《《核酸化學(xué)》PPT課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《《核酸化學(xué)》PPT課件（102頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、第 四 章 核 酸 化 學(xué) 第一節(jié) 概述 第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成 第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu) 第四節(jié) 核酸的性質(zhì) 第五節(jié) 核酸的研究方法 本章內(nèi)容 第一節(jié) 概 述 核酸（ nucleic acid NA） 是一類重要 的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ) 存與傳遞。 核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的 重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核 心分子。 1868 F. Miescher從膿細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出了一 種 含磷酸的有機(jī)物 ， 當(dāng)時(shí)稱為核素 （ nuclein） ,后稱為核 酸 （ nucleic acid） 。 1944 Avery 等通過肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證明 DNA是遺 傳物質(zhì) 。 1952 He

2、rshey, Chase-噬菌體標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 。 1953 Watson和 Crick提出 DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型 。 1958 Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則 。 1973 Boyer， Cohen-DNA Cloning(克隆 ） 。 1976 DNA Sequencing(序列分析 ） 。 1990 Human Genome Project（ 人類基因組計(jì)劃 ） 。 一、核酸的研究歷史 光滑型細(xì)胞 （有毒） 粗糙型細(xì)胞 （無毒） 破碎細(xì)胞 DNAase降 解后的 DNA 粗糙型細(xì)胞接 受光滑型 DNA 只有粗糙型 大多數(shù)仍為粗糙型 少數(shù)光滑型 細(xì)胞被轉(zhuǎn)化 S S R R R + DNA

3、 1944年 Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 肺炎球菌（ pneumococcus） 1928年細(xì)菌學(xué)家 Griffith 細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn) 噬菌體感染實(shí)驗(yàn) 1952年美國(guó) Hershey 噬菌體感染實(shí)驗(yàn) 真核生物 原核生物 細(xì)胞核（ 98%） 擬核 線粒體 mDNA （少量） 質(zhì)粒 DNA（ plasmid） 葉綠體 ctDNA （少量）等 病毒 DNA 細(xì)胞質(zhì)（ 90%） 細(xì)胞質(zhì) 核仁（少量） 病毒 RNA 二、核酸的種類和分布 DNA 脫氧核糖核酸 RNA 核糖核酸 注：生物細(xì)胞都含有 DNA 和 RNA； 病毒中只含 DNA 或 只含 RNA。 第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成 核酸 是由幾十個(gè)甚至幾千萬個(gè)

4、 核苷酸 聚合而成的 具有一定空間結(jié)構(gòu) 的 生物大分子 。 基本元素： C、 H、 O、 N、 P ； 其中 P 的含量比較穩(wěn)定，占 9%-10%，通過測(cè) 定 P 的含量來推算核酸的含量（定磷法）。 磷酸 核苷 堿基 戊糖 核酸 核苷酸 一、 戊糖 組成核酸的戊糖有兩種。 DNA所含的 糖為 -D-2-脫氧核糖； RNA所含的糖則 為 -D-核糖。 O H H O H H O H O H H H O C H 2 H O C H 2 O H H O H H H O H H D- 核糖 D - 2 - 脫氧核糖 二、堿基 1. 嘌呤（ Purine） 腺嘌呤 Adenine A 鳥嘌呤 guani

5、ne G 2. 嘧啶（ Pyrimidine） 胸腺嘧啶 T 胞嘧啶 C 尿嘧啶 U 核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿 基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。 N N C H 3 N H 2 5 - M e t h y l - d C O d R 二氫尿嘧啶 （ DHU） 修飾堿基的簡(jiǎn)寫符號(hào) m N 2 2 取 代 位 置 核 苷 取 代 基 的 數(shù) 目 取 代 基 ( 為 1時(shí)可以不寫 ) 三、核苷（ nucleoside） 核苷：戊糖 +堿基 糖與堿基之間的 C-N鍵，稱為 C-N糖苷鍵 核苷中戊糖與堿基的連接方式： 1 2 3 4 5 (OH) 1 2 3 4 5 (OH)

