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1、第二節(jié) 免疫分析方法及其應(yīng)用 一 放射免疫分析法 利用放射性核素可探測的靈敏性，精確性與抗原抗體 反應(yīng)的特異性相結(jié)合而創(chuàng)建的一類免疫測定技術(shù)。 1. 基本類型和原理 競爭性結(jié)合反應(yīng)：放射免疫分析 (RIA） -以放射核素標(biāo) 記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記的抗原競爭特異性抗體 的基本原理來測定待檢樣品中抗原量的分析方法。 非競爭性結(jié)合反應(yīng)：免疫放射分析 (IRMA) 用放射性核 素標(biāo)記的過量抗體非競爭結(jié)合抗原，經(jīng)固相分離， 測定待測樣品中抗原量的分析方法。 2.常用的放射性核素 125I、 131I、 3H、 14C。 3. 標(biāo)記物的制備及鑒定 標(biāo)記物：是指通過直接或間接的化學(xué)反應(yīng)將放射性核 素連接到

2、被標(biāo)記分子上鎖形成的化合物。 要求：高比度、高純度、完整的免疫活性、不能破壞 抗原決定簇。 直接標(biāo)記法（鉻氨酸殘基和組氨殘基） 間接標(biāo)記法（聯(lián)接標(biāo)記，引入添加基團(tuán)） 標(biāo)記物的純化：采用分離的方法 離子交換層析法。 標(biāo)記物的鑒定：放射化學(xué)純度、免疫活性、比放射性 （計算法和自身置換法）。 4. 放射免疫分析 一、原理： Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag * Ag和 Ab量恒定， Ag的量為一個系列 濃度。 競爭結(jié)合 抗原抗體復(fù)合物與標(biāo)準(zhǔn)抗原的關(guān)系 * AgAb復(fù)合物的量取決于 Ag的量 Ag量越大， * AgAb量越少 Ag量越小， * AgAb量越大

3、 測量 * AgAb量或測量多余 * Ag量可推 算出 Ag量 二 . 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以 * AgAb的放射性強(qiáng)度與 * Ag的放射性強(qiáng)度 的比值或以 * AgAb的放射性強(qiáng)度與總放射性 強(qiáng)度的比值作縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度為橫坐 標(biāo)做曲線，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在同樣條件下測定樣品，計算出抗原抗體復(fù) 合物的放射性強(qiáng)度與總放射性強(qiáng)度的比值， 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出待測抗原的量。 二、測量步驟 恒量的 * Ag、 Ab加入反應(yīng)管中 加入待測樣品、或標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度） 37 或 4 溫育 加入分離劑分離結(jié)合及游離部分 測定以總放射性為分母，測定 * AgAb 為分 子，計算結(jié)合 %，以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，濃度

4、為坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 待測樣品的結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度 0 2 4 8 16 32 64 128 80 7 0 6 0 5 0 40 30 20 10 結(jié) 合% 濃 度 二 . 免疫放射分析方法 單位點 IRMA：先將過量的標(biāo)記抗體與待測抗原進(jìn)行 反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后，用固相 抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩余的游離標(biāo)記抗體，然后進(jìn)行 分離，測定抗原抗體復(fù)合物的放射量。 雙位點 IRMA：先用固相抗體與抗原反應(yīng)，然后再用 過量的標(biāo)記抗體與已結(jié)合于固相抗原的另外一個抗 原決定簇結(jié)合，形成抗體 -抗原 -標(biāo)記抗體復(fù)合物，分 離出剩余的標(biāo)記抗體，測定固相上的放射性。 IRMA與 RIA的比較

5、對表項目 RIA IRMA 反應(yīng)原理 競爭性結(jié)合 非競爭性結(jié)合 反應(yīng)參數(shù)與待 檢抗原的關(guān)系 呈反比 呈正比 標(biāo)記物 抗原 抗體 反應(yīng)速率 較慢 高 特異性 較高 高 靈敏度 較高 高 二 . 熒光免疫分析方法 熒光免疫技術(shù)是以熒光素標(biāo)記的特異性抗體 或抗原作為試劑，用于相應(yīng)抗體或抗原的分 析鑒定和定量測定，主要有熒光抗體染色技 術(shù)和熒光免疫測定兩種類型。 非均相熒光免疫測定法：需要分離抗原抗體 復(fù)合物和剩余的標(biāo)記物，然后測定復(fù)合物或 剩余標(biāo)記物的量，從而計算出標(biāo)本中的抗原 量。 均相熒光免疫測定法：不需要分離復(fù)合物與 剩余標(biāo)記物，直接測定剩余的標(biāo)記物的量， 計算出標(biāo)本中的抗原量。 一、分子發(fā)光

