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1、2021/4/12 1 疾病與人類健康 現(xiàn) 代科學 認為 ，疾病的 發(fā) 生直接或 間 接與基因有關 人 類 疾病都是： “基因病 ” 經(jīng) 典 單 基因病 多基因病 獲 得性基因病 經(jīng)典單基因病 ：主要病因是 某個基因位點 上產(chǎn)生 了缺陷等位基因，如：地中海貧血、白化病 多基因病 ：涉及 多個基因 及調(diào)控這些基因表達的 環(huán)境因子之間的相互作用，如：高血壓、糖尿病 獲得性基因?。?主要是由 病源微生物 感染引起的 傳染病，如肝炎、艾滋病 1 腫 瘤與癌癥 2 人免疫缺 損 病毒 HIV 3 乙型肝炎病毒 HBV（自學） 4 基因治 療 Contents 一、 腫 瘤與癌癥 癌（ cancer）是一

2、群不受生 長調(diào) 控而繁殖的 細 胞， 也稱 惡 性 腫 瘤。 癌是由 腫 瘤 細 胞 經(jīng)過 一系列突 變轉 化而來的。 已 證 明 細 胞癌 變 的分子基 礎 是 基因突 變 ，DNA 的 變 化和不正?；?動導 致了 細 胞癌 變 。 腫 瘤 組織 示意 圖 （一）癌基因 癌基因的分類 病毒癌基因 ： (virus oncogene, v-onc) DNA病毒、 RNA病毒（反 轉錄 病毒） 細 胞 轉 化基因： (cellular-oncogene, c-onc) 1. 反轉錄病毒致癌基因 Rous于 1911年首先發(fā)現(xiàn)雞肉瘤病毒（ 后稱勞 斯肉瘤病毒 RSV），研究證明它是一種 反轉錄病

3、 毒（ 單鏈 RNA， 6-9kb ）， 在接種給雞后誘發(fā)肉 瘤 。 1966年， 85歲的勞斯獲得諾貝爾獎。 1.1反轉錄病毒顆粒結構 反 轉錄 基因 結 構示意 圖 R U5 Leader gag pol env U3 R PBS PPT 鞘蛋白 反轉錄酶 外殼蛋白 1.2反 轉錄 病毒的復制 整合的反 轉錄 病毒 DNA分子稱 為 原病毒 （provirus）,它能指 導 病毒 m RNA 的合成，并利用宿主 細 胞中的 蛋白 質(zhì) 合成機器 ，翻 譯 生成病毒外殼蛋白等， 最后 組 裝成病毒 顆 粒。 已 經(jīng) 在各種反 轉錄 病毒中 發(fā)現(xiàn) 了 許 多致癌基因， 它 們 感染后 誘導 宿主

4、 產(chǎn) 生 腫 瘤的主要原因是 激活特 定基因表達 ；破壞宿主 細 胞本身 固有的平衡 ，導 致 細 胞 發(fā) 生 轉 化 。 1.2.1類 型 根據(jù)反 轉錄 病毒 轉 化 細 胞的能力，將其 分 為 兩大 類 ： 急性 轉 化型 非急性 轉 化型 很短 時間 內(nèi)出 現(xiàn) 瘤；癌 基因位于病毒基因族內(nèi)部 具有體外 細 胞 轉 化能力 勞 斯氏肉瘤病毒基因 結 構及 c-src原癌基因的 轉變 鼠 白 血 病 毒 gag pol env gag pol env src 勞 斯 氏 肉 瘤 病 毒 末 端 重 復 序 列 宿 主 細 胞 DNA 外 顯 子 內(nèi) 含 子 編 碼 激 酶 活 性 區(qū) 小 雞

5、 c - src 原 癌 基 因 src 細 胞 癌 基 因 鼠 白 血 病 毒 勞 斯 氏 肉 瘤 病 毒 末 端 重 復 序 列 宿 主 細 胞 外 顯 子 內(nèi) 含 子 編 碼 激 酶 活 性 區(qū) 小 雞 原 癌 基 因 細 胞 癌 基 因 1.2.2 v-onc 基因的起源 表 1 斷裂基因 完整的沒有斷 裂的可讀框 部分 c-onc和 v-onc基因 編碼 區(qū)比 較 基因 c-onc 中的密碼 子數(shù) v-onc中的密 碼子數(shù) 不相同氨基 酸數(shù) 相似性 /% v-onc中缺失的區(qū) 域 mos 396 369 11 97 無 ras 189 189 3 98 無 ras 189 189 7

