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1、 1、 反 轉(zhuǎn) 錄 PCR(RT-PCR) 2、 反 向 PCR3、 復(fù) 合 PCR 4、 不 對(duì) 稱 PCR 5、 嵌 套 PCR6、 實(shí) 時(shí) 定 量 PCR 類 似 于 DNA的 體 內(nèi) 復(fù) 制 。 首 先 待 擴(kuò) 增 DNA模 板加 熱 變 性 解 鏈 ， 隨 之 將 反 應(yīng) 混 合 物 冷 卻 至 某一 溫 度 ， 這 一 溫 度 可 使 引 物 與 它 的 靶 序 列 發(fā)生 退 火 ， 再 將 溫 度 升 高 使 退 火 引 物 在 DNA聚 合酶 作 用 下 得 以 延 伸 。 這 種 熱 變 性 -復(fù) 性 -延 伸的 過(guò) 程 就 是 一 個(gè) PCR循 環(huán) ， PCR就 是 在 合

2、 適 條件 下 的 這 種 循 環(huán) 的 不 斷 重 復(fù) 。 模 板 DNA的 變 性 ： 模 板 DNA經(jīng) 加 熱 至 93-95 左 右 一 定 時(shí)間 后 ,使 模 板 DNA雙 鏈 或 經(jīng) PCR擴(kuò) 增 形 成 的 雙 鏈 DNA解 離 ,使之 成 為 單 鏈 ,以 便 它 與 引 物 結(jié) 合 ,為 下 輪 反 應(yīng) 作 準(zhǔn) 備 ； 模 板 DNA與 引 物 的 退 火 (復(fù) 性 )： 模 板 DNA經(jīng) 加 熱 變 性 成 單 鏈后 ,溫 度 降 至 55 左 右 ,引 物 與 模 板 DNA單 鏈 的 互 補(bǔ) 序 列 配 對(duì)結(jié) 合 ； 引 物 的 延 伸 ： DNA模 板 -引 物 結(jié) 合

3、 物 在 TaqDNA聚 合 酶 的 作 用下 ， 以 dNTP為 反 應(yīng) 原 料 ， 靶 序 列 為 模 板 ， 按 堿 基 配 對(duì) 與 半 保留 復(fù) 制 原 理 ， 合 成 一 條 新 的 與 模 板 DNA 鏈 。注 :每 完 成 一 個(gè) 循 環(huán) 需 2 4分 鐘 ， 2 3小 時(shí) 就 能 將 待 擴(kuò) 目的 基 因 擴(kuò) 增 放 大 幾 百 萬(wàn) 倍 1、 緩 沖 溶 液 Mg2+是 DNA聚 合 酶 的 激 活 劑 2、 耐 熱 DNA聚 合 酶3、 脫 氧 核 糖 三 磷 酸 核 苷 酸 (dNTPs)4、 模 板 DNA5、 上 游 引 物 、 下 游 引 物 （ 1 ） 、 PCR反

4、 應(yīng) 緩 沖 液 Mg2+是 DNA聚 合 酶 的 激 活 劑 。 1.5mmol/L-2.5mmol/L反 應(yīng) 體 系 。 Mg2+濃 度 過(guò) 低 會(huì) 使 Taq酶 活 性 喪 失 、 PCR產(chǎn) 量下 降 ； Mg2+過(guò) 高 影 響 反 應(yīng) 特 異 性 。 Mg2+可 與 負(fù) 離 子 結(jié) 合 ， 所 以 反 應(yīng) 體 系 中 dNTP、 EDTA等 的 濃 度 影 響 反 應(yīng) 中 游 離 的 Mg2+濃 度 。 （ 2） Taq DNA聚 合 酶 （ thermus aquaticus) 0.5-5 U/100L 酶 量 增 加 使 反 應(yīng) 特 異 性 下 降 ;酶 量 過(guò) 少 影 響 反 應(yīng)

5、 產(chǎn) 量 。（ 3） dNTP dNTP濃 度 取 決 于 擴(kuò) 增 片 段 的 長(zhǎng) 度 四 種 dNTP濃 度 應(yīng) 相 等 ,一 般 為 50-200mol/L 濃 度 過(guò) 高 易 產(chǎn) 生 錯(cuò) 誤 堿 基 的 摻 入 ， 濃 度 過(guò) 低 則 降 低 反 應(yīng) 產(chǎn) 量 dNTP可 與 Mg 2+結(jié) 合 ， 使 游 離 的 Mg2+濃 度 下 降 ， 影 響 DNA聚合 酶 的 活 性 。 （ 4） 模 板 單 、 雙 鏈 DNA均 可 。 不 能 混 有 蛋 白 酶 、 核 酸 酶 、 DNA聚 合 酶 抑 制 劑 、 DNA結(jié) 合 蛋 白 類 。 一 般 100ng DNA模 板 /100L。

6、模 板 濃 度 過(guò) 高 會(huì) 導(dǎo) 致 反 應(yīng) 的 非 特 異 性 增 加 。（ 5） 引 物 濃 度 0.1-1mol/L 濃 度 過(guò) 高 易 導(dǎo) 致 模 板 與 引 物 錯(cuò) 配 ,反 應(yīng) 特 異 性 下 降 。 引 物 長(zhǎng) 度 一 般 以 15 30bp為 宜 ,過(guò) 短 則 降 低 特 異 性 ， 過(guò) 長(zhǎng) 則 會(huì) 引 起 引 物間 退 火 而 影 響 有 效 擴(kuò) 增 。 避 免 引 物 內(nèi) 部 出 現(xiàn) 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) ， 避 免 序 列 內(nèi) 有 較 長(zhǎng) 的 回 文 結(jié) 構(gòu) ， 使 引 物 自身 不 能 形 成 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) 。 G /C和 A/T堿 基 均 勻 分 布 ， G /C含 量 在

