牛奶中活性物質(zhì)的分析牛奶中活性物質(zhì)的分析1優(yōu)選內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容v1牛奶中水分含量的測(cè)定牛奶中水分含量的測(cè)定v2牛奶中粗脂肪的提取與牛奶中粗脂肪的提取與測(cè)定測(cè)定v3牛奶中酪蛋白的提取牛奶中酪蛋白的提取v4蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的測(cè)定2優(yōu)選內(nèi)容（1）牛奶中水分含量的測(cè)定）牛奶中水分含量的測(cè)定v水分是食品分析的重要項(xiàng)目之一。水分測(cè)定對(duì)于計(jì)算生產(chǎn)中的物料平衡，和實(shí)行工藝監(jiān)督等方面，有很重要的意義。各種食品水分的含量差別很大。例如，鮮果為69.7%-92.5%，鮮菜為79.7%-97.1%，鮮瘦肉52.6-77.4%，面粉12-14%。面包水分隨品種不同略有差異，一般為32-42%v水分測(cè)定法通常可分為直接法直接法和間接法間接法兩類。利用水分本身的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)測(cè)定水分的方法，叫做直接法，直接法，如重量法，蒸餾法和卡爾.費(fèi)休法等；利用食品的比重，折射率，電導(dǎo)，介電常數(shù)等物理性質(zhì)測(cè)定水分的方法，叫做間接法。間接法。測(cè)定水分的方法要根據(jù)食品的性質(zhì)和測(cè)定目的來(lái)選定3優(yōu)選內(nèi)容一一 重量法重量法凡操作過(guò)程中包括有稱量步驟的測(cè)定方法，統(tǒng)稱為重量法，如烘箱干燥法，紅外線干燥法，干燥劑法等。v烘箱干燥法烘箱干燥法在一定溫度和壓力條件下，將樣品加熱干燥，以排除其中水分的方法，叫做烘箱干燥法。它包括常壓烘箱法和真空烘箱干燥法。這種測(cè)定方法費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，但操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用范圍較廣。v應(yīng)用本法測(cè)定水分的樣品應(yīng)符合下述條件：應(yīng)用本法測(cè)定水分的樣品應(yīng)符合下述條件：(1)水分是唯一的揮發(fā)物質(zhì)；(2)水分的排除情況很完全；(3)食品中其他組分在加熱過(guò)程中由于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而引起的重量變化可以忽略。4優(yōu)選內(nèi)容二二 材料與儀器材料與儀器v材料全脂牛奶層析濾紙v器材常壓電熱烘箱干燥器電子分析天平5優(yōu)選內(nèi)容三三 操作步驟操作步驟v取一張12cm*12cm70過(guò)夜烘干的層析濾紙，稱重，記為m1。準(zhǔn)確稱取一定量牛奶m2，滴于濾紙上，70烘干后稱重，記為m3。計(jì)算水分含量。v干物質(zhì)質(zhì)量m4=m3-m1v水分含量（%）=（m2-m4）/m21006優(yōu)選內(nèi)容（2）粗脂肪的定量測(cè)定）粗脂肪的定量測(cè)定索氏提取法索氏提取法一一、目的要求、目的要求學(xué)習(xí)和掌握粗脂肪的定量測(cè)定法索氏提取法7優(yōu)選內(nèi)容二、原理二、原理v脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸結(jié)合成的脂類化合物,能溶于脂溶性有機(jī)溶劑。v本實(shí)驗(yàn)用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑將脂肪提取出來(lái)，借蒸發(fā)除去溶劑后稱量。整個(gè)提取過(guò)程均在索氏提取器中進(jìn)行。通常使用的脂溶性溶劑為乙醚或沸點(diǎn)為30C-60 C的石油醚。用此法提取的脂溶性物質(zhì)除脂肪外，還含有游離脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故稱為“粗脂肪”。8優(yōu)選內(nèi)容三、三、適用范圍與特點(diǎn)適用范圍與特點(diǎn)v適用于脂類含量較高，結(jié)合態(tài)脂類含量少或經(jīng)適用于脂類含量較高，結(jié)合態(tài)脂類含量少或經(jīng)水解處理過(guò)的，（結(jié)合態(tài)已轉(zhuǎn)變成游離態(tài)），水解處理過(guò)的，（結(jié)合態(tài)已轉(zhuǎn)變成游離態(tài)），樣品應(yīng)能烘干，磨細(xì)，不易吸濕結(jié)塊。樣品應(yīng)能烘干，磨細(xì)，不易吸濕結(jié)塊。v此法經(jīng)典，對(duì)大多數(shù)樣品的測(cè)定結(jié)果比較可靠。此法經(jīng)典，對(duì)大多數(shù)樣品的測(cè)定結(jié)果比較可靠。但費(fèi)時(shí)長(zhǎng)（但費(fèi)時(shí)長(zhǎng)（816 h）溶劑用量大，需要專門）溶劑用量大，需要專門的儀器的儀器,索氏提取器。索氏提取器。