6、 修飾核苷 /稀有核苷 修飾核苷包括三種情況 : （ 1）由 修飾堿基 和糖組成的核苷 （ 2）由非修飾堿基和 2-O-甲基核糖 組成的核苷 （ 3）由堿基與糖 連接方式特殊 的核苷 N N N N N H C H 3 d R N 6 - M e t h y l- d A （ 1） H N N H O 5 , 6 - d ih y d r o u r id in e O R H H H ( D o r h U ) （ 2） OC H 2 H H O H H O C H 3 H H O 2 - O - 甲 基 腺 苷 A d e ( A m ) N N C H 3 N H 2 5 - M e t

7、 h y l- d C O d R 二氫尿嘧啶核苷 (Am) （ 3） O C H 2 H H O H H O H H H O ( p s e u d o u r i d i n e ) H N N H O O 5 1 假 尿 嘧 啶 核 苷 () 取代基用下列小寫英文字母表示 : 甲基 m 乙酰基 ac 氨基 n 甲硫基 ms 羥基 o或 h 硫基 s 異戊烯基 i 羧基 c 例： H N NO R S H N NO R O C H 2 O H s4 U o m 5 U 或 h m 5 U 四、核苷酸（ nucleotide） 核苷酸： 核苷 +磷酸 戊糖 +堿基 +磷酸 H 五、游離核苷酸

8、及其衍生物的形式 1. 繼續(xù)磷酸化 2.環(huán)化磷酸化 cAMP cGMP 3.輔酶 NAD、 NADP、 FAD、 HSCoA FAD NAD、 NADP HSCoA 4. GDP-半乳糖、 GDP-葡萄糖等是糖蛋白 生物合成和多糖生物合成的活性糖 基供體。 第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu) 一、 DNA的結(jié)構(gòu) 一級(jí)結(jié)構(gòu) : DNA核苷酸鏈中脫氧核苷 酸的組成和排列順序。 二級(jí)結(jié)構(gòu)： DNA的兩條多聚鏈間通過 氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 三級(jí)結(jié)構(gòu)： DNA雙鏈進(jìn)一步折疊卷曲 形成的構(gòu)象。 （一） DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) 由 dAMP、 dGMP、 dCMP、 dTMP核苷酸單體通 過 3,5-磷酸二酯鍵相連而成的鏈

9、狀聚合物。 5 5 3 3 結(jié)構(gòu)式 5 -磷酸端（常用 5-P表 示）； 3-羥基端（常用 3 -OH表示） 核苷酸鏈具有方向性，當(dāng) 表示一個(gè)核苷酸鏈時(shí)，必 須注明它的方向是 53 或是 35 。 字母式 5 PAPCPGPCPTPGPTPAOH 3 5 PACGCTGTAOH 3 線條式 P P 5 3 3 5 P P 5 3 P 5 3 A C G T OH DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)也可指 DNA分子中堿基的順序。 DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形 式。生物界物種的多樣性即寓于 DNA分子中四種 核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。 （二） DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) Watson 和 Crick

10、 于 1953年提出 了 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，說明了 DNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。（即 B型 DNA） （ 1） Chargaff定則 （ 1950s,E. Chargaff發(fā)現(xiàn)） I. DNA堿基組成符合： A=T； G=C； A+G=T+C。 II.不對(duì)稱比率： A+T/G+C； 物種不同， DNA堿基組成不同； 物種親緣愈接近，堿基組成也愈接近，該比 率越相近似。 . 具有種的特異性，沒有器官和組織的特異性， 年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況、環(huán)境的改變不影響 DNA的 堿基組成。 1提出 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù) （ 2） x-光衍射分析 20世紀(jì) 40年代 Astbury 1952年 M.Wilkins

