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1、生 物 化 學(xué)BIOCHEMISTRY 王 澤 平生 物 化 學(xué) 與 分 子 生 物 學(xué) 教 研 室 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 與 功 能第 1章Structure and Function of Protein n 什 么 是 蛋 白 質(zhì) ?蛋 白 質(zhì) (protein)是 由 許 多 氨 基 酸(amino acids)通 過 肽 鍵 (peptide bond)相連 形 成 的 高 分 子 含 氮 化 合 物 。 n 蛋 白 質(zhì) 研 究 的 歷 史1833年 ， 從 麥 芽 中 分 離 淀 粉 酶 ； 隨 后 從 胃 液 中分 離 到 類 似 胃 蛋 白 酶 的 物 質(zhì) 。1864年 ，

2、血 紅 蛋 白 被 分 離 并 結(jié) 晶 。19世 紀(jì) 末 ， 證 明 蛋 白 質(zhì) 由 氨 基 酸 組 成 ， 并 合 成了 多 種 短 肽 。20世 紀(jì) 初 ， 發(fā) 現(xiàn) 蛋 白 質(zhì) 的 二 級 結(jié) 構(gòu) ； 完 成 胰 島素 一 級 結(jié) 構(gòu) 測 定 。 20世 紀(jì) 中 葉 ， 各 種 蛋 白 質(zhì) 分 析 技 術(shù) 相 繼 建 立 ，促 進(jìn) 了 蛋 白 質(zhì) 研 究 迅 速 發(fā) 展 ；1962年 ， 確 定 了 血 紅 蛋 白 的 四 級 結(jié) 構(gòu) 。20世 紀(jì) 90年 代 ， 功 能 基 因 組 與 蛋 白 質(zhì) 組 研 究 地展 開 。 n 蛋 白 質(zhì) 的 生 物 學(xué) 重 要 性分 布 廣 ： 所 有

3、 器 官 、 組 織 都 含 有 蛋 白 質(zhì) ； 細(xì) 胞的 各 個(gè) 部 分 都 含 有 蛋 白 質(zhì) 。含 量 高 ： 蛋 白 質(zhì) 是 細(xì) 胞 內(nèi) 最 豐 富 的 有 機(jī) 分 子 ，占 人 體 干 重 的 45 ， 某 些 組 織 含 量 更 高 ， 例 如脾 、 肺 及 橫 紋 肌 等 高 達(dá) 80 。1. 蛋 白 質(zhì) 是 生 物 體 重 要 組 成 成 分 作 為 生 物 催 化 劑 （ 酶 ）代 謝 調(diào) 節(jié) 作 用免 疫 保 護(hù) 作 用物 質(zhì) 的 轉(zhuǎn) 運(yùn) 和 存 儲運(yùn) 動 與 支 持 作 用參 與 細(xì) 胞 間 信 息 傳 遞2. 蛋 白 質(zhì) 具 有 重 要 的 生 物 學(xué) 功 能3. 氧

4、化 供 能 蛋白質(zhì)的分子組成The Molecular Component of Protein第一節(jié) n 組 成 蛋 白 質(zhì) 的 元 素主 要 有 C、 H、 O、 N和 S。 有 些 蛋 白 質(zhì) 含 有 少 量 磷 或 金 屬 元 素 鐵 、銅 、 鋅 、 錳 、 鈷 、 鉬 ， 個(gè) 別 蛋 白 質(zhì) 還 含 有碘 。 各 種 蛋 白 質(zhì) 的 含 氮 量 很 接 近 ， 平 均 為 16 。 由 于 體 內(nèi) 的 含 氮 物 質(zhì) 以 蛋 白 質(zhì) 為 主 ，因 此 ， 只 要 測 定 生 物 樣 品 中 的 含 氮 量 ， 就可 以 根 據(jù) 以 下 公 式 推 算 出 蛋 白 質(zhì) 的 大 致 含

5、量 ： 100克 樣 品 中 蛋 白 質(zhì) 的 含 量 (g %)= 每 克 樣 品 含 氮 克 數(shù) 6.25 1001/16%n 蛋 白 質(zhì) 元 素 組 成 的 特 點(diǎn) 一 、 組 成 人 體 蛋 白 質(zhì) 的 20種 氨 基 酸均 屬 于 L-氨 基 酸 存 在 自 然 界 中 的 氨 基 酸 有 300余 種 ，但 組 成 人 體 蛋 白 質(zhì) 的 氨 基 酸 僅 有 20種 ，且 均 屬 L-氨 基 酸 （ 甘 氨 酸 除 外 ） 。 H 甘 氨 酸CH3 丙 氨 酸L-氨 基 酸 的 通 式R C +NH3COO-H 非 極 性 脂 肪 族 氨 基 酸 極 性 中 性 氨 基 酸 芳 香