9優(yōu)選內(nèi)容四四 材料、試劑與器材材料、試劑與器材v材料：全脂牛奶v試劑：乙醚v器材：索氏提取器、干燥箱、電子分析天平10優(yōu)選內(nèi)容索氏提取器構(gòu)造索氏提取器構(gòu)造11優(yōu)選內(nèi)容五、操作方法五、操作方法1抽提筒的準(zhǔn)備抽提筒的準(zhǔn)備2抽提抽提將測(cè)定完水分帶有干物質(zhì)的濾紙折成小包放入抽提筒，再放入索氏抽提器內(nèi)，連接已干燥至恒重（m5）的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入無(wú)水乙醚，加量為接受瓶的23體積，于60水浴上加熱，使乙醚不斷的回流提取，一般視含油量高低提取612小時(shí)，至抽提完全為止（用濾紙?jiān)嚕?2優(yōu)選內(nèi)容3 3 稱重稱重v取下接受瓶，回收乙醚，待接受瓶?jī)?nèi)乙醚剩12ml時(shí)，在水浴上蒸干，再于100105干燥2小時(shí)，取出放干燥器內(nèi)冷卻30分鐘，稱重，并重復(fù)操作至恒重（m6）。v取出濾紙包，于戶外晾至無(wú)乙醚味，置入恒溫箱內(nèi)，烘干，然后移入干燥缸內(nèi)冷卻后稱重，重復(fù)操作至恒重（m7）。13優(yōu)選內(nèi)容六六結(jié)果處理結(jié)果處理v方法一 脂肪脂肪()(m6-m5)/m4 100m6接受瓶和脂肪的質(zhì)量，接受瓶和脂肪的質(zhì)量，g；m5接受瓶的質(zhì)量，接受瓶的質(zhì)量，g；m4樣品的質(zhì)量樣品的質(zhì)量(如為測(cè)定水分如為測(cè)定水分 后的后的 樣品質(zhì)量計(jì)樣品質(zhì)量計(jì))，g。v方法二脂肪脂肪()(m3-m7)/m4 100m3未抽提濾紙包的質(zhì)量，未抽提濾紙包的質(zhì)量，g；m7抽提后濾紙包的質(zhì)量，抽提后濾紙包的質(zhì)量，g；m4樣品的質(zhì)量樣品的質(zhì)量(如為測(cè)定水分如為測(cè)定水分 后的后的 樣品質(zhì)量計(jì)樣品質(zhì)量計(jì))，g。14優(yōu)選內(nèi)容七、注意事項(xiàng)七、注意事項(xiàng)v乙醚為易燃有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持通風(fēng)并禁止任何明火。v抽提用的乙醚或石油醚要求無(wú)水、無(wú)醇、無(wú)過(guò)氧化物，揮發(fā)殘?jiān)康?。因水和醇可?dǎo)致水溶性物質(zhì)溶解，如水溶性鹽類、糖類等，使得測(cè)定結(jié)果偏高，被測(cè)樣品也要事先烘干。過(guò)氧化物會(huì)導(dǎo)致脂肪氧化，在烘干時(shí)也有引起爆炸的危險(xiǎn)。v裝樣品的濾紙筒一定要嚴(yán)密，不能往外漏樣品，也但不要包得太緊影響溶劑滲透。放入濾紙筒時(shí)高度不要超過(guò)回流彎管，否則超過(guò)彎管的樣品中的脂肪不能提盡，造成誤差。15優(yōu)選內(nèi)容八、思考題八、思考題(1)本實(shí)驗(yàn)制備得到的是粗脂肪,若要制備單一組分的脂類成分,可用什么方法進(jìn)一步處理？(2)本實(shí)驗(yàn)樣品制備時(shí)烘干為什么要避免過(guò)熱16優(yōu)選內(nèi)容（3）酪蛋白的提?。├业鞍椎奶崛∫灰?、目的要求、目的要求v掌握一種提取酪蛋白的方法v掌握一種檢測(cè)牛乳質(zhì)量的方法17優(yōu)選內(nèi)容二二 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理v酪蛋白是乳蛋白質(zhì)中最豐富的一類蛋白質(zhì)，占乳蛋白的80%82%，酪蛋白不是單一的蛋白質(zhì)，是一類含磷的復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結(jié)合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35g/L，比較穩(wěn)定，利用這一性質(zhì)可以檢測(cè)牛乳中是否摻假。v酪蛋白在其等電點(diǎn)時(shí)由于靜電和為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質(zhì)，將牛乳調(diào)到pH4.6，酪蛋白就可從牛乳中分離出來(lái)。酪蛋白不溶于乙醇，這個(gè)性質(zhì)被用來(lái)從酪蛋白粗制劑中將脂類雜志除去。18優(yōu)選內(nèi)容三三 儀器、原料和試劑儀器、原料和試劑v儀器：溫度計(jì)、布氏漏斗、pH試紙、抽濾瓶、水浴鍋、燒杯、量筒、表面皿、天平、離心機(jī)等v原料：市售全脂牛奶v試劑：無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚pH4.7乙酸鈉緩沖液0.2mol/L乙醇、乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（體積比）19優(yōu)選內(nèi)容四四 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟v1、酪蛋白等電點(diǎn)沉淀將100mL牛乳放到500mL燒杯中，加熱到40，加入到同樣40的乙酸鈉緩沖液中，調(diào)pH達(dá)4.7。此時(shí)有絮狀的蛋白質(zhì)沉淀析出。將懸浮液冷卻至室溫，室溫放置分層，3000r/min離心15min，收集沉淀。v2、水洗將pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用蒸餾水稀釋10倍，洗滌粗制品三次，分別離心10分鐘，得到沉淀蛋白。v3、去脂將粗制品中加入10ml無(wú)水乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗滌沉淀兩次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。