6、 96 無 sis 220 220 18 92 無 myc 417 417 2 99 無 src 533 514 16 97 C端 fins 980 930 20 99 C端 erbB 1210 600 99 83 N端、 C端 erbA 408 396 22 95 N端 erb 640 372 11 97 N端、 C端 目前致癌基因已多達 100個，主要是 ras和 myc基因 家族。 G1 S、M期 G0期 生 長 控制點 c-myc表達 c-ras表達 上表皮癌的發(fā)生過程示意圖 腫 瘤 細 胞中，生 長 控制點不起作用，一直 處 于 細 胞周期循 環(huán) 之中。 2. 細 胞 轉 化基因 細

7、胞轉化基因 實質(zhì)上就是由一類 原癌基因 突變而來 。 當原癌基因在某些外界因素（如放射線、化學致癌物等）的 作用下，發(fā)生數(shù)量和結構上的微細變化，形成了致癌性的 細 胞轉化基因 ，從而使正常細胞轉化為腫瘤細胞。 P344 原癌基因 是 細 胞內(nèi)與 細 胞增殖相關的 正?；?， 是 維 持機體正常生命活 動 所必 須 的，在 進 化上高等 保守。 當原癌基因的 結 構或 調(diào) 控區(qū) 發(fā) 生 變 異，基因 產(chǎn) 物 增多或活性增 強時 ，使 細 胞 過 度增殖，從而形成 腫 瘤。 2.1 原癌基因 2.1.1 原癌基因的特點 : 廣泛存在于生物界中； 基因序列高度保守； 作用通 過 其 產(chǎn) 物 蛋白

8、質(zhì) 來體 現(xiàn) ； 正常情況下表達水平很低 ; 被激活后，形成 致癌性的 細 胞 轉 化基因 。 2.1.2 原癌基因的分類： 2.1.2.1 根據(jù)原癌基因產(chǎn)物在細胞中的位置，可分 為： 與膜結合的蛋白，如 src基因產(chǎn)物； 可溶性蛋白，如 mos基因產(chǎn)物； 核蛋白，如 myc基因產(chǎn)物。 2.1.2.2 根據(jù)原癌基因表達 產(chǎn) 物的功能，可分 為 ： 蛋白激 酶類 ，如 src家族（酪氨酸蛋白激 酶類 ） 生 長 因子 類 生 長 因子受體 類 GTP結 合蛋白 類 ，如 ras家族 核蛋白 類 （DNA結 合蛋白），如 myc家族 未知功能 類 2.2 原癌基因的表達 原癌基因在正常 細 胞中通

9、常以 單 拷 貝 形式存在， 只有 低水平 的表達或根本 不表達 。 很多情況下，原癌基因的 結 構 發(fā) 生了 點突 變 或 插入、重排、缺失 及 擴 增 等，改 變 其 轉錄 活性。 細 胞中原癌 細 胞基因 轉變?yōu)?癌基因的主要途徑 2.2. 1 點 突 變 ： 最 常 見 的 機 制 ras 基 因 的 點 突 變 及 轉 化 活 性 分 析 2.2.2LTR插入 LTR是逆 轉錄 病毒基因 組 兩端的 長 末端重復序列（ long ter-mmal repeat）,結 構中含有 強 的啟 動 子序列，當 LTR插入原癌基因啟 動 子區(qū)域 或 鄰 近部位后，可從根本上改 變 基因的正常

10、調(diào) 控 規(guī) 律。 2.2.3基因重排 大多數(shù) 類 型的人 腫 瘤中存在染色體數(shù)目和 結 構異常 現(xiàn) 象， 說 明存在原癌基因重排的可能。 abl原癌基因通 過選擇 性染色體重排 轉變 成 細 胞癌基因 重組位點 重組位點 bcr/abl 融合基因 poly A, bcr/abl 融合基因 mRNA Bcr/Abl 融合蛋白 abl基因位于第九號染色體 bcr 基因位于第 22號染色體 因首見于美國費城 （ Philadelphia）而命名。系 其 22號染色體部分長臂接到 9號染色體長臂的一種易位 非受體型酪氨酸 蛋白激 酶 慢性骨髓瘤 2.2.4 缺失（ Deletion） oncogene