6、分析法及其分類 某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍 遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)， 這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來的 分析方法為分子發(fā)光分析法 較高激發(fā)態(tài) 基 態(tài) 吸收能 量受激 光輻射 退激 分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量 熒光的產(chǎn)生 根據(jù)分子受激時所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同 分為以下幾類： 光致發(fā)光：以 光源 來激發(fā)而發(fā)光 電致發(fā)光：以 電能 來激發(fā)而發(fā)光 原子發(fā)射光譜法 生物發(fā)光：以 生物體釋放的能量 激發(fā)而發(fā)光 化學(xué)發(fā)光：以 化學(xué)反應(yīng)能 激發(fā)而發(fā)光 化學(xué)發(fā)光分 析法 熒光 熒光分析法 磷光 磷光分析法 熒光效率：發(fā)射熒光的光量子數(shù)與吸收光 的光量

7、子數(shù)的比值 熒光淬滅：處于激發(fā)態(tài)的電子不能回 復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量不能以熒光 的形式發(fā)射。 熒光素：具有光致熒光特性的染料。 時間分辨熒光免疫測定法 以鑭系元素螯合物標(biāo)記抗體或抗原，利用熒光發(fā)射 體熒光壽命差別而將波長相同的熒光分開的技術(shù)。 原理：鑭系元素與螯合物絡(luò)合，再與抗原或抗體結(jié) 合，加入熒光增強(qiáng)劑，紫外光照射激發(fā)出熒光，進(jìn) 而測定。 主要類型； 固相雙位點夾心法：待測物與固相抗體反應(yīng)后，再 加入 Eu3+標(biāo)記抗體反應(yīng)，生成 Eu3+標(biāo)記抗體 -抗原 -固 相抗體復(fù)合物，所測熒光強(qiáng)度與待測物濃度呈正比。 固相抗原競爭法 :將大分子抗原包被在固相上成為固 相抗原，固相抗原與待測抗原共同競

8、爭限量的 Eu3+ 標(biāo)記抗體，待測抗原濃度越高，固相抗原結(jié)合的標(biāo) 記抗體就越小，所測熒光強(qiáng)度與待測物濃度呈反比。 固相抗體競爭法 待測抗原和 Eu3+標(biāo)記抗原與固相抗體發(fā)生競爭性結(jié) 合，分離剩余的 Eu3+標(biāo)記抗原與 Eu3+標(biāo)記抗原抗體 復(fù)合物，在固相中加入增強(qiáng)劑，測定復(fù)合物的熒光 強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待測抗原濃度呈反比。 TR-FIA的特點：鑭系元素螯合物熒光壽命很長； 激發(fā)光與熒光的波長差別顯著。 應(yīng)用： 熒光偏振免疫測定法 利用物質(zhì)分子在溶液中旋轉(zhuǎn)速度與分子大小呈反比 的特點對熒光抗體進(jìn)行檢測的技術(shù)。 原理：熒光素標(biāo)記抗原和待測抗原與抗體發(fā)生競爭 結(jié)合反應(yīng)，當(dāng)標(biāo)記抗原與相應(yīng)抗體的量恒定時，

9、反 應(yīng)平衡時結(jié)合狀態(tài)的標(biāo)記抗原量與待測抗原呈反比。 熒光偏振的強(qiáng)度與抗原濃度呈反比。以抗原濃度為 橫坐標(biāo)，熒光偏振強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，建立關(guān)系。 1971年瑞典學(xué)者 Engvail和 Perlmann,荷 蘭學(xué)者 Van Weerman和 Schuurs分別報道將免 疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免 疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。 ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng) 域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分 析方法，是在免疫酶技術(shù) ( immunoenzymatic techniques ) 的基礎(chǔ)

10、 上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù) 。 酶聯(lián)免疫分析法 一、基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待 測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生 顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象 可以是抗體也可以是抗原。 在這種測定方法中有 3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（ 免疫吸附劑） 酶標(biāo)記的抗原或抗體（ 標(biāo)記物） 酶作用的底物（ 顯色劑） 測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上， 但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原） 與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保 留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體 上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后， 再加上酶 的相應(yīng)底 物，即起 催化水解 或氧化還 原反應(yīng)而 呈顏

