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1、體細胞雜交技術(shù)的應(yīng)用原生質(zhì)體融合雜種細胞發(fā)育動態(tài)及體細胞雜種鑒定體細胞雜交的概念第 一 節(jié) 體 細 胞 雜 交 一 、 體 細 胞 雜 交 的 概 念 概 念 ： 體 細 胞 雜 交 ， 即 原 生 質(zhì) 體 融 合 ， 將 兩 個 不 同 親 本 的 原 生 質(zhì) 體 ，經(jīng) 人 工 誘 導(dǎo) 融 合 并 培 養(yǎng) 再 生 成 株 的 過 程 ， 統(tǒng) 稱 為 體 細 胞 雜 交 （ A + B） 。 幾 種 不 同 的 表 述 ： 體 細 胞 雜 交 ： Somatic hybridization 細 胞 融 合 ： Cell fusion 原 生 質(zhì) 體 融 合 ： Protoplast fusio

2、n 無 性 雜 交 ： asexual hybridization 超 性 雜 交 ： Parasexual hybridization 超 性 融 合 ： Parasexual fusion 細 胞 操 作 ： Cell manipulation 細 胞 工 程 （ Cell engineering） 體 細 胞 雜 交 與 有 性 雜 交 的 異 同比 較 內(nèi) 容 體 細 胞 雜 交 有 性 雜 交時 間 無 季 節(jié) 限 制 花 期 限 制 ， 特 別是 母 本 的 花 期親 緣 關(guān) 系 一 定 程 度 上 可 以克 服 有 性 /嫁 接 不親 和 性 受 親 和 性 影 響結(jié) 果 細 胞

3、 核 、 細 胞 質(zhì)均 可 以 重 組 、 倍性 增 加 雙 受 精 ， 一 般 無細 胞 質(zhì) 重 組 ， 倍性 不 改 變 + 體 細 胞 雜 交 有 性 雜 交 Possible Result of Fusion of Two Genetically Different Protoplasts= chloroplast= nucleusFusion heterokaryon cybrid cybridhybrid hybrid = mitochondria 原 生 質(zhì) 體 融 合 的 有 關(guān) 名 詞 -Il 對 稱 雜 種 （ 雙 親 給 雜 種 貢 獻 的 遺 傳 物 質(zhì) 均 為 100

4、%）l 非 對 稱 雜 種 （ 雙 親 給 雜 種 貢 獻 的 遺 傳 物 質(zhì) 不 等 （ 相 對 值 ） 胞 質(zhì) 雜 種 （ cytoplasmic hybrid, Cybrid） ： 細 胞 質(zhì) 重 組 ， 細 胞 核未 重 組l 對 稱 融 合 （ symmetric fusion） 也 稱 標(biāo) 準(zhǔn) 融 合 （ Standard fusion）l 非 對 稱 融 合 （ asymmetric fusion） ： 融 合 前 對 一 方 進 行處 理 ， 使 其 染 色 體 丟 失 一 部 分 原 生 質(zhì) 體 融 合 的 有 關(guān) 名 詞 -IIl 供 -受 體 融 合 ： Donor-re

5、cipient fusionl 體 配 融 合 （ gameto-somatic fusion） （ 性 細 胞 與 體 細 胞融 合 ）l 亞 原 生 質(zhì) 體 -原 生 質(zhì) 體 融 合 ： Subprotoplast-protoplast fusion 小 原 生 質(zhì) 體 ： Miniprotoplast 微 原 生 質(zhì) 體 ： Microprotoplast 胞 質(zhì) 體 ： Cytoplast l 胞 質(zhì) 體 -原 生 質(zhì) 體 融 合 : Cytoplast-protoplast fusion 發(fā) 展 歷 程l 70年 代 ， 技 術(shù) 建 立 和 完 善 優(yōu) 化 1972年 獲 得 煙 草