11、 2 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（ double-helical structure） 1953年 Watson和 Crick提出了 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（ 1） 螺旋中的兩條鏈 反向平行 ，即其中一條 鏈的方向?yàn)?53 ，而另一條鏈的方 向?yàn)?35 ，兩條鏈共同圍繞一個(gè)假 想的中心軸呈 右手雙螺旋 結(jié)構(gòu)。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（ 2） 疏水的堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，親水 的磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。 堿基平面與螺旋軸垂直，脫氧核糖平 面與中心軸平行。 由于幾何形狀的限制，堿基對(duì)只能由 嘌呤和嘧啶配對(duì)，即 A與 T， G與 C。這 種配對(duì)關(guān)系，稱為 堿基互補(bǔ) 。 A和

12、T之 間形成兩個(gè)氫鍵， G與 C之間形成三個(gè) 氫鍵。 T-A堿基對(duì) C-G堿基對(duì) DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（ 3） 由于堿基對(duì)排列的方 向性，使得堿基對(duì)占 據(jù)的空間是不對(duì)稱的， 因此，在雙螺旋的表 面形成大小兩個(gè)凹槽， 分別稱為 大溝和小溝， 二者交替出現(xiàn)。 2.0 nm 小 溝 大 溝 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（ 4） 雙螺旋橫截面的 直徑 約為 2 nm，相鄰兩個(gè) 堿基平面之間的距離 （ 軸距 ）為 0.34 nm， 每 10個(gè)核苷酸形成一 個(gè)螺旋，其 螺距 （即 螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）的高 度）為 3.4 nm。 2.0 nm 小 溝 大 溝 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（ 5） 兩條鏈借堿基之間

13、的氫鍵和堿基堆積 力（即堿基之間的 范德華力）牢固的 連接起來，維持 DNA雙螺旋的三 維結(jié)構(gòu)。 兩條鏈?zhǔn)菈A基互補(bǔ) 關(guān)系。 3. DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定因素 氫鍵 堿基堆積力 磷酸基上負(fù)電荷被胞內(nèi) 組蛋白或正離子中和 堿基處于疏水環(huán)境中 4. DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) 的意義 該模型揭示了 DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征 ， 最有價(jià)值的是確認(rèn)了 堿基配對(duì) 原則 ， 這是 DNA復(fù)制 、 轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ) ， 亦是遺傳信息傳遞和表達(dá) 的分子基礎(chǔ) 。 該模型的提出是上個(gè)世紀(jì)生命科學(xué)的重 大突破之一 ， 它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整 個(gè)生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石 。 DNA雙螺旋構(gòu)象 的類型 （

14、三） DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu) -超螺旋 1）超螺旋是指雙螺旋進(jìn) 一步扭曲或再螺旋的構(gòu) 象。 2）正超螺旋（變緊，過 旋）和負(fù)超螺旋（變松， 欠旋）。 3）人類 46條染色體的 DNA總長(zhǎng)可達(dá) 1.7m，經(jīng)過 螺旋化壓縮，實(shí)際總長(zhǎng)只 有 200nm。 負(fù)超螺旋 核小體盤繞及染色質(zhì)示意圖 DNA的存在形式 -核小體 1) 真核生物中 DNA雙螺旋沿著組蛋白 八聚體核心的短軸繞 1.75圈，形成 左手超螺旋，稱 核小體 。 2) 染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體。 3) 串珠狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步卷曲形成螺線管， 后者再進(jìn)一步卷曲形成超螺旋管， 形成染色單體。 基因和基因組 1) 基因即 一段有功能的 DNA片段，生物

15、細(xì) 胞中 DNA分子的最小功能單位（交換單 位）。 2) 一個(gè)細(xì)胞或生物體所含的全套基因稱 基因組。 二、 RNA的分子結(jié)構(gòu) （一） RNA的分類及特點(diǎn) （二） RNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) （一） RNA的特點(diǎn)及分類 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1. 堿基組成： A、 G、 C、 U （ A U/GC）； 2. 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解； 3. 多為 單鏈 結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）； 4. 分子較小。 分類： 1. 信使 RNA（ mRNA） 2. 轉(zhuǎn)運(yùn) RNA （ tRNA） 3. 核糖體 RNA （ r RNA） Messenger RNA 1) 約占總 RNA的 3%-5%，含量最少，種類