6、族 氨 基 酸 酸 性 氨 基 酸 堿 性 氨 基 酸二 、 氨 基 酸 可 根 據(jù) 側(cè) 鏈 結(jié) 構(gòu) 和 理 化 性 質(zhì)進(jìn) 行 分 類 (一 )側(cè) 鏈 含 烴 鏈 的 氨 基 酸 屬 于 非 極 性 脂 肪 族氨 基 酸 (二 )側(cè) 鏈 有 極 性 但 不 帶 電 荷 的 氨 基 酸 是 極 性中 性 氨 基 酸 (三 )側(cè) 鏈 含 芳 香 基 團(tuán) 的 氨 基 酸 是 芳 香 族 氨 基 酸 (四 )側(cè) 鏈 含 負(fù) 性 解 離 基 團(tuán) 的 氨 基 酸 是 酸 性 氨 基 酸 (五 )側(cè) 鏈 含 正 性 解 離 基 團(tuán) 的 氨 基 酸 屬 于 堿 性氨 基 酸 n 幾 種 特 殊 氨 基 酸 脯

7、 氨 酸（ 亞 氨 基 酸 ） CH2 CHCOO-NH2+CH2CH2 半 胱 氨 酸 + 胱 氨 酸 二 硫 鍵-HH-OOC-CH-CH2-S+NH3 S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3 HS-CH2-CH-COO-+NH3 三 、 20種 氨 基 酸 具 有 共 同 或 特 異 的 理 化 性 質(zhì)n 兩 性 解 離 及 等 電 點(diǎn)氨 基 酸 是 兩 性 電 解 質(zhì) ， 其 解 離 程 度 取 決 于 所處 溶 液 的 酸 堿 度 。 等 電 點(diǎn) (isoelectric point, pI) 在 某 一 pH 的 溶 液 中 ， 氨 基 酸 解 離

8、成 陽 離 子 和陰 離 子 的 趨 勢 及 程 度 相 等 ， 成 為 兼 性 離 子 ， 呈 電中 性 。 此 時(shí) 溶 液 的 pH 值 稱 為 該 氨 基 酸 的 等 電 點(diǎn) 。（ 一 ） 氨 基 酸 具 有 兩 性 解 離 的 性 質(zhì) pH =pI +OH- pH pI+H+OH-+H+pH pI 氨 基 酸 的 兼 性 離 子 陽 離 子 陰 離 子CHNH2 COOHR CHNH3+COO-R CHNH2COO-RCH COOHR NH3+ （ 二 ） 含 共 軛 雙 鍵 的 氨 基 酸 具 有 紫 外 吸 收 性 質(zhì)色 氨 酸 、 酪 氨 酸的 最 大 吸 收 峰 在 280 n

9、m 附 近 。大 多 數(shù) 蛋 白 質(zhì) 含有 這 兩 種 氨 基 酸 殘 基 ，所 以 測 定 蛋 白 質(zhì) 溶 液280nm的 光 吸 收 值 是 分析 溶 液 中 蛋 白 質(zhì) 含 量的 快 速 簡 便 的 方 法 。 芳 香 族 氨 基 酸 的 紫 外 吸 收 （ 三 ） 氨 基 酸 與 茚 三 酮 反 應(yīng) 生 成 藍(lán) 紫 色 化 合 物氨 基 酸 與 茚 三 酮 水 合 物 共 熱 ， 可 生 成 藍(lán)紫 色 化 合 物 ， 其 最 大 吸 收 峰 在 570nm處 。由 于 此 吸 收 峰 值 與 氨 基 酸 的 含 量 存 在 正比 關(guān) 系 ， 因 此 可 作 為 氨 基 酸 定 量 分

