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1、3.3 離 子 交 換 法 3.3.1 原 理 概 述 ： 離 子 與 固 相 擔 體 帶 電 基 團 間 的 爭 奪 戰(zhàn) 3.2.2 交 換 介 質 ： 是 帶 有 電 荷 基 團 的 長 鏈 大 分 子 聚 合 物 3.3.3 緩 衝 液 與 層 析 系 統 ： 緩 衝 液 的 影 響 極 大 3.3.4 管 柱 操 作 方 法 ： 如 何 操 作 一 隻 離 子 交 換 管 柱 3.3.5 色 層 焦 集 法 ： 依 蛋 白 質 等 電 點 不 同 來 進 行 分 離 陰 離 子 交 換 法 Anion Exchange：擔 體+ + + + + + + + + 樣 本 分 子流 動 相

2、固 定 相 陽 離 子 基 團Counterion陰 離 子 + 質 子 可 以 吸 著 或 脫 離 一 基 團 ：Proton： 最 小 且 最 多 的 生 物 粒 子 ， 影 響 酸 鹼 度 及 分 子 帶 電 性 質H+lone pair electrons HHH+NHHN胺 基 H+羧 基 C OO H C OO 選擇離子交換介質： +Net Charge of a ProteinBuffer pHpI -3456789100 陰 離 子 交 換陽 離 子 交 換 陰 離 子 交 換 膠 體 的 pH 變 化 ：擔 體 OH-OH- pI = 6pH = 5pH = 7 -+Donn

3、an EffectOH-OH-+ 離 子 取 代 優(yōu) 先 順 序 Pecking Order：+ + + + + + + 電 荷 高 者離 子 大 者濃 度 大 者 陰離子交換法的分離範圍： 1005025 75 64kD pH Monobead 各 種 離 子 交 換 介 質 ：StrongWeakWeakStrong Resin / Polystyrene Glycan / Cellulose = X Anion Exchanger Cation Exchanger IRC-150Dowex-50Dowex-1Dowex-2Dowex-3IR-45 -NHR2+ -SO3-NR3+-COO

4、 -X = Sephadex, Sepharose, Sephacel or celluloseCM-XDEAE-XTEAE-X(QAE-X)Phospho-X陰 陽 強 弱 分 類 -OCH CH NHR222 +-NR3+ 42-PO2 -OCH COO 膠 體 的 組 成 與 外 型 ： CelluloseSephcelMonobeadPharmacia (1980) Separation News: 5 膠體外型影響流速與解析力 Pharmacia (1991) Ion Exchange Chroma tography Principles and Methods p.24 不 同 膠

5、 體 的 吸 著 容 量 有 很 大 差 異 ：DEAE-Sephadex A-25DEAE-Sephadex A-50DEAE-Sepharose CL-6BDEAE-Sephacel Lactalbumin Albumin Ferritin191104538 3110211586 214.38.6 Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0 mg / mL gelAdapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography Principles and Methods p.64 離 子 交 換 法 預 備 試 驗 ：

6、5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.5010 20 30 40 50 60 70 80 90 100pHNaClpH = 70.15 MNaClmg/mLprotein + Buffer + Gel SupSpin-downIncubation Spin Sup + SpindownAdapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography Principles and Methods p.70 Cap

7、acity 膠 柱 的 裝 填 方 法 ：緩衝 液平衡 溫度平衡靜置膠體清洗膠體 預估體積 裝填膠體暫停流洗 X 繼續(xù)流洗加 上 reservoir 已堆積沈積中上清 加壓流洗加 上 adaptor緊密堆積檢查好管柱是否暢通12 GelGel 液相層析管柱系統： A 緩衝液梯度製造器 幫 浦 記 錄 器監(jiān)視器管柱 膠體膠體裝填 分劃收集器(1) (2)(3) (4) (5)adapterreservoir轉接器 拉 鹽 梯 度 的 兩 種 方 式 ：連 續(xù) 梯 度 階 段 梯 度高限溶液 低限溶液 兩 種 方 式 均 可 ， 各 有 特 點 。 減少無效空間Pharmacia連 續(xù) 梯 度 連