將沉淀從布氏漏斗中移去，在表面皿上攤開(kāi)以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白純品。準(zhǔn)確稱重后，計(jì)算出每100mL牛乳所制備出的酪蛋白質(zhì)量（g/100mL），并與理論產(chǎn)量（3.5g/100mL）相比較，求出實(shí)際獲得百分率。20優(yōu)選內(nèi)容五五 思考題思考題v用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗滌蛋白質(zhì)的順序是否可以變換？為什么？v試設(shè)計(jì)一個(gè)利用蛋白質(zhì)其他性質(zhì)提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)21優(yōu)選內(nèi)容六六 離心機(jī)的使用及注意事項(xiàng)離心機(jī)的使用及注意事項(xiàng)v離心機(jī)的工作原理離心機(jī)的工作原理：在離心力場(chǎng)的作用下，可加速懸浮液中固體顆粒沉降或漂浮的速度，從而將不同的物質(zhì)分離。它是生化實(shí)驗(yàn)中提取、分離、純化的常用設(shè)備，操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是平衡。v注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1.檢查內(nèi)、外套管應(yīng)完整不漏，洗凈離心管；2.待離心的物質(zhì)裝入離心管的量不應(yīng)超過(guò)離心內(nèi)套管體積的2/3；3.將一對(duì)離心管（含內(nèi)、外套管）放在臺(tái)秤上平衡；4.檢查離心機(jī)正常后，將平衡好的離心管對(duì)稱的放在離心機(jī)中；5.蓋好離心機(jī)蓋，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，設(shè)置轉(zhuǎn)速與時(shí)間，開(kāi)始離心。注意一定不能超過(guò)離心機(jī)的最大離心速度！離心結(jié)束后，待離心機(jī)停止運(yùn)轉(zhuǎn)后，再打開(kāi)機(jī)蓋，取出離心管，不許用手強(qiáng)行使離心機(jī)停止轉(zhuǎn)6用完后，將內(nèi)外套管洗凈，倒立放置，使其干燥，并在使用的登記薄簽名。7.使用過(guò)程中，如出現(xiàn)故障，一定請(qǐng)本室的實(shí)驗(yàn)員排除，不許擅自處理22優(yōu)選內(nèi)容（4）蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定）蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染考馬斯亮藍(lán)染色法色法一一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會(huì)用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度23優(yōu)選內(nèi)容考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性?？捡R斯亮藍(lán)G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)呈藍(lán)色，最大吸收峰改變?yōu)?95nm,考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測(cè)定的高敏感度（比Lowry法靈敏4倍）在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料考馬斯亮藍(lán)結(jié)合符合比爾定律，因此可以通過(guò)測(cè)定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。二二 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理24優(yōu)選內(nèi)容Coomassie Dye-Based 蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein-DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+25優(yōu)選內(nèi)容三三 實(shí)驗(yàn)試劑與器材實(shí)驗(yàn)試劑與器材v試劑0.9%NaCl溶液標(biāo)準(zhǔn)蛋白液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml）染液：考馬斯亮藍(lán)G250（0.01%）樣品液：酪蛋白溶液v器材漩渦混合器試管吸管容量瓶量筒電子分析天平比色皿722型分光光度計(jì)26優(yōu)選內(nèi)容四、四、操作方法操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取14支試管，分兩組按下表平行操作。試管編號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(mL)00.10.20.30.40.50.60.9%NaCl溶液（mL）1.00.90.80.70.60.50.4考馬斯亮藍(lán)試劑(mL)4444444蛋白質(zhì)濃度(g/mL)0102030405060A595nm搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)試管為空白對(duì)照，在595nm處比色OD595nm以O(shè)D595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。