10、析 方 法 。 四 、 蛋 白 質(zhì) 是 由 許 多 氨 基 酸 殘 基 組 成的 多 肽 鏈肽 鍵 (peptide bond)是 由 一 個(gè) 氨 基 酸 的 -羧 基 與 另 一 個(gè) 氨 基 酸 的 -氨 基 脫 水 縮 合 而 形 成的 化 學(xué) 鍵 。（ 一 ） 氨 基 酸 通 過 肽 鍵 連 接 而 形 成 肽 (peptide) NH2-CH-CH O OH甘 氨 酸甘 氨 酸 NH-CH-CH OHOH 甘 氨 酸 +-HOH 甘 氨 酰 甘 氨 酸肽 鍵NH2-CH-C-N-CH-COOHHHH O 肽 是 由 氨 基 酸 通 過 肽 鍵 縮 合 而 形 成 的 化合 物 。兩 分

11、 子 氨 基 酸 縮 合 形 成 二 肽 ， 三 分 子 氨 基酸 縮 合 則 形 成 三 肽 肽 鏈 中 的 氨 基 酸 分 子 因 為 脫 水 縮 合 而 基 團(tuán)不 全 ， 被 稱 為 氨 基 酸 殘 基 (residue)。由 十 個(gè) 以 內(nèi) 氨 基 酸 相 連 而 成 的 肽 稱 為 寡 肽(oligopeptide)， 由 更 多 的 氨 基 酸 相 連 形 成 的 肽稱 多 肽 (polypeptide)。 N 末 端 ： 多 肽 鏈 中 有 游 離 -氨 基 的 一 端C 末 端 ： 多 肽 鏈 中 有 游 離 -羧 基 的 一 端n 多 肽 鏈 有 兩 端 ：多 肽 鏈 (po

12、lypeptide chain)是 指 許 多 氨基 酸 之 間 以 肽 鍵 連 接 而 成 的 一 種 結(jié) 構(gòu) 。 N末 端 C末 端 牛 核 糖 核 酸 酶 （ 二 ） 體 內(nèi) 存 在 多 種 重 要 的 生 物 活 性 肽 1. 谷 胱 甘 肽 (glutathione, GSH) G SH 過 氧化 物 酶H 2O2 2G SH 2H 2O G SSG G SH 還 原 酶NADPH +H + NADP+ n G SH 與 G SSG 間 的 轉(zhuǎn) 換 體 內(nèi) 許 多 激 素 屬 寡 肽 或 多 肽 神 經(jīng) 肽 (neuropeptide)2.多 肽 類 激 素 及 神 經(jīng) 肽 蛋白質(zhì)的

13、分子結(jié)構(gòu)The Molecular Structure of Protein 第二節(jié) n 蛋 白 質(zhì) 的 分 子 結(jié) 構(gòu) 包 括 : 高 級結(jié) 構(gòu)一 級 結(jié) 構(gòu) (primary structure)二 級 結(jié) 構(gòu) (secondary structure)三 級 結(jié) 構(gòu) (tertiary structure)四 級 結(jié) 構(gòu) (quaternary structure) n定 義 :蛋 白 質(zhì) 的 一 級 結(jié) 構(gòu) 指 在 蛋 白 質(zhì) 分 子 從 N-端 至C-端 的 氨 基 酸 排 列 順 序 。一 、 氨 基 酸 的 排 列 順 序 決 定 蛋 白 質(zhì)的 一 級 結(jié) 構(gòu)n主 要 的 化 學(xué)

14、 鍵 :肽 鍵 ， 有 些 蛋 白 質(zhì) 還 包 括 二 硫 鍵 。 一 級 結(jié) 構(gòu) 是 蛋 白 質(zhì) 空 間 構(gòu) 象 和 特 異 生 物 學(xué) 功 能的 基 礎(chǔ) ， 但 不 是 決 定 蛋 白 質(zhì) 空 間 構(gòu) 象 的 唯 一 因 素 。 二 、 多 肽 鏈 的 局 部 主 鏈 構(gòu) 象 為 蛋 白 質(zhì)二 級 結(jié) 構(gòu)蛋 白 質(zhì) 分 子 中 某 一 段 肽 鏈 的 局 部 空 間結(jié) 構(gòu) ， 即 該 段 肽 鏈 主 鏈 骨 架 原 子 的 相 對 空間 位 置 ， 并 不 涉 及 氨 基 酸 殘 基 側(cè) 鏈 的 構(gòu) 象 。n定 義 : n主 要 的 化 學(xué) 鍵 ： 氫 鍵 （ 一 ） 參 與 肽 鍵 形