6、 種 間 體 細 胞 雜 種 1975年 高 Ca高 pH加 PEG融 合 方 法 ， 電 融 合 法 大 量 成 功 報 道 ， 不 少 為 異 想 天 開 的 實 驗l 80年 代 初 ， 由 模 式 植 物 轉(zhuǎn) 向 農(nóng) 作 物 /經(jīng) 濟 作 物 ， 對 稱 融 合 到非 對 稱 融 合 ， 創(chuàng) 造 新 種 質(zhì) 的 技 術(shù) 手 段 l 80年 代 末 ， 大 量 木 本 植 物 細 胞 融 合 成 功 的 報 道l 90年 代 至 今 ， 成 為 一 種 育 種 手 段 1960年 ， Kocking用 酶 法 制 備 高 等 植 物 原 生 質(zhì) 體 首 次 獲 得 成 功 ；1971年

7、， Takebe首 次 從 離 體 煙 草 原 生 質(zhì) 體 培 養(yǎng) 中 獲 得 再 生 完 整 植 株 ；1972年 ， Carlson首 次 獲 得 粉 藍 煙 草 和 郎 氏 煙 草 的 細 胞 雜 種 ， 這 是 第 一個 植 物 體 細 胞 雜 種 ；1974年 ， Kao將 聚 乙 二 醇 （ PEG） 誘 導(dǎo) 融 合 法 應(yīng) 用 于 植 物 細 胞 融 合 并 建 立了 相 應(yīng) 的 融 合 技 術(shù) ；1978年 ， Melchers獲 得 第 一 個 屬 間 體 細 胞 雜 種 （ 番 茄 馬 鈴 薯 ） ；1981年 ， Zimmerman發(fā) 明 了 電 融 合 儀 ， 并 首

8、次 提 出 了 電 融 合 概 念 ；1987年 ， Schweiger建 立 了 單 對 原 生 質(zhì) 體 電 融 合 技 術(shù) 程 序 。植 物 體 細 胞 雜 交 的 幾 個 重 要 進 展 理 論 上 ， 任 何 細 胞 都 可 能 通 過 體 細 胞 雜 交 而 成 為 新 的 生 物 資源 。 這 對 于 種 質(zhì) 資 源 的 開 發(fā) 和 利 用 具 有 深 遠 的 意 義 。融 合 過 程 不 存 在 有 性 雜 交 過 程 中 的 種 性 隔 離 機 制 的 限 制 ， 為遠 緣 物 種 間 的 遺 傳 物 質(zhì) 交 換 提 供 了 有 效 途 徑 。體 細 胞 雜 交 產(chǎn) 生 的 雜

9、 種 細 胞 含 有 來 自 雙 親 的 核 外 遺 傳 系 統(tǒng) ，在 雜 種 的 分 裂 和 增 殖 過 程 中 雙 親 的 葉 綠 體 、 線 粒 體 DNA亦 可發(fā) 生 重 組 ， 從 而 產(chǎn) 生 新 的 核 外 遺 傳 系 統(tǒng) 。 根 據(jù) 融 合 時 細 胞 的 完 整 程 度 ， 原 生 質(zhì) 體 融 合 可 分 為 兩大 方 式 ： 對 稱 融 合 （ symmetric fusion） 即 兩 個 完 整 的細 胞 原 生 質(zhì) 體 融 合 。非 對 稱 融 合 （ asymmetric fusion） 利 用 物 理或 化 學(xué) 方 法 使 某 親 本 的 核 或 細 胞 質(zhì) 失 活

10、 后 再 進 行融 合 。 用 于 細 胞 核 或 細 胞 質(zhì) 失 活 的 方 法 分 為 物 理 和 化 學(xué) 兩大 類 ： 物 理 方 法 常 采 用 射 線 處 理 ， 如 X射 線 、 射 線 等 ，使 細 胞 核 失 活 ； 化 學(xué) 處 理 目 前 常 用 的 試 劑 ： 核 失 活 碘 乙 酰 胺（ IOA） 、 碘 乙 酸 (Iodoacetate)； 質(zhì) 失 活 羅 丹明 （ R 6 G， 它 是 一 種 親 脂 染 料 ， 能 夠 抑 制 線粒 體 的 氧 化 磷 酸 化 過 程 而 達 到 失 活 作 用 。 二 、 原 生 質(zhì) 體 融 合融合方法原生質(zhì)體融合過程影響原生質(zhì)體