27優(yōu)選內(nèi)容2.酪蛋白濃度的測(cè)定稱取一定量的酪蛋白，用0.9%NaCl溶液溶解定容至一定體積（使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)）。測(cè)定方法同上，根據(jù)所測(cè)定的OD595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(g/mL)。28優(yōu)選內(nèi)容五五 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)（1）如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5-20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵龠@段時(shí)間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。（2）測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，但此復(fù)合物的吸附量可以忽略。測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。（3）一些陽(yáng)離子如K+、Na+、Mg2+、乙醇等物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)影響，而大量的去污劑如SDS等會(huì)嚴(yán)重干擾測(cè)定。29優(yōu)選內(nèi)容六722型分光光度計(jì)使用方法型分光光度計(jì)使用方法 1調(diào)整調(diào)整（1）將靈敏度旋鈕調(diào)至“1”檔（放大倍率最?。Ｕ{(diào)波長(zhǎng)調(diào)節(jié)器至所需波長(zhǎng)。（2）開(kāi)啟電源開(kāi)關(guān)，指示燈亮，選擇開(kāi)關(guān)置于“T”，調(diào)節(jié)透光率100%T旋鈕使數(shù)字顯示100.0左右，預(yù)熱20min.2校正校正（1）打開(kāi)吸收池暗室蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），調(diào)節(jié)0%T旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”，蓋上吸收池蓋，將參比溶液置于光路，使光電管受光，調(diào)節(jié)透光率100%T旋鈕，使數(shù)學(xué)顯示為“100.0”。（2）如果顯示不到“100”，則可適當(dāng)增加電流放大器靈敏度檔數(shù)，但應(yīng)盡可能使用低檔數(shù)，這樣儀器將有更高的穩(wěn)定性。當(dāng)改變靈敏度后必須重新校正“0”和“100”。（3）按（1）連續(xù)幾次調(diào)整“00.0”和“100.0”后，如將選擇開(kāi)關(guān)置于“A”，調(diào)節(jié)吸光度調(diào)零旋鈕，使數(shù)字顯示為“.000”，即可進(jìn)行下面吸光度A的測(cè)量；如將選擇開(kāi)關(guān)置于“C”，將標(biāo)準(zhǔn)溶液推入光路，調(diào)節(jié)濃度旋鈕，使得數(shù)字顯示值為已知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度數(shù)值，即可進(jìn)行下面濃度c的測(cè)量。30優(yōu)選內(nèi)容3測(cè)定測(cè)定（）吸光度的測(cè)量。將要測(cè)的試樣溶液推入光路，顯示值即為待測(cè)樣品的吸光度值。（）濃度c的測(cè)量。將要測(cè)c試樣溶液推入光路，即可讀出待測(cè)樣品的濃度值c。4結(jié)束結(jié)束 測(cè)量完畢，關(guān)閉電源，將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至初始位置。取出吸收池洗凈，晾干，存于專用盒內(nèi)。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：（1）儀器接地要良好，否則顯示數(shù)字不穩(wěn)定。（2）如果大幅度改變測(cè)試波長(zhǎng)時(shí)，在調(diào)整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量變化急劇，光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段光響應(yīng)平衡時(shí)間），當(dāng)穩(wěn)定后，重新調(diào)整“00.0”和“100”即可工作。（3）儀器左側(cè)下角有一只干燥劑筒，應(yīng)保持其干燥，發(fā)現(xiàn)干燥劑變色應(yīng)立即更新或烘干后再用。（4）當(dāng)儀器停止工作時(shí)，關(guān)掉電源，電源開(kāi)關(guān)需同時(shí)切斷，并罩好儀器31優(yōu)選內(nèi)容七七 思考題思考題與其它測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法相比，考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定有何優(yōu)點(diǎn)？32優(yōu)選內(nèi)容