15、成 的 6個(gè) 原 子 在 同 一 平 面 上參 與 肽 鍵 的 6個(gè) 原 子 C1、 C、 O、 N、 H 、 C2位 于 同 一 平面 ， C1和 C2在 平 面 上 所 處 的 位 置 為 反 式 (trans)構(gòu) 型 ， 此 同一 平 面 上 的 6個(gè) 原 子 構(gòu) 成 了 所 謂 的 肽 單 元 (peptide unit) 。 （ 一 ） 參 與 肽 鍵 形 成 的 6個(gè) 原 子 在 同 一 平 面 上參 與 肽 鍵 的 6個(gè) 原 子 C1、 C、 O、 N、 H 、 C2位 于 同 一 平面 ， C1和 C2在 平 面 上 所 處 的 位 置 為 反 式 (trans)構(gòu) 型 ， 此

16、 同一 平 面 上 的 6個(gè) 原 子 構(gòu) 成 了 所 謂 的 肽 單 元 (peptide unit) 。 -螺 旋 ( -helix) -折 疊 (-pleated sheet) -轉(zhuǎn) 角 (-turn) 無 規(guī) 卷 曲 (random coil) （ 二 ） -螺 旋 結(jié) 構(gòu) 是 常 見 的 蛋 白 質(zhì) 二 級 結(jié) 構(gòu)n 蛋 白 質(zhì) 二 級 結(jié) 構(gòu) n -螺 旋 （ 三 ） -折 疊 使 多 肽 鏈 形 成 片 層 結(jié) 構(gòu) （ 四 ） -轉(zhuǎn) 角 和 無 規(guī) 卷 曲 在 蛋 白 質(zhì) 分 子 中普 遍 存 在-轉(zhuǎn) 角無 規(guī) 卷 曲 是 用 來 闡 述 沒 有 確 定 規(guī) 律 性 的 那 部分

17、肽 鏈 結(jié) 構(gòu) 。 （ 五 ） 模 體 是 具 有 特 殊 功 能 的 超 二 級 結(jié) 構(gòu)在 許 多 蛋 白 質(zhì) 分 子 中 ， 可 發(fā) 現(xiàn) 二 個(gè) 或 三 個(gè) 具有 二 級 結(jié) 構(gòu) 的 肽 段 ， 在 空 間 上 相 互 接 近 ， 形 成 一個(gè) 有 規(guī) 則 的 二 級 結(jié) 構(gòu) 組 合 ， 被 稱 為 超 二 級 結(jié) 構(gòu) 。二 級 結(jié) 構(gòu) 組 合 形 式 有 3種 ： ， ， 。 二 個(gè) 或 三 個(gè) 具 有 二 級 結(jié) 構(gòu) 的 肽 段 ， 在 空 間上 相 互 接 近 ， 形 成 一 個(gè) 特 殊 的 空 間 構(gòu) 象 ， 稱 為模 體 (motif) 。模 體 是 具 有 特 殊 功 能 的

18、超 二 級 結(jié) 構(gòu) 。 鈣 結(jié) 合 蛋 白 中 結(jié) 合鈣 離 子 的 模 體 鋅 指 結(jié) 構(gòu) -螺 旋 -轉(zhuǎn) 角 （ 或環(huán) ） -螺 旋 模 體 鏈 -轉(zhuǎn) 角 -鏈 模 體 鏈 -轉(zhuǎn) 角 -螺 旋 -轉(zhuǎn) 角 -鏈 模 體n模 體 常 見 的 形 式 （ 六 ） 氨 基 酸 殘 基 的 側(cè) 鏈 對 二 級 結(jié) 構(gòu) 形 成 的 影 響蛋 白 質(zhì) 二 級 結(jié) 構(gòu) 是 以 一 級 結(jié) 構(gòu) 為 基 礎(chǔ) 的 。一 段 肽 鏈 其 氨 基 酸 殘 基 的 側(cè) 鏈 適 合 形 成 -螺 旋或 -折 疊 ， 它 就 會 出 現(xiàn) 相 應(yīng) 的 二 級 結(jié) 構(gòu) 。 三 、 在 二 級 結(jié) 構(gòu) 基 礎(chǔ) 上 多 肽 鏈