11、 (-) cancer 一些原癌基因 5上 游存在 負調(diào) 控序列 ， 該 序列的缺失或突 變 ，則喪 失抑制癌基因 表達的能力。 Brukitt淋巴瘤中 c- myc因 負調(diào) 控序列缺 失或 LTR插入而增 強 表達。 2.2.5 基因 擴 增 蛋白 質(zhì)結 構未 變 化，但 總 量大大提高 基因 擴 增 原癌基因 使每個細胞中基因拷貝數(shù)增加，從而直接增加可用 的轉錄模板數(shù)以增加基因表達。 3 基因互作與癌基因表達 3.1染色體構象 對 原核基因表達的影響 基因表達不僅取決于基因本身及其相鄰區(qū)域的 一級 結構 ，也取決于其 空間構象 ，即 基因在染色體上的空間 排列和染色質(zhì)的結構 。當兩個基因相

12、距太近時，往往不 易形成有利于高效轉錄的空間結構。 基因領域：基因與基因之間的間隔距離 基因領域效應：同一 DNA鏈上兩個具有相同轉錄方向的基因 間隔小于一定長度時，影響有效轉錄所必需的染色質(zhì)結構 的形成，從而使這兩個基因中的一個或兩個均不能轉錄或 轉錄活性顯著降低。 0.3kb - 5kb，最佳間隔距離與兩個基因的總長度成正相關。 c-myc（ 8號染色體），兩側分別有強表達的基因， 使 c-myc受到基因領域效應影響，轉錄抑制。 Burkitt淋巴瘤中，基因發(fā)生重排， c-myc一側的強 表達基因消失，消除了基因領域效應， c-myc轉錄 活性增強。 3.2原癌基因 終產(chǎn) 物 對 基因表達

13、的影響 某種原癌基因 產(chǎn) 物 對 另一種原癌基因表達的 調(diào) 控作用 ，也包括某種原癌基因 產(chǎn) 物 對 自身表達 的 反 饋調(diào) 控 作用兩大 類 。P349 癌基因產(chǎn)物通過介質(zhì)傳遞生長刺激信號的部位有 3處： 癌基因產(chǎn)物本身模擬了 生長因子 ，因而與相應的受體作 用，以自分泌的方式刺激細胞生長； 癌基因產(chǎn)物模擬了已結合配體的 生長因子受體 ，從而在 無外源生長因子時提供了促進細胞分裂的信號； 癌基因產(chǎn)物作用于 細胞內(nèi)生長控制途徑 ，解除此途徑對 外源刺激信號的需求。 3.3 抑癌基因 產(chǎn) 物 對 原癌基因的 調(diào) 控 因 為 抑癌基因 產(chǎn) 物能抑制 細 胞的 惡 性增殖， 所以它也是被 認為 是一

14、種 隱 性癌基因。 原癌基因是 顯 性基因 ，一個等位基因突 變 即 可 顯 示致癌效 應 ； 腫 瘤抑制基因的突 變 ，則 是 隱 性 的，即只有 一個 腫 瘤抑制等位基因 發(fā) 生突 變 ，不會 發(fā) 生 致癌效 應 。 3.4外源信號 對 原癌基因表達的影響 細 胞外信號作用于靶 細 胞后，通 過細 胞膜受體 系 統(tǒng) 或其它直接途徑被 傳遞 至 細 胞內(nèi)，再通 過 多 種蛋白激 酶 的活化， 對轉錄 因子 進 行修 飾 ，然后引 發(fā) 一系列基因的 轉錄 激活。 許 多原癌基因參與 細 胞信號 轉導過 程 快速反 應 基因：不 受蛋白 質(zhì) 合成抑制 劑 影響； 轉錄 激活 維 持 時間 很短

15、二、人免疫缺 損 病毒 HIV 1 HIV病毒粒子的形 態(tài)結 構和 傳 染 HIV- 病毒粒子 結 構模型 圖 gp 120 gp 41 MA CA RT NC+RNA 內(nèi)膜蛋白 外殼蛋白 反 轉錄酶 外殼蛋白 核衣殼 2 HIV基因 組 及其 編碼 的蛋白 HIV基因 組 由兩條 單鏈 正 鏈 RNA組 成，每個 RNA基因 組約為 9.7kb。在 RNA5端有一帽子 結 構 （m7G5GmpNp）,3端有 poly(A)尾巴。 HIV的主要基因 結 構核 組織 形式與其他反 轉錄 病毒相 同。均由 5末端 LTR、結 構蛋白 編碼 區(qū)（ gag）、蛋白 酶 編碼 區(qū)（ pro）、具有多種