11、色。 其所生成的顏色深淺與 欲測的抗原（抗體）含量成 正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、 光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀 察，也可以用分光光度計 （酶標(biāo)儀）加以測定。 其方法簡單，方便迅速， 特異性強(qiáng)。 二、酶及其底物 酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原 , 半抗原 在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是 ELISA成敗 的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的 免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物 放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ， 將得到不同的顏色反應(yīng) . 酶 底 物 顯色 反應(yīng) 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺 四甲替聯(lián)苯胺 氨基水楊酸 鄰聯(lián)苯甲胺 2,2-連胺基 -2(3-乙基 -并噻 唑啉磺酸 -6)銨鹽 橘紅

12、色 黃色 棕色 蘭色 藍(lán)綠色 492 460 449 425 642 堿性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸鹽 (PNP) 萘酚 -AS-Mx磷酸鹽 +重氮鹽 黃色 紅色 400 500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖 +甲硫酚嗪 +噻唑蘭 黃色 深藍(lán)色 405 420 -半乳糖 苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷 (4MuG) 硝基酚半乳糖苷 (ONPG) 熒光 黃色 360,450 420 ELISA的種類和變化 （一）雙抗體夾心法 （二）間接法 （三）競爭法 （四）雙位點一步法 （五）捕獲法測 IgM抗體 （六）應(yīng)用親和素和生物素的 ELISA （一）雙抗體夾心法 此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等

13、大分子抗原 獲得待分析物的未標(biāo)定抗體 將特異性抗體與固相 載體連接形成固相抗體 洗滌除去未結(jié)合的 抗體及雜質(zhì) 加入封閉蛋白溶液以封閉載體 表面殘留的蛋白結(jié)合位點 洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白 加受檢標(biāo)本（抗原）形成 固相抗體抗原復(fù)合物 洗滌除去其他 未結(jié)合的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗體生成 抗體 待測抗原 酶標(biāo)記抗體 的復(fù)合物 徹底洗滌 未結(jié)合的 酶標(biāo)抗體 加底物進(jìn)行 酶催化反應(yīng) 根據(jù)顏色反應(yīng)的 程度進(jìn)行該抗原 的定性或定量測定 間接法是檢 測抗體最常用的方 法，其原理為利用 酶標(biāo)記的抗體以檢 測已與固相結(jié)合的 受檢抗體，故稱為 間接法。 （二）間接法 包被固相載體 : 用已知抗原包被 固相載體 加待檢標(biāo)本

14、 : 使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合 洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗抗體 : 與固相載體上抗原抗體 復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去 未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體 加底物 顯色 根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行 該抗原的定性或定量測定 （三）競爭法 此法可用于抗原和半抗原的定 量測定，也可用于測定抗體 。 用已知特異性 抗體包被 固相載體 測定管加待測抗原和 一定量的酶標(biāo)抗原使二者與 固相抗體競爭結(jié)合 對照管只加一定量酶標(biāo)抗原 與固相抗體直接結(jié)合 分別洗滌 除去未結(jié)合 的成分 加底物顯色 分別測定兩管的吸光度值， 根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比， 計算標(biāo)本中待測抗原含量 對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固 相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯

15、色深； 測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶 標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而 異。如待測抗原量多，競爭性地抑制 酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上 結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入 底物后顯色反應(yīng)較弱。 （ 4） 雙位點一步法 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的 單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時可使標(biāo)本的加入和酶 標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng) 時間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。 單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的 ELISA提高到新水平。 五）捕獲法測 IgM抗體 血清中針對某些抗原的特

16、異性 IgM常和特異性 IgG同時存在，后者會干 擾 IgM抗體的測定。因此測定 IgM抗體多用捕獲法，先將所有血清 IgM （包括異性 IgM和非特異性 IgM）固定在固相上，在去除 IgG后再測定 特異性 IgM.操作步驟如下： （ 1）將抗人 IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人 IgM.洗滌。 （ 2）加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后，血清中的 IgM抗體被固相抗 體捕獲。洗滌除去其他 免疫球蛋白 和血清中的雜質(zhì)成分。 （ 3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性 IgM結(jié)合。洗滌。 （ 4）加入針對特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng) 結(jié)合。洗滌。 （ 5）加底物顯色

17、：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性 IgM抗 體存在，是為陽性反應(yīng)。 （六）應(yīng)用親和素和生物素的 ELISA 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量 60kD,每 個分子由 4個亞基組成，可以和 4個生物素分子親密結(jié)合。 現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素 （ strepavidin）。生物素（ biotin）又稱 維生素 H,分子量 244.31,存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物 素 -羥基琥珀亞胺酯（ biotin-hydroxysuccinimide,BNHS） 可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素 化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但 特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于 1 個親和素分子有 4個生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更 多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此 把親和素和生物素與 ELIS偶聯(lián)起來，就可大提高 ELISA的 敏感度。