19、進(jìn) 一 步 折 疊形 成 蛋 白 質(zhì) 三 級 結(jié) 構(gòu)疏 水 鍵 、 離 子 鍵 、 氫 鍵 和 Van der Waals力 等 。n主 要 的 化 學(xué) 鍵 :整 條 肽 鏈 中 全 部 氨 基 酸 殘 基 的 相 對 空 間 位 置 。即 肽 鏈 中 所 有 原 子 在 三 維 空 間 的 排 布 位 置 。n定 義 :（ 一 ） 三 級 結(jié) 構(gòu) 是 指 整 條 肽 鏈 中 全 部 氨 基 酸殘 基 的 相 對 空 間 位 置 肌 紅 蛋 白 (Mb) N 端 C端 纖 連 蛋 白 分 子 的 結(jié) 構(gòu) 域（ 二 ） 結(jié) 構(gòu) 域 是 三 級 結(jié) 構(gòu) 層 次 上 的 局 部 折 疊 區(qū)分 子 量

20、 較 大 的 蛋 白 質(zhì) 常 可 折 疊 成 多 個(gè) 結(jié) 構(gòu) 較 為 緊密 的 區(qū) 域 ， 并 各 行 其 功 能 ， 稱 為 結(jié) 構(gòu) 域 (domain) 。 （ 三 ） 分 子 伴 侶 參 與 蛋 白 質(zhì) 折 疊分 子 伴 侶 (chaperon)通 過 提 供 一 個(gè) 保 護(hù) 環(huán) 境 從 而加 速 蛋 白 質(zhì) 折 疊 成 天 然 構(gòu) 象 或 形 成 四 級 結(jié) 構(gòu) 。分 子 伴 侶 可 逆 地 與 未 折 疊 肽 段 的 疏 水 部 分 結(jié) 合 隨后 松 開 ， 如 此 重 復(fù) 進(jìn) 行 可 防 止 錯(cuò) 誤 的 聚 集 發(fā) 生 ，使 肽 鏈 正 確 折 疊 。 分 子 伴 侶 也 可 與

21、錯(cuò) 誤 聚 集 的 肽 段 結(jié) 合 ， 使 之 解 聚后 ， 再 誘 導(dǎo) 其 正 確 折 疊 。 分 子 伴 侶 在 蛋 白 質(zhì) 分 子 折 疊 過 程 中 二 硫 鍵 的 正 確形 成 起 了 重 要 的 作 用 。 伴 侶 蛋 白 在 蛋 白 質(zhì) 折 疊 中 的 作 用 亞 基 之 間 的 結(jié) 合 主 要 是 氫 鍵 和 離 子 鍵 。四 、 含 有 二 條 以 上 多 肽 鏈 的 蛋 白 質(zhì)具 有 四 級 結(jié) 構(gòu)蛋 白 質(zhì) 分 子 中 各 亞 基 的 空 間 排 布 及 亞 基 接觸 部 位 的 布 局 和 相 互 作 用 ， 稱 為 蛋 白 質(zhì) 的 四 級結(jié) 構(gòu) 。有 些 蛋 白 質(zhì)

22、分 子 含 有 二 條 或 多 條 多 肽 鏈 ，每 一 條 多 肽 鏈 都 有 完 整 的 三 級 結(jié) 構(gòu) ， 稱 為 蛋 白質(zhì) 的 亞 基 (subunit)。 由 2個(gè) 亞 基 組 成 的 蛋 白 質(zhì) 四 級 結(jié) 構(gòu) 中 ， 若 亞 基 分 子結(jié) 構(gòu) 相 同 ， 稱 之 為 同 二 聚 體 (homodimer)， 若 亞 基 分 子結(jié) 構(gòu) 不 同 ， 則 稱 之 為 異 二 聚 體 (heterodimer)。 血 紅 蛋 白 的四 級 結(jié) 構(gòu) 五 、 蛋 白 質(zhì) 的 分 類n根 據(jù) 蛋 白 質(zhì) 組 成 成 分 :單 純 蛋 白 質(zhì)結(jié) 合 蛋 白 質(zhì) = 蛋 白 質(zhì) 部 分 + 非 蛋