16、酶 活性的蛋白 編碼 區(qū)（ pol）、外膜蛋白 （erv）和， 3末端 LTR組 成。 編碼病毒的核 心蛋白 編碼反轉錄酶、 整合酶和蛋白酶 編碼外膜蛋白 gag p55 p24（外殼蛋白， CA） pP17（內(nèi)膜蛋白， MA） p15 p9和 p7（核衣殼 蛋白， NC） pol p66（逆 轉錄酶 ） p22（整合 酶 ） pro p22，切割，促 進 蛋白 質(zhì) 成熟 env gp160糖蛋白 gp120（外膜蛋白），與 CD4受體 結 合 gp41（跨膜蛋白）插入寄主 細 胞膜 HIV- 基因 結 構和所 編碼 的主要蛋白 HIV- 在人體細胞內(nèi)的復制和侵染過程示意圖 3 HIV的復制

17、4 HIV- 基因的表達 調(diào) 控 與大多數(shù)反 轉錄 病毒相比， HIV的最大特點就 是含有 許 多 調(diào) 控基因 。 這 些基因 編碼 相 應 的 調(diào) 控蛋白，它 們 在病毒 RNA的 轉錄 、轉錄 后加工、蛋白 質(zhì) 翻 譯 包裝以及病 毒 顆 粒的 釋 放等各個 過 程中 發(fā)揮 重要作用。 4.1 LTR序列 HIV基因 組 LTR區(qū)中 DNA和 RNA結 合蛋白的作用位點 雞 卵蛋白 轉錄 因子 COUP（負 ） 上游激活因子 USF（負 ） 激活蛋白 1（正） 激活 T細 胞核因子 NFAT（正） T細 胞因子 TCF （正） 核因子 NFkB （正） 4.2 調(diào) 控蛋白 Tat蛋白 ：轉

18、錄 激活因子，促 進 RNA聚合 酶 轉錄 起始復合物的 組 裝。 Rev蛋白 ：反式激活因子， 對結 構基因起正 調(diào) 控作用，增加未 編輯 的基 因 組 全 長轉錄產(chǎn) 物。 Nef蛋白 ：負調(diào) 控因子和磷酸化蛋白，非復制必需，抑制前病毒基因的 表達，提高 HIV的含量。 Vpr蛋白 ：R蛋白，作用于 LTR，提高 HIV的復制速度，在早期中起作 用。 Vpu蛋白 ：U蛋白，磷酸化蛋白，存在于 細 胞膜中，可能促 進 HIV的 組 裝、成熟和 釋 放。 Vif蛋白 ：增加 HIV 的侵染性。 5 HIV的感染及致病機理 HIV的主要靶細胞是細胞表面表達 CD4分子的細 胞，主要是 CD4+T淋

19、巴細胞 ，還有 單核細胞 、 巨 噬細胞等 。 細胞表面 CD4分子是 HIV受體，通過 HIV膜蛋 白 gp120與細胞膜上 CD4結合后，由 gp41介導使病 毒傳入易感細胞內(nèi)，造成細胞破壞。 HIV感染后的發(fā)病機理如下 HIV侵入人體后首先與細胞表面含有 CD4受體 CD4+T淋巴細胞結合， 進入細胞進行復制，部分整合于細胞染色體 DNA中成為潛伏型 機體細胞免疫和體液免疫對 HIV的抵抗作用，使感染初期的 HIV低 水平復制 在其他因素的作用下，潛伏的 HIV被激活而大量復制，廣泛侵 入 CD4+T淋巴細胞，使 CD4+T淋巴細胞、單核 巨噬細胞、 B淋巴 細胞、 CD8+T淋巴細胞和

20、 NK細胞等功能受損，最后導致整個免疫 功能缺陷，最終發(fā)生一系列頑固性機會感染和腫瘤的發(fā)生。 三、基因治療 gene therapy 基因治 療 ：就是向有功能缺陷的 細 胞 補 充相 應 功能基因 ，以 糾 正或 補償 其基因缺陷，從而 達到治 療 的目的。 對 象 體 細 胞 生殖 細 胞 1、定義 2、基因治療的策略 1）基因置換（ gene replacement）： 基因替換用 正 常的基因 原位 替換病變細胞內(nèi)的致病基因，使細 胞內(nèi)的 DNA完全恢復正常狀態(tài)。 2）基因修復（ gene correction）： 基因修正，是 指將致病基因的 突變堿基序列糾正 ，而正常部分 予以保留

21、。 3）基因修飾（ gene augmentation）： 基因補充，又稱基因增補， 將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌毎?，目的基因?表達產(chǎn)物 能 修 飾 缺陷細胞的功能或使原有的某些功能得以 加強 。 4）基因失活（ gene inactivation）： 利用 反義技術 、 核酶技術 或 基 因敲除技術 封閉 有害基因，能特異地封閉基因表達特性， 抑制 一 些有害基因的表達，達到治療疾病的目的。 5）免疫調(diào)節(jié) (immune adjustment)： 將 抗體、抗原或細胞 因子的 基因 導入病人體內(nèi)，改變病人免疫狀態(tài)，達到預防 和治療疾病的目的。 3 基因治 療 的兩大途徑 3.1 ex v