11、融合的因素 融 合 方 法PEG融 合 電 融 合Polyethylene glycol （ PEG）Electrofusion, Electrically induced fusion 1. PEG誘 導(dǎo) 融 合 法 PEG誘 導(dǎo) 融 合 的 特 點 ： 優(yōu) 點 是 融 合 成 本 低 ， 勿 需 特 殊設(shè) 備 ； 融 合 子 產(chǎn) 生 的 異 核 率 較 高 ； 融 合 過 程 不 受 物 種限 制 。 缺 點 是 融 合 過 程 繁 瑣 ， PEG可 能 對 細 胞 有 毒害 。 PEG作 用 機 理 ： Kao等 認(rèn) 為 ， 由 于 PEG分 子 具 有 輕 微的 負 極 性 ， 故 可

12、 以 與 具 有 正 極 性 基 團 的 水 、 蛋 白 質(zhì) 和碳 水 化 合 物 等 形 成 H鍵 ， 從 而 在 原 生 質(zhì) 體 之 間 形 成 分 子橋 ， 其 結(jié) 果 使 原 生 質(zhì) 體 發(fā) 生 粘 連 進 而 促 進 原 生 質(zhì) 體 融合 ； 另 外 ， PEG能 增 加 類 脂 膜 的 流 動 性 ， 也 使 原 生 質(zhì)體 的 核 、 細 胞 器 發(fā) 生 融 合 成 為 可 能 。 融 合 液 ： CaCl2 2H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol 甘 露 醇 或 山 梨 醇 0.51.0mol pH 5.6 誘 導(dǎo) 液 ： 融 合 液 PEG 20 45 稀 釋

13、液 ： A液 （ g/100ml） pH6.0 B液 (g/100ml) pH10.5 葡 萄 糖 7.21 甘 氨 酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169 P1 P2P1 P2混 合 靜 止 1 min.融 合融 合 液加 入 PEG稀 釋 洗 滌加 入 稀 釋 液 加 入 培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng)選 擇 2 電 融 合 法 Electrofusion, Electrically induced fusion 與 PEG融 合 相 比 ， 電 融 合 有 三 大 優(yōu) 點 ： 不 存 在 對 細 胞 的 毒 害 問 題 ； 融 合 效 率 高 ； 融 合 技 術(shù) 操 作

14、 簡 便 。Electrofusion: A high frequency AC field is applied between 2 electrodes immersed in the suspension of protoplasts- this induces charges on the protoplasts and causes them to arrange themselves in lines between the electrodes to form pearl-chain. They are then subject to a high voltage dischar

15、ge which causes their membranes to fuse where they are in contact. 電 融 合 儀 的 結(jié) 構(gòu) 特 點 ： 交 變 電 場 部 分 高 頻 直 流 電 擊 部 分 電 融 合 的 基 本 過 程 ： 細 胞 膜 的 接 觸 ： 當(dāng) 原 生 質(zhì) 體 置 于 電 導(dǎo) 率 很 低 的 溶 液 中時 ， 電 場 通 電 后 ， 電 流 即 通 過 原 生 質(zhì) 體 而 不 是 通 過 溶 液 ，其 結(jié) 果 是 原 生 質(zhì) 體 在 電 場 作 用 下 極 化 而 產(chǎn) 生 偶 極 子 ， 從而 使 原 生 質(zhì) 體 緊 密 接 觸 排 列 成

16、串 ； 膜 的 擊 穿 ： 原 生 質(zhì) 體 成 串 排 列 后 ， 立 即 給 予 高 頻 直 流脈 沖 就 可 以 使 原 生 質(zhì) 膜 擊 穿 ， 從 而 導(dǎo) 致 兩 個 緊 密 接 觸 的細 胞 融 合 在 一 起 并 圓 球 化 。 關(guān) 于 融 合 參 數(shù) ： 交 流 電 壓 交 變 電 場 的 振 幅 頻 率 交 變 電 場 的 處 理 時 間 直 流 高 頻 電 壓 脈 沖 寬 度 脈 沖 次 數(shù) 膜 的 融 合細 胞 質(zhì) 融 合 發(fā) 生 膜 融 合 后 的 數(shù) 小 時 核 融 合 融 合 可 能 發(fā) 生 在 細 胞 間 期 ， 也 可 能 發(fā) 生在 第 一 次 同 步 分 裂 過

17、程 中 影 響 原 生 質(zhì) 體 融 合 的 因 素 原 生 質(zhì) 體 質(zhì) 量 對 細 胞 融 合 起 著 至 關(guān) 重 要 的 作 用 ，高 質(zhì) 量 的 原 生 質(zhì) 體 是 細 胞 融 合 的 首 要 條 件 融 合 方 法 融 合 參 數(shù) ， 包 括 各 種 融 合 液 都 應(yīng) 選 擇 適 當(dāng) 三 、 雜 種 細 胞 的 發(fā) 育 動 態(tài)及 體 細 胞 雜 種 鑒 定雜 種 細 胞 的 發(fā) 育 動 態(tài) 雜 種 細 胞 選 擇 系 統(tǒng)與 體 細 胞 雜 種 植 株 鑒 定體 細 胞 雜 種 的 特 點 體 細 胞 雜 種 后 代 的 遺 傳 雜 種 細 胞 的 發(fā) 育 動 態(tài) 核 融 合 核 重 組

18、 細 胞 器 重 組 部 分 核 物 質(zhì) 或 細 胞 器 丟 失 核 分 裂 的 非 同 步 性 雜 種 細 胞 選 擇 系 統(tǒng) 與 雜 種 植株 鑒 定1 雜 種 細 胞 的 選 擇 系 統(tǒng) 外 觀 選 擇 ： 質(zhì) 體 、 細胞 體 積 等 互 補 選 擇 ： 抗 生 素 、營 養(yǎng) 缺 陷 型 等 熒 光 標(biāo) 記 選 擇 ： 親 本標(biāo) 記 不 同 熒 光 2 體 細 胞 雜 種 鑒 定 形 態(tài) 鑒 定 ： 根 據(jù) 雙 親 的 形 態(tài) 學(xué) 性 狀 觀 察 進行 鑒 定 。 細 胞 學(xué) 鑒 定 ： 細 胞 器 鑒 定 、 染 色 體 鑒 定 、染 色 體 原 位 雜 交 生 化 鑒 定 ： 同

19、功 酶 鑒 定 分 子 鑒 定 ： RFLP、 RAPD、 SSR等 分 子 標(biāo) 記 形態(tài)鑒定和同功酶鑒定 染 色 體 原 位 雜 交GISH、 FISH RAPD標(biāo) 記 鑒 定 510 1100670 bp75025050020001000bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 體 細 胞 雜 種 的 遺 傳1 細 胞 分 裂 與 染 色 體 丟 失 如 果 細 胞 分 裂 而 核 不 發(fā) 生 融 合 ， 在 以 后 的 發(fā) 育 過程 中 會 有 兩 種 結(jié) 果 ： 一 是 細 胞 分 裂 幾 次 后 即 停 止生 長 從 而 導(dǎo) 致 死 亡 ； 二 是 在

20、發(fā) 育 過 程 中 某 一 親 本的 細 胞 核 部 分 或 全 部 丟 失 。 減 數(shù) 分 裂 時 染 色 體 配 對 異 常 ： 環(huán) 形 、 染 色 體 橋 等 。 2 基 因 轉(zhuǎn) 移 與 性 狀 表 達 由 于 染 色 體 的 部 分 丟 失 ， 常 常 使 某 個 親 本 的 部分 或 個 別 基 因 與 另 一 親 本 的 染 色 體 發(fā) 生 整 合 ，其 結(jié) 果 是 實 現(xiàn) 了 親 本 間 的 基 因 轉(zhuǎn) 移 。 基 因 轉(zhuǎn) 移通 常 在 后 代 中 某 些 性 狀 得 以 表 達 ， 有 時 由 于 基因 的 重 組 也 可 能 產(chǎn) 生 雙 親 均 沒 有 的 新 性 狀 。 3

21、 體 細 胞 雜 種 遺 傳 上 的 不 穩(wěn) 定 性 體 細 胞 雜 種 后 代 在 遺 傳 上 常 常 不 穩(wěn) 定 ， 這 可 能涉 及 到 多 方 面 的 因 素 ， 如 親 緣 關(guān) 系 的 遠 近 、培 養(yǎng) 過 程 中 的 染 色 體 變 異 、 細 胞 核 、 細 胞 質(zhì)遺 傳 物 質(zhì) 的 重 組 等 。 4 體 細 胞 雜 種 的 核 質(zhì) 遺 傳1） 核 遺 傳 ： 雙 親 之 和 ， 少 數(shù) 有 重 組 和 丟 失2） 線 粒 體 遺 傳 ： 往 往 有 重 組 ， 柑 橘 上 例 外 ， 僅 來 自 愈傷 組 織 親 本3） 葉 綠 體 遺 傳 ： 隨 機 分 離 ， 也 有 共

22、 存 現(xiàn) 象 四 、 體 細 胞 雜 交 技 術(shù) 的 應(yīng) 用獲得新物種獲得新種質(zhì)和新品種轉(zhuǎn)移細胞質(zhì)基因控制性狀體細胞雜交技術(shù)展望 體 細 胞 雜 交 技 術(shù) 的 應(yīng) 用l 克 服 生 殖 障 礙 ， 創(chuàng) 造 新 種 質(zhì) ；l 轉(zhuǎn) 移 有 益 性 狀 ， 改 良 作 物 品 質(zhì) ；l 轉(zhuǎn) 移 部 分 染 色 體 ， 創(chuàng) 造 非 對 稱 雜 種 ；l 轉(zhuǎn) 移 胞 質(zhì) 基 因 組 ， 創(chuàng) 造 胞 質(zhì) 雜 種 ；l 作 為 育 種 中 間 材 料 （ bridge material） ， 進 一步 用 于 作 物 改 良 。 雜 種 組 合 新 屬蘿 卜 Raphanus sativus（ 2n=18

23、） + 甘 藍 Brassica oleracea（ 2n=18） Raphanobrassica甘 藍 Brassica oleracea（ 2n=18） + Moricandia arvensis（ 2n=27,28） Moricandiobrassica芝 麻 菜 Eruca sativa（ 2n=22） + 甘 藍 型 油 菜 Brassica napus（ 2n=38） Erucobrassica二 行 芥 Diplotaxis muralis（ 2n=42） + 甘 藍 型 油 菜 Brassica napus（ 2n=38） Diplotaxobrassica 煙 草 Nicot

24、iana tabacum（ 2n=24） + 番 茄 Lycopersicon esculentum（ 2n=24） Nicotiopersicon馬 鈴 薯 Solanum tuberosum（ 2n=24） + 番 茄 Lycopersicon esculentum（ 2n=24） Solanopersicon曼 陀 羅 Datura innoxia（ 2n=48） + 顛 茄 Atropa belladona（ 2n=24） Daturotropa水 稻 Oryza sativa（ 2n=24） + 稻 稗 Echinochloa oryzicola（ 2n=24） Oryzochloa

25、 通 過 原 生 質(zhì) 體 融 合 獲 得 的 屬 間 體 細 胞 雜 種 體 細 胞 雜 種 性 狀抗 性Nicotiana tabacum + N.nesophila 煙 草 花 葉 病 毒 （ tobacco mosaic virus，TMV）Solamun tuberosum + S.chacoense 馬 鈴 薯 X病 毒 （ potato virus X， PVX）N.tabacum + N.nesophila 煙 草 角 蠕 蟲 （ tobacco horn worm）S.tuberosum + S.brevidens 馬 鈴 薯 卷 葉 病 毒 （ potato leaf rol

26、l virus， PLRV） ， 晚 疫病 （ late blight） ， 馬 鈴 薯 Y病 毒 （ potato virus Y， PVY）S.circalifolium + S.tuberosum 疫 霉 屬 （ Phytophthora）S.melongena + S.sanitwongsei 青 枯 假 單 胞 菌 （ Pseudomonas solanacearum）S.tuberosum + S.commersonii 耐 霜 凍 （ frost tolerance） Brassica.napus + B.nigra 十 字 花 科 黑 脛 菌 （ Phoma lingam）B.