23、 白 質(zhì) 部 分n根 據(jù) 蛋 白 質(zhì) 形 狀 :纖 維 狀 蛋 白 質(zhì)球 狀 蛋 白 質(zhì) 六 、 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué)（ 一 ） 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 基 本 概 念蛋 白 質(zhì) 組 是 指 一 種 細(xì) 胞 或 一 種 生 物 所 表達(dá) 的 全 部 蛋 白 質(zhì) ， 即 “ 一 種 基 因 組 所 表 達(dá) 的全 套 蛋 白 質(zhì) ” 。 （ 二 ） 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 研 究 技 術(shù) 平 臺 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 是 高 通 量 ， 高 效 率 的 研 究 :雙 向 電 泳 分 離 樣 品 蛋 白 質(zhì) 蛋 白 質(zhì) 點(diǎn) 的 定 位 、 切 取 蛋 白 質(zhì) 點(diǎn) 的 質(zhì) 譜 分 析 （ 三 ） 蛋 白 質(zhì) 組

24、學(xué) 研 究 的 科 學(xué) 意 義 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系The Relation of Structure and Function of Protein第三節(jié) （ 一 ） 一 級 結(jié) 構(gòu) 是 空 間 構(gòu) 象 的 基 礎(chǔ)一 、 蛋 白 質(zhì) 一 級 結(jié) 構(gòu) 是 高 級 結(jié) 構(gòu)與 功 能 的 基 礎(chǔ)牛 核 糖 核 酸 酶 的一 級 結(jié) 構(gòu) 二硫鍵 天 然 狀 態(tài) ，有 催 化 活 性 尿 素 、 -巰 基 乙 醇 去 除 尿 素 、-巰 基 乙 醇 非 折 疊 狀 態(tài) ， 無 活 性 （ 二 ） 一 級 結(jié) 構(gòu) 相 似 的 蛋 白 質(zhì) 具 有 相 似 的 高 級結(jié) 構(gòu) 與 功 能胰 島 素 氨 基

25、酸 殘 基 序 號A5 A6 A10 B30人 Thr Ser Ile Thr豬 Thr Ser Ile Ala狗 Thr Ser Ile Ala兔 Thr Gly Ile Ser牛 Ala Gly Val Ala羊 Ala Ser Val Ala馬 Thr Ser Ile Ala （ 三 ） 氨 基 酸 序 列 提 供 重 要 的 生 物 化 學(xué) 信 息一 些 廣 泛 存 在 于 生物 界 的 蛋 白 質(zhì) 如 細(xì) 胞 色素 (cytochrome C)， 比較 它 們 的 一 級 結(jié) 構(gòu) ， 可以 幫 助 了 解 物 種 進(jìn) 化 間的 關(guān) 系 。 （ 四 ） 重 要 蛋 白 質(zhì) 的 氨 基

26、酸 序 列 改 變 可 引 起 疾 病n例 ： 鐮 刀 形 紅 細(xì) 胞 貧 血N-val his leu thr pro glu glu C(146)H bS 肽 鏈H bA 肽 鏈N-val his leu thr pro val glu C(146) 這 種 由 蛋 白 質(zhì) 分 子 發(fā) 生 變 異 所 導(dǎo) 致 的 疾 病 ，稱 為 “ 分 子 病 ” 。 n肌 紅 蛋 白 /血 紅 蛋 白含 有 血 紅 素 輔 基血 紅 素 結(jié) 構(gòu) 二 、 蛋 白 質(zhì) 的 功 能 依 賴 特 定 空 間 結(jié) 構(gòu)（ 一 ） 血 紅 蛋 白 亞 基 與 肌 紅 蛋 白 結(jié) 構(gòu) 相 似 n肌 紅 蛋 白 (my

27、oglobin， Mb) 肌 紅 蛋 白 是 一 個(gè) 只 有 三 級結(jié) 構(gòu) 的 單 鏈 蛋 白 質(zhì) ， 有 8段 -螺旋 結(jié) 構(gòu) 。血 紅 素 分 子 中 的 兩 個(gè) 丙 酸側(cè) 鏈 以 離 子 鍵 形 式 與 肽 鏈 中 的兩 個(gè) 堿 性 氨 基 酸 側(cè) 鏈 上 的 正 電荷 相 連 ， 加 之 肽 鏈 中 的 F8組 氨酸 殘 基 還 與 Fe 2+形 成 配 位 結(jié) 合 ，所 以 血 紅 素 輔 基 與 蛋 白 質(zhì) 部 分穩(wěn) 定 結(jié) 合 。 n血 紅 蛋 白 (hemoglobin， H b)血 紅 蛋 白 具 有 4個(gè) 亞基 組 成 的 四 級 結(jié) 構(gòu) ， 每個(gè) 亞 基 可 結(jié) 合 1個(gè)