16、最多。 2) 成熟 mRNA不含內(nèi)含子， hnRNA含有。 3) mRNA從 DNA轉(zhuǎn)錄遺傳信息，并作為蛋 白質(zhì)合成的模板，決定蛋白質(zhì)的氨基 酸順序。 Ribosome RNA 1) 約占全部 RNA的 80%， 含量最多 。 2) 與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體 ， 后 者是合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所 。 原核生物 真核生物 核糖體 rRNA 核糖體 rRNA 30s 70s 50s 16s 5s 、 23s 40s 80s 50s 18s 5s、 5.8s、 28s Transfer RNA 1) 約占總 RNA的 10-15%， 分子最小 。 2) 它在蛋白質(zhì)生物合成中起翻譯 mRNA 信息 ， 并將相

17、應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核 糖體 ， 參與蛋白質(zhì)體的合成 。 3) 已知每一個(gè)氨基酸至少有一個(gè)相應(yīng) 的 tRNA。 （二） RNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 1) tRNA 的結(jié)構(gòu) 二級(jí)結(jié)構(gòu) 特征 ： 單鏈 三葉草葉形 四臂四環(huán) 三級(jí)結(jié)構(gòu) 特征： 在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上 進(jìn)一步折疊扭曲形成倒 L型 酵母 tRNA Ala 的二級(jí)結(jié)構(gòu) DHU環(huán) I G C 反密碼子 反密碼環(huán) 氨基酸臂 可變環(huán) TC環(huán) C C A Ala 3 5 2） rRNA的分子結(jié)構(gòu) 特征 ： 單鏈 ， 螺旋化程度較 tRNA低 與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能 5SRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 3） mRNA的分子結(jié)構(gòu) 在轉(zhuǎn)錄一章講授 第四節(jié) 核酸的性質(zhì) 一

18、、一般物理性質(zhì) 二、核酸的水解 三、兩性解離 四、紫外吸收性質(zhì) 五、穩(wěn)定性 六、變性 七、復(fù)性與雜交 一、一般物理性質(zhì) 1. DNA白色纖維狀固體， RNA白色粉末狀固 體，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇來 沉淀 DNA ； DNA溶液黏度大于 RNA 。 2. DNA難溶于 0.14mol/L的 NaCl溶液，可溶于 1 2 mol/L的 NaCl溶液， RNA則相反，可據(jù)此 分離二者。 3. 加熱條件下， D核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色 D 2脫氧核糖酸二苯胺 藍(lán)紫色 二、核酸的水解 1. 核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或 堿性條件下水解切斷。 2. DNA和 RNA對(duì)酸或堿的耐受程度有很

19、大差別。室溫條件下， DNA在堿中 變性，但不水解， RNA水解。 3. 在細(xì)胞內(nèi)核酸分子受 DNA酶作用。 三、兩性解離 1. 核酸含酸性的磷酸基團(tuán)，又含弱堿性 的堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性 解離； 2. 核酸相當(dāng)于多元酸， pH大于 4時(shí)，呈 陰離子狀態(tài)； 3. 等電點(diǎn) 四、紫外吸收 1. 在核酸分子中嘌呤堿和嘧啶堿都含有 共軛雙鍵體系，在 260 nm有吸收； 2. 可以作為區(qū)別蛋白質(zhì)和對(duì)核酸及其組 份定性和定量測(cè)定的依據(jù)，進(jìn)行核酸 純度鑒定，也可作為核酸變性和復(fù)性 的指標(biāo)。 DNA的紫外吸收光譜 天然 DNA 變性 DNA 核苷酸總吸收值 1 2 3 220 240 260 280

20、 0.1 0.2 0.3 0.4 波長(zhǎng)（ nm） 光 吸 收 1 2 3 根據(jù) A260/A280的比值判斷核酸樣品的 純度 純 DNA： A260/A280=1.8 純 RNA： A260/A280=2.0 （若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則 A260/A280比值明顯降低） 純的核酸樣品可根據(jù) 260nm的光吸收值算出其 含量 若 260nm光吸收值 為 1相當(dāng)于 50g/ml雙螺旋 DNA 或相當(dāng)于 40g/ml單鏈 DNA或 RNA 或相當(dāng)于 20g/ml寡核苷酸 。 五、 DNA的穩(wěn)定性 1.DNA的溶液呈粘稠狀，但實(shí)際上 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)僵直而有剛性，易斷成 碎片，這也是目前難以獲

21、得完整大分 子 DNA的原因。 2.溶液狀態(tài)的 DNA易受 DNA酶作用而降 解，抽干水分的 DNA性質(zhì)十分穩(wěn)定。 六、 DNA的變性 1. 概念 2. 變性條件 3. 變性的特征 1. 概念 是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間 的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程 。 2.DNA的變性的條件 能夠引起核酸變性的因素有： 1）溫度升高； 2）酸堿度改變、 pH（ 11.3或 5.0）； 3）有機(jī)溶劑如甲醛和尿素、 甲酰胺 等； 4）低離子強(qiáng)度。 3.DNA變性的特征 1) 變性核酸將失去其部分或全部的生物 活性。 2) 變性改變了 DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。核酸的 變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所 以它的一級(jí)

22、結(jié)構(gòu) (堿基順序 )保持不變。 3) DNA的變性過程是突變性的，它在很 窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。 DNA解鏈溫度 4) 紫外吸收值明顯增加，即 增色效應(yīng) 。 5) 粘度降低，沉降系數(shù)增加。 DNA解鏈溫度（熔點(diǎn)， Tm ） 1) 當(dāng) 50% 的 DNA變性時(shí)的溫度稱為該 DNA的 解鏈溫度，即增色效應(yīng)達(dá)到一半時(shí)的溫 度；一般 DNA的 Tm值在 70-85C之間。 2) 均一 DNA（如病毒）的 Tm值范圍較小。 3) 分子中 G和 C的含量越高，越不易變性， Tm值越高。 可通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算： （ G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 4) Tm值隨溶液鹽濃度增加而增大， 5) Tm值較低

23、，易變性，不易保存。 溶解曲線 與 Tm。 。 影響 Tm值的因素 DNA的均一性 DNA中 G-C對(duì)的含量 經(jīng)驗(yàn)式 : (G-C)%=(Tm-69.3) 2.44 鹽離子強(qiáng)度 增色效應(yīng)與減色效應(yīng) 天然 DNA分子在熱變性條件下，雙螺 旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，在紫外光 260nm 波長(zhǎng)處的吸收度明顯增加，此現(xiàn)象稱為 增色效應(yīng)。 變性 DNA分子復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí) 其紫外吸收降低的現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。 七、 DNA的復(fù)性 1. 概念 2. 復(fù)性的條件 3. 影響復(fù)性的因素 4. 復(fù)性動(dòng)力學(xué) 5. 分子雜交 1. 概念 1.變性 DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分 開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，

24、 其物理性質(zhì)和生物活性隨之恢復(fù)，這一過 程稱為復(fù)性； 2.對(duì)于熱變性的 DNA，在緩慢冷卻的條件 下可重新結(jié)合恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為退 火。 3.DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)， 但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。 DNA的復(fù)性圖示 2.DNA的復(fù)性條件 1.將熱變性的 DNA驟然冷卻至低溫 時(shí) ， DNA不可能復(fù)性 。 即淬火 。 2.將變性的 DNA緩慢冷卻時(shí) ， 可以復(fù) 性 。 退火溫度 Tm 25 3.分子量越大復(fù)性越難 。 濃度越大 ， 復(fù)性越容易 。 此外 ， DNA的復(fù)性需要 一定的鹽濃度 ， 也與它本身的組成和 結(jié)構(gòu)有關(guān) 。 高于 Tm值 5 復(fù)性 也稱退火 3. 影響復(fù)性

25、的因素 樣品的性質(zhì) DNA的濃度 DNA片段的大小 溫度 離子強(qiáng)度 4.復(fù)性動(dòng)力學(xué) DNA的復(fù)性過程是一種雙分子反應(yīng) DSS k S： single strand DNA D： double strand DNA 2 1 C C 0 Cot : 2 1 時(shí)的 Cot值，即指復(fù)性完成一半時(shí)的 Cot值。 5.分子雜交 1.在變性的 DNA溶液中加入外源 DNA單鏈分子或 RNA單鏈分子（與原 DNA具有同源性），去掉變 性條件后復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。 2.這樣形成的新分子稱為雜交 DNA分子。 3.利用核酸雜交可檢測(cè)特定的核苷酸片段或研 究同源性等。 分子雜交 探針： 用于雜交 的異源 DN

26、A或 RNA序列，其 核苷酸序列是 人工特定的、 已知的，經(jīng)放 射性標(biāo)記的一 條鏈。 核酸 的變性、復(fù)性和雜交 變性 （加熱） 探針 雜交 （緩慢冷卻） 復(fù)性 （緩慢冷卻） 分子雜交的種類 1) Southern Blot： DNA-DNA雜交 2) Northern Blot： DNA-RNA雜交 3) Western Blot：抗原 -抗體進(jìn)行雜 交 4) 原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交， 顯出熒光 Southern 印跡法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 與放射性標(biāo)記 DNA探針雜交 放射自顯影 帶有 DNA片 段的凝膠 凝膠 濾膜 用緩沖液 轉(zhuǎn)移 D

27、NA 吸附有 DNA 片段的膜 第五節(jié) 核酸的研究方法 一、核酸的分離、提取通則 為了得到完整的大分子核酸，一般要注意 3點(diǎn) ： 1保持低溫（ 0 4 ）。 2防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌。 3防止核酸酶的作用。 抑制 DNase： 可加檸檬酸鈉、 EDTA等金屬螯合劑；或加去污劑 十 二烷基硫酸鈉（ SDS）；或加蛋白變性劑。 抑制 RNase： （ 1）實(shí)驗(yàn)器皿高溫，或高壓滅菌，不能高壓滅菌的用 具用 0.1%二乙基焦碳酸鹽（ diethyl pyrocarbonate, DEPC）處理。 （ 2）加強(qiáng)的蛋白變性劑如硫氰酸胍、異硫氰酸胍等。 （ 3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（ RNasin）等

28、 RNase的抑制劑。 二、大分子 DNA的提取 1材料的選擇 2細(xì)胞破碎 3 DNA-蛋白質(zhì)（ DNP）的提取 真核細(xì)胞 DNA與蛋白質(zhì)結(jié) 合成核蛋白（ DNP）， RNA與蛋 白質(zhì)結(jié)合成 RNP，而且 DNP和 RNP常?；煸谝黄?。利用 DNP和 RNP在不同濃度 NaCl中溶解度的 不同來分離 DNP和 RNP。 可用 1mol/LNaCl溶液提取 DNP。 0.5 1.0 0 1 2 0 .14 相 對(duì) 溶 解 度 NaCl（ mol/L） DNP在 NaCl中的溶解度 4去蛋白質(zhì) （ 1） SDS （ 2）苯酚法 （ 3）氯仿法 （ 4）酚 :氯仿 :異戊醇 25:24:1 5沉淀

29、DNA 6去雜質(zhì) （ 1）去 RNA （ 2）去多糖 7進(jìn)一步純化 生物材料 DNP（ RNP） DNP 纖維狀 DNA 較純 DNA 純 DNA *原核生物的 DNA是裸露的，與蛋白質(zhì)結(jié)合不多，分離純化要簡(jiǎn)單些。 破細(xì)胞 1.0mol/L NaCl* 去蛋白質(zhì) 酒精沉淀 去 RNA 柱層析，電泳 密度梯度離心 去多糖 三、 RNA的提取 1不同種類 RNA的提取 2大分子 RNA的提取 （ 1）酚提取 （ 2）酚 -氯仿 -SDS法 3 mRNA的提取 四、核酸純度鑒定 1.A260/A280 2.電泳 五、核酸含量的測(cè)定 1.定磷法 2.定糖法 3.紫外吸收法 本章重點(diǎn) : 1. 核酸的化學(xué)本質(zhì)、結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本特征