7、 45 55%之 間 ， 引 物 堿 基 序 列 盡可 能 選 擇 堿 基 隨 機(jī) 分 布 ， 避 免 出 現(xiàn) 嘌 呤 或 嘧 啶 連 續(xù) 排 列 。 要 避 免 兩 個(gè) 引 物 間 特 別 是 3末 端 堿 基 序 列 互 補(bǔ) 以 及 同 一 引 物 自 身 3末 端堿 基 序 列 互 補(bǔ) 的 ， 使 它 們 不 能 形 成 引 物 二 聚 體 或 發(fā) 卡 結(jié) 構(gòu) 。 引 物 3末 端 堿 基 一 般 應(yīng) 與 模 板 DNA嚴(yán) 格 配 對(duì) ， 并 且 3末 端 為 G 、 C或 T時(shí)引 發(fā) 效 率 較 高 。 引 物 5末 端 堿 基 可 不 與 模 板 DNA匹 配 ， 可 添 加 與 模

8、 板 無(wú) 關(guān) 的 序 列 (如 限制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶 的 識(shí) 別 序 列 、 ATG 起 始 密 碼 子 或 啟 動(dòng) 子 序 列 等 )， 便 于 克 隆 和 表 達(dá) ， 但 其 保 護(hù) 堿 基 有 一 定 的 要 求 。 引 物 的 堿 基 順 序 不 能 與 非 擴(kuò) 增 區(qū) 有 同 源 性 。 （ 1） 變 性 使 雙 鏈 DNA解 鏈 為 單 鏈 ,95 3 5分 鐘 (2) 退 火 溫 度 由 引 物 長(zhǎng) 度 和 G C含 量 決 定 , 適 宜 的 退 火 溫 度 大 約 低 于 引 物Tm值 45-55 ， 介 于 45-55 。 增 加 溫 度 能 減 少 引 物 與 模

9、 板 的 非 特異 性 結(jié) 合 ;降 低 溫 度 可 增 加 反 應(yīng) 的 靈 敏 性 。（ 3） 延 伸 72 ， 延 伸 時(shí) 間 由 擴(kuò) 增 片 段 長(zhǎng) 度 決 定（ 4） 循 環(huán) 次 數(shù) 主 要 取 決 于 模 版 DNA的 濃 度 一 般 為 25-35次 次 數(shù) 過(guò) 多 ： 擴(kuò) 增 效 率 降 低 錯(cuò) 誤 摻 入 率 增 加 標(biāo) 準(zhǔn) 的 PCR反 應(yīng) 條 件10 緩 沖 液 10 L4種 dNTP混 合 物 各 200umol/L引 物 各 10 100pmol模 板 DNA 0.1 2gTaq DNA聚 合 酶 2.5UMg2+ 1.5mmol/L （ 一 ） 防 止 污 染試 劑

10、小 量 分 裝吸 頭 及 EP管 一 次 性 使 用器 皿 及 工 作 區(qū) 域 要 分 開 ，無(wú) 菌 操 作（ 二 ） 設(shè) 立 對(duì) 照陽(yáng) 性 對(duì) 照 ： 陽(yáng) 性 模 板陰 性 對(duì) 照 ： 陰 性 模 板試 劑 對(duì) 照 ： 除 模 板 外的 所 有 組 分 靈 敏 度 高1.皮 克 (pg=10-12)量 級(jí) 擴(kuò) 增 到 微 克 (ug=10-6)水平2.能 從 100萬(wàn) 個(gè) 細(xì) 胞 中 檢 出 一 個(gè) 靶 細(xì) 胞3.病 毒 檢 測(cè) 的 靈 敏 度 可 達(dá) 3個(gè) RFU4.細(xì) 菌 檢 測(cè) 的 最 小 檢 出 率 為 3個(gè) 細(xì) 菌簡(jiǎn) 便 、 快 速1.一 次 性 加 好 反 應(yīng) 液 ， 2 4 h

11、完 成 擴(kuò) 增2.擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 一 般 用 電 泳 分 析對(duì) 標(biāo) 本 的 純 度 要 求 低u血 液 、 體 腔 液 、 洗 嗽 液 、 毛 發(fā) 、 細(xì) 胞 、 活 組織 等 組 織 的 粗 提 DNA 1. 基 礎(chǔ) 研 究 基 因 或 cDNA 克 隆 ： 從 基 因 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 獲 得 某 一 基 因 或 cDNA 核 苷 酸 序 列 ,用 PCR 方 法 擴(kuò) 增 并 克 隆 該 基 因 或 cDNA。 基 因 表 達(dá) ： 用 RT-PCR檢 測(cè) 某 一 特 定 基 因 在 轉(zhuǎn) 錄 水 平 的 表 達(dá) 。2. 醫(yī) 學(xué) 感 染 性 疾 病 病 原 體 的 診 斷 ： H IV、 結(jié) 核 桿 菌 、 乙 肝 病 毒 等 。 遺 傳 病 相 關(guān) 基 因 檢 測(cè) ： 鐮 刀 型 細(xì) 胞 貧 血 、 血 友 病 。 惡 性 腫 瘤 的 診 斷 。3. 法 醫(yī) 學(xué) 中 的 基 因 和 親 子 鑒 定4. 考 古 學(xué) 中 生 物 種 類 間 的 親 緣 關(guān) 系 、 進(jìn) 化 途 徑 判 定5. 基 因 動(dòng) 、 植 物 的 檢 測(cè) 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 的 檢 測(cè) ： 檢 測(cè) 某 一 基 因 的 遺 傳 穩(wěn) 定 性 。 轉(zhuǎn) 基 因 植 物 的 檢 測(cè) ： 玉 米 、 大 豆 等 。