28、 血 紅 素并 攜 帶 1分 子 氧 。H b亞 基 之 間 通 過 8對 鹽 鍵 ， 使 4個(gè) 亞 基 緊 密結(jié) 合 而 形 成 親 水 的 球 狀蛋 白 。 Hb與 Mb一 樣 能 可 逆 地 與 O2結(jié) 合 ， Hb與 O2結(jié) 合 后 稱 為 氧 合 Hb。 氧 合 Hb占 總 Hb的 百 分 數(shù) （ 稱 百 分 飽 和 度 ） 隨 O2濃 度 變 化而 改 變 。（ 二 ） 血 紅 蛋 白 亞 基 構(gòu) 象 變 化 可 影 響 亞 基與 氧 結(jié) 合 肌 紅 蛋 白 (Mb)和 血 紅 蛋 白 (H b)的 氧 解 離 曲 線 n 協(xié) 同 效 應(yīng) (cooperativity)一 個(gè) 寡

29、聚 體 蛋 白 質(zhì) 的 一 個(gè) 亞 基 與 其 配體 結(jié) 合 后 ， 能 影 響 此 寡 聚 體 中 另 一 個(gè) 亞 基與 配 體 結(jié) 合 能 力 的 現(xiàn) 象 ， 稱 為 協(xié) 同 效 應(yīng) 。 如 果 是 促 進(jìn) 作 用 則 稱 為 正 協(xié) 同 效 應(yīng) (positive cooperativity)如 果 是 抑 制 作 用 則 稱 為 負(fù) 協(xié) 同 效 應(yīng)(negative cooperativity) O2血 紅 素 與 氧 結(jié)合 后 ， 鐵 原 子 半 徑變 小 ， 就 能 進(jìn) 入 卟啉 環(huán) 的 小 孔 中 ， 繼而 引 起 肽 鏈 位 置 的變 動 。 n 變 構(gòu) 效 應(yīng) (allost

30、eric effect)蛋 白 質(zhì) 空 間 結(jié) 構(gòu) 的 改 變 伴 隨 其 功 能的 變 化 ， 稱 為 變 構(gòu) 效 應(yīng) 。 （ 三 ） 蛋 白 質(zhì) 構(gòu) 象 改 變 可 引 起 疾 病蛋 白 質(zhì) 構(gòu) 象 疾 病 ： 若 蛋 白 質(zhì) 的 折 疊 發(fā) 生錯(cuò) 誤 ， 盡 管 其 一 級 結(jié) 構(gòu) 不 變 ， 但 蛋 白 質(zhì) 的 構(gòu)象 發(fā) 生 改 變 ， 仍 可 影 響 其 功 能 ， 嚴(yán) 重 時(shí) 可 導(dǎo)致 疾 病 發(fā) 生 。 蛋 白 質(zhì) 構(gòu) 象 改 變 導(dǎo) 致 疾 病 的 機(jī) 理 ： 有 些 蛋白 質(zhì) 錯(cuò) 誤 折 疊 后 相 互 聚 集 ， 常 形 成 抗 蛋 白 水 解酶 的 淀 粉 樣 纖 維 沉

31、 淀 ， 產(chǎn) 生 毒 性 而 致 病 ， 表 現(xiàn)為 蛋 白 質(zhì) 淀 粉 樣 纖 維 沉 淀 的 病 理 改 變 。這 類 疾 病 包 括 ： 人 紋 狀 體 脊 髓 變 性 病 、 老年 癡 呆 癥 、 亨 停 頓 舞 蹈 病 、 瘋 牛 病 等 。 瘋 牛 病 是 由 朊 病 毒 蛋 白 (prion protein, PrP)引 起 的 一 組 人 和 動 物 神 經(jīng) 退 行 性 病 變 。正 常 的 PrP富 含 -螺 旋 ， 稱 為 PrPc。PrPc在 某 種 未 知 蛋 白 質(zhì) 的 作 用 下 可 轉(zhuǎn) 變 成 全為 -折 疊 的 PrPsc， 從 而 致 病 。PrPc-螺 旋 P