22、ivo途徑（回體法） 指將含外源基因的 載 體在 體外 導 入人體自身或異體（異種） 細 胞 這 種方法不 易形成 規(guī) 模，而且必 須 有固定的 臨 床基地。 3.2 in vivo途徑（在體法） 這 是將外源基因裝配于特 定的真核 細 胞表達 載 體上，直接 導 入人體內(nèi)。 4 基因治 療 中的病毒 載 體 用于基因治 療 的病毒 載 體 應 具 備 以下條件： 攜 帶 外源基因并能裝配成病毒 顆 粒； 介 導 外源基因的 轉 移和表達； 對 機體沒有致病力。 4.1 病毒 載 體的分 類 重 組 型病毒 載 體 無病毒基因的病毒 載 體 常用病毒 載 體的特性和適用范 圍 病毒 載 體 生

23、物學特征 適用范 圍 反 轉錄 病毒 載 體 可感染分裂 細 胞 整合到染色體中 表達 時間較長 有致癌的危 險 ex vivo 基因治 療 腫 瘤基因治 療 腺病毒 載 體 可感染分裂和非分裂 細 胞 in vivo 基因治 療 腫 瘤基因治 療 疫苗 不整合到染色體中 外源基因表達水平高 表達 時間較 短 免疫原性 強 病毒 載 體 生物學特征 適用范 圍 腺病毒伴隨病毒 載 體 可感染分裂和非分裂 細 胞 整合到染色體中 無致病性，免疫原性弱 可 長 期表達外源基因 在骨骼肌、心肌、肝 臟 、視 網(wǎng)膜 等 組織 中表達水平 較 高 in vivo 基因治 療 ex vivo 基因治 療

24、遺傳 病基因治 療 獲 得性慢性疾病的 基因治 療 皰疹病毒 載 體 具嗜神 經(jīng) 性，可逆 軸 突 傳遞 可潛伏感染 容量大 可感染分裂和非分裂 細 胞 神 經(jīng) 系 統(tǒng) 疾病的基 因治 療 腫 瘤基因治 療 續(xù)表 4.2 基因治 療 中的 問題 1. 靶向性基因 導 入系 統(tǒng) 基因治 療 中的關 鍵 問題 是必 須 將 治 療 基因送入特定的靶 細 胞，并在 該細 胞中得到高效表達 2. 外源基因表達的可控性 基因 導 入后表達 處 于無 調(diào) 控狀 態(tài) ，將會造成 嚴 重后果。 3. 治 療 基因 過 少 致病基因 還 有待 闡 明，可 選擇 的靶基因 不多。 5 非病毒 載 體 裸 DNA

25、脂 質(zhì) 體 /DNA復合物 多聚物 /DNA復合物 6、基因治療的前景 1）反義技術（ antisense oligodeoxynucleotides ） 一種從 基因水平 進行治療的技術，它們以不同方式，在 DNA 復制、轉錄和翻譯水平發(fā)揮作用。利用人工合成的 反義 RNA或 DNA導入靶細胞， 阻斷 Gene的轉錄或復制，控制細胞的中間階段， 使編碼蛋白的 Gene不能轉錄為 mRNA ，或阻斷翻譯相應蛋白 . DNA DNA RNA RNA 反義 RNA 阻斷表達 2）藥 物靶向治 療 （drugs targeting） 病毒導向酶的藥物前體治療（ virus directed enzy

26、me pro- drug therapy， VDEPT），即用反轉錄病毒載體的外源基因轉移到 細胞內(nèi)。該基因編碼一種 酶 ，此酶可將一種 無害的藥物前體 轉變?yōu)?細胞毒素復合物 。帶有這一基因的病毒載體只在特殊組織或腫瘤細 胞中而不在正常細胞中表達。 例如，胞嘧啶脫氨酶（ cytosine deaminase）可將無害的 5氟胞 嘧啶（ 5-fluorocytosine， 5-FC）轉變?yōu)榧毎舅?5氟胞嘧啶（ 5- fluorocytosine， 5-FC）。此病毒可感染正常細胞和癌細胞，但將該 酶基因連接到一種“分子開關”后，則只能在腫瘤細胞中表達。 自殺基因 + 病毒載體 重組載體 藥物前體無毒 Gene酶 藥物復合物有毒 細胞死亡 轉染 （外源基因）