27、oleracea + Sinapis alba 甘 藍 長 尾 交 鏈 孢 霉 （ Alternaria brassiceae）B.napus + Sinapis alba 甘 藍 長 尾 交 鏈 孢 霉 （ Alternaria brassiceae）Citrus sinensis + Poncirus trifoliata 腳 腐 病 （ Phytophthora）Lycopersicon esculentum + L.peruvianum 煙 草 花 葉 病 毒 （ TMV） ， 斑 萎 病 毒 （ spotted wilt virus） ， cold tolerance 原 生 質(zhì) 體

28、 融 合 轉(zhuǎn) 移 的 一 些 遺 傳 性 狀 農(nóng) 藝 性 狀 （ 通 過 胞 質(zhì) 雜 種 轉(zhuǎn) 移 ） N.tabacum + N.sylvestris 鏈 霉 素 抗 性 （ Streptomycin resistance） 三 嗪 抗 性 （ Triazine resistance）S.nigrum + S.tuberosum 三 嗪 抗 性 （ Triazine resistance）B.nigra + B.napus 潮 霉 素 抗 性 （ hygromycin resistance）N.tabacum + N.sylvestris 細 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 （ CMS） B.camp

29、estris + B.napus 細 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 （ CMS）B.napus + B.campestris + Raphanus sativa 細 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 （ CMS） 和 三 嗪 抗 性（ Triazine resistance）L.esculentum + Solanum acaule 細 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 （ CMS）B.napus + B.tournefortii 細 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 （ CMS） 柑 橘 體 細 胞 雜 交 策 略Strategies for Protoplast Fusion in Citrus Scion + Scion

30、Rootstock + Rootstock Citrus + Other Genera 2X + 4X 2X + 2X: 2X cybrid or asymmetric SH X + 2X: seedless 3X (Japan, France) 針 對 柑 橘 育 種 實 踐 ， 我 國 HZAU已 獲 得 40余 例 柑 橘屬 間 、 種 間 體 細 胞 雜 種 /胞 質(zhì) 雜 種 ； 典 型 組 合 ： 柑 橘 + 金 柑 、 紅 桔 + 枳 、 柑 橘 + 九里 香 、 柑 橘 + 黃 皮 、 臍 橙 + 葡 萄 柚 、 溫 州 蜜 柑 + 雜 種 柚 等 ； 世 界 共 獲 得 250

31、例 以 上 ， 中 國 （ 40） 、 美 國 （ 120） 、 日 本 （ 20） 、 法 國 （ 15） 、 意 大 利 （ 5） 、 西班 牙 （ 10） 、 巴 西 （ 15） 、 以 色 列 （ 5） 等 國 。世 界 柑 橘 體 細 胞 雜 種 創(chuàng) 造 概 況 Kobayashi S et al. J Japan Soc Hort Sci, 1995, 64: 283-289 柑 橘 體 細 胞 雜 種 的 應(yīng) 用l 與 二 倍 體 有 性 雜 交 ， 培 育 三 倍 體 ；l 進 行 二 倍 體 柚 癟 籽 果 實 生 產(chǎn) ；l 直 接 作 為 二 倍 體 、 四 倍 體 鮮 食

32、 品 種 ；l 砧 木 育 種 ；l 基 礎(chǔ) 理 論 研 究 的 理 想 材 料 以 異 源 四 倍 體 為 父 本 培 育 三 倍 體 的 優(yōu) 點l 親 本 來 源 廣 泛 ， 目 前 全 世 界 200余 例 ；l 花 粉 育 性 比 同 源 四 倍 體 高 ；l 通 過 倍 性 雜 交 獲 得 的 三 倍 體 為 三 親 雜 種 ， 遺 傳 基礎(chǔ) 更 為 廣 泛 ， 有 利 于 篩 選 優(yōu) 質(zhì) 、 多 抗 柑 橘 類 型 。 本 章 思 考 題l 概 念 ： 原 生 質(zhì) 體 、 原 生 質(zhì) 體 融 合 /體 細 胞 雜 交 等 有 關(guān)名 詞l 簡 答 題 ：l 原 生 質(zhì) 體 培 養(yǎng) 方 法 及 各 自 特 點 ？l PEG融 合 與 電 融 合 各 有 何 特 點 ？ 電 融 合 的 原 理 是 什 么 ？l 植 物 體 細 胞 雜 種 如 何 篩 選 和 鑒 定 ？ l 植 物 體 細 胞 雜 種 在 育 種 上 的 應(yīng) 用 有 哪 些 ？