8、 續(xù) 梯 度階 段 梯 度 Dead volume膠 柱 面 連續(xù)與階段梯度比較： 0.10.20.30.40.10.2 0.30.40 50 100 150 200 0 50 100 150 200Elution volume 連 續(xù) 梯 度階 段 梯 度蛋白質濃度 Adapted from Pharmacia: Ion Exchange C hromatography Principles and Methods 鹽濃度溶離條件比較： 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 1000.10.20.30.40.10.2 0.3蛋白質濃度 Elution volume

9、Adapted from Pharmacia: Ion Exchange Chromatography Principles and Methods NaCl 溶離體積會影響解析度： 0.5 M0.5 M0.5 M NaCl Elution volume Adapted from Pharmacia: Ion Exchange Chromatography Principles and Methods相對吸光度 100500 0 100 200 300100500100500 分 離 效 果 改 善但 是 濃 度 變 稀 管柱長短的影響： 0.03 0.04 0.06 0.1 0.2 0.51

10、.00 0.03 0.04 0.06 0.1 0.2 0.5 1.00蛋白質濃度 Acetate concentration (M) 5 cm cloumn10 cm cloumnA BA B 離 子 交 換 的 梯 度 溶 離 有 濃 縮 效 果 ：Salt gradient elution beginsSampleapplied Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification Principles and Practice p.112 離 子 交 換 法 操 作 要 點 ：膠 體 平 衡 用 過 的 膠 體 要 再 生 完 全 平 衡 在

11、 緩 衝液溶 離 方 式 通 常 都 以 氯 化 鈉 進 行 連 續(xù) 梯 度 溶離直 接 流 出 樣 本 亦 可 直 接 流 出 而 雜 質 被 吸 附緩 衝 溶 液 使 樣 本 分 子 帶 微 弱 正 負 電 荷 以 便 溶離非 專 一 性 緩 衝 液 加 低 鹽 可 洗 掉 雜 質 的 吸 附濃 度 體 積 高 低 限 溶 離 液 的 濃 度 及 體 積 要 適當管 柱 操 作 注 意 管 柱 裝 配 良 好 避 免 無 效 體 積樣 本 溶 液 要 平 衡 在 緩 衝 液 注 意 膠 柱 容 量 大小 離 子 交 換 法 實 例 ： Cellulase0.5 100 20 30 0.5

12、100 20Retention time (min)Mono Q HR 5/51 mL/min20 mM Tris, pH 7.6Crude cellulase 2.5 mg 0.5 M NaCl 0.2 M NaClMono S HR 5/51 mL/min20 mM Acetate, pH 3.6Q S- +Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography Principles and Methods p.127 離子交換法實例： 0.10.20.3 0 0.4 100 200 300 0.10.20.30NaClEluti

13、on volume蛋白質濃度活性 DEAE Sepharose CL-6BSS SDS-PAGE 色 層 焦 集 法 如 何 拉 出 pH 梯 度 ：6 99 876 Volume實 際 結 果 無 法 拉 出 pH 梯 度緩 衝 作 用 9876 Volume假 如 含 有 許多 緩 衝 分 子 Polybuffer 含有連續(xù) pKa 的緩衝分子 (ampholyte) 可拉出連續(xù) pH 梯度69pH9876 ? 9876 3.3.5 色 層 焦 集 法 Chromatofocusing其 介 質 也 是 一 種 離 子 交 換 介 質但 所 使 用 的 Polybuffer 可 拉 出 穩(wěn)

14、 定 的 pH 梯 度 +色析焦集法的焦集機制： 8765 + - 0+Polybuffer 焦 集 在 等 電 點超 越 等 電 點 (帶 負 電 ) 被 吸 附在 低 pH 處 帶 正 電 被 排 斥 +Net Charge of a ProteinBuffer pHIsoelectric point,pI -3456789100環(huán)境影響分子的帶電性質： 抹香鯨肌紅蛋白 (pI = 8.2) 追過 馬肌紅蛋白 (pI = 7.4) KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%

15、v(G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgS

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20、Wo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H

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23、fQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B

24、3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A19KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmX

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26、9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&

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30、iUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNf