到0.5%時(shí)，水解液中還原糖得率增加顯著;當(dāng)H2SO4濃度達(dá)到0.5%以后，繼續(xù)增加其濃度，水解液中還原糖得率提高不大。結(jié)果表明，當(dāng)H2SO4濃度達(dá)到0.5%時(shí)，增大其濃度樣品中基本無(wú)還原糖繼續(xù)釋放，可能是因?yàn)樵诖颂幚頋舛认掳肜w維素已經(jīng)

14、基本水解完全，繼續(xù)增加處理強(qiáng)度只能引起部分纖維素非結(jié)晶區(qū)的水解。合并H2SO4處理后水解液中還原糖得率和濾渣經(jīng)酶解后的還原糖得率，即為不同濃度稀H2SO4處理后的總還原糖得率，結(jié)果見(jiàn)圖5(B)。由圖5(B)可知，當(dāng)H2SO4濃度在0～0.5%之間時(shí)，增加其濃度，所對(duì)應(yīng)的總還原糖得率也隨之增大而且增加速度較快;當(dāng)H2SO4濃度大于0.5%時(shí)，繼續(xù)增加H2SO4濃度，總還原糖得率變化不顯著。H2SO4濃度為0.5%時(shí)總還原糖得率最高，為17.9%，是未處理原料的3.3倍。經(jīng)NaOH處理后，濾液中主要為木質(zhì)素水解的產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)定其中基本不含有糖類物質(zhì)，因此，堿處理樣品的總還原糖全部來(lái)源于處理后濾渣用纖

15、維素酶水解產(chǎn)生的糖，總還原糖得率見(jiàn)圖6。由圖6可知，0.5%～5.0%NaOH處理能有效提高檸條的總還原糖得率，濃度為0.5%和1%NaOH處理后樣品的總還原糖得率最高，達(dá)8.5%，比對(duì)照提高了55.6%;其次是經(jīng)濃度為5%和2.5%NaOH處理后的樣品。白腐菌處理后樣品總還原糖得率變化情況見(jiàn)圖7。由圖7可以看出，白腐菌處理3周的樣品總還原糖得率最高，為5.8%，但與對(duì)照相比沒(méi)有顯著性差異;延長(zhǎng)生物處理時(shí)間到4～6周后，總還原糖得率降低且顯著低于未經(jīng)處理的對(duì)照樣品。這可能是由于白腐菌在破壞生物質(zhì)結(jié)構(gòu)的過(guò)程中，通過(guò)分泌胞外纖維素酶水解其中的纖維素，獲得葡萄糖作為碳源和能源，導(dǎo)致處理后樣品的可水解

16、底物減少，致使總還原糖得率不斷降低。綜合分析比較圖5～7可知，3種預(yù)處理方法對(duì)于檸條平茬廢棄物總還原糖得率的影響程度排序是，酸＞堿＞白腐真菌;其中，0.5%H2SO4處理后總還原糖得率最高，可達(dá)17.9%，比未處理原料提高2.3倍。 3結(jié)語(yǔ) 檸條是適宜于北方和西北干旱半干旱地區(qū)培育的灌木樹(shù)種［2］，富含纖維素和半纖維素，具有較高的飼用價(jià)值，亦可作為干旱地區(qū)的特色能源原料。但是，檸條中木質(zhì)素含量高，對(duì)外界因素的抗逆性強(qiáng)，不利于可轉(zhuǎn)化底物的釋放和充分利用，需要尋求有效的方式進(jìn)行預(yù)處理以提高檸條的利用率，拓展其應(yīng)用范圍。本項(xiàng)研究表明，稀硫酸處理后檸條的總還原糖得率是原料的3.3倍，預(yù)處理效果最好

17、，顯著高于堿法和微生物法。硫酸處理后水解液中釋放出大部分的半纖維素來(lái)源的糖，固體殘?jiān)拿附庑室嘤兴岣?，酶解后殘?jiān)饕獮槟举|(zhì)素，熱值高，可作燃料，也可開(kāi)發(fā)出其它高附加值產(chǎn)品。此外，測(cè)試表明檸條偏酸性，有利于酸處理過(guò)程中減少酸用量，但堿處理時(shí)用堿量大。因此，從可轉(zhuǎn)化底物的獲取來(lái)看，稀硫酸處理是檸條平茬廢棄物最佳的預(yù)處理方式。本研究從能源底物釋放方面比較了幾種預(yù)處理方式并獲得了最適宜的方法為稀硫酸預(yù)處理，但尚未涉及其工藝條件的優(yōu)化，后續(xù)稀硫酸預(yù)處理的工藝優(yōu)化及復(fù)合預(yù)處理方式促進(jìn)檸條能源化利用的研究正在進(jìn)行。在飼料領(lǐng)域，消化率低下是導(dǎo)致檸條作為飼料利用量小的直接原因［6］，堿處理和白腐真菌預(yù)處理均能有效提高檸條的酶解效率，因此可以考慮在檸條貯存過(guò)程中引入微生物和堿來(lái)提高檸條的利用效率。采用微生物處理通過(guò)菌種酶系的作用降解與改性檸條中木質(zhì)纖維素成分，結(jié)合堿法處理能夠有效地脫除檸條中的木質(zhì)素，不但能夠提高檸條在動(dòng)物體內(nèi)的消化率，而且有利于改善檸條的適口性，增加其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。 作者：徐春燕姚福軍張娜單位：寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上一個(gè)文章： 紅蠟蚧風(fēng)險(xiǎn)探析下一個(gè)文章： 典型植被林冠結(jié)構(gòu)比較思考