32、rPsc-折 疊正 常 瘋 牛 病n 瘋 牛 病 中 的 蛋 白 質(zhì) 構(gòu) 象 改 變 第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)The Physical and Chemical Characters of Protein 一 、 蛋 白 質(zhì) 具 有 兩 性 電 離 的 性 質(zhì)蛋 白 質(zhì) 分 子 除 兩 端 的 氨 基 和 羧 基 可 解 離 外 ，氨 基 酸 殘 基 側(cè) 鏈 中 某 些 基 團(tuán) ， 在 一 定 的 溶 液 pH 條件 下 都 可 解 離 成 帶 負(fù) 電 荷 或 正 電 荷 的 基 團(tuán) 。 當(dāng) 蛋 白 質(zhì) 溶 液 處 于 某 一 pH 時(shí) ， 蛋 白 質(zhì) 解 離 成正 、 負(fù) 離 子 的 趨 勢

33、相 等 ， 即 成 為 兼 性 離 子 ， 凈 電荷 為 零 ， 此 時(shí) 溶 液 的 pH 稱 為 蛋 白 質(zhì) 的 等 電 點(diǎn) 。n 蛋 白 質(zhì) 的 等 電 點(diǎn) ( isoelectric point, pI) 二 、 蛋 白 質(zhì) 具 有 膠 體 性 質(zhì)蛋 白 質(zhì) 屬 于 生 物 大 分 子 之 一 ， 分 子 量 可 自 1萬 至 100萬 之 巨 ， 其 分 子 的 直 徑 可 達(dá) 1 100nm，為 膠 粒 范 圍 之 內(nèi) 。顆 粒 表 面 電 荷水 化 膜n 蛋 白 質(zhì) 膠 體 穩(wěn) 定 的 因 素 : + + +帶 正 電 荷 的 蛋 白 質(zhì) 帶 負(fù) 電 荷 的 蛋 白 質(zhì)在 等 電

34、點(diǎn) 的 蛋 白 質(zhì)水化膜+ + + +帶 正 電 荷 的 蛋 白 質(zhì) 帶 負(fù) 電 荷 的 蛋 白 質(zhì)不 穩(wěn) 定 的 蛋 白 質(zhì) 顆 粒 酸堿酸 堿酸堿 脫 水 作 用脫 水 作 用脫 水 作 用 溶 液 中 蛋 白 質(zhì) 的 聚 沉 三 、 蛋 白 質(zhì) 空 間 結(jié) 構(gòu) 破 壞 而 引 起 變 性在 某 些 物 理 和 化 學(xué) 因 素 作 用 下 ， 其 特 定 的空 間 構(gòu) 象 被 破 壞 ， 也 即 有 序 的 空 間 結(jié) 構(gòu) 變 成 無序 的 空 間 結(jié) 構(gòu) ， 從 而 導(dǎo) 致 其 理 化 性 質(zhì) 改 變 和 生物 活 性 的 喪 失 。n 蛋 白 質(zhì) 的 變 性 (denaturation

35、) n 造 成 變 性 的 因 素 :如 加 熱 、 乙 醇 等 有 機(jī) 溶 劑 、 強(qiáng) 酸 、 強(qiáng) 堿 、重 金 屬 離 子 及 生 物 堿 試 劑 等 。 n 變 性 的 本 質(zhì) :破 壞 非 共 價(jià) 鍵 和 二 硫 鍵 ， 不 改 變 蛋 白質(zhì) 的 一 級 結(jié) 構(gòu) 。 n 應(yīng) 用 舉 例 :臨 床 醫(yī) 學(xué) 上 ， 變 性 因 素 常 被 應(yīng) 用 來 消 毒 及滅 菌 。此 外 , 防 止 蛋 白 質(zhì) 變 性 也 是 有 效 保 存 蛋 白 質(zhì)制 劑 （ 如 疫 苗 等 ） 的 必 要 條 件 。 若 蛋 白 質(zhì) 變 性 程 度 較 輕 ， 去 除 變 性 因 素后 ， 蛋 白 質(zhì) 仍 可

36、 恢 復(fù) 或 部 分 恢 復(fù) 其 原 有 的 構(gòu)象 和 功 能 ， 稱 為 復(fù) 性 (renaturation) 。 天 然 狀 態(tài) ，有 催 化 活 性 尿 素 、 -巰 基 乙 醇 去 除 尿 素 、-巰 基 乙 醇 非 折 疊 狀 態(tài) ， 無 活 性 在 一 定 條 件 下 ， 蛋 白 疏 水 側(cè) 鏈 暴 露 在 外 ， 肽鏈 融 會 相 互 纏 繞 繼 而 聚 集 ， 因 而 從 溶 液 中 析 出 。變 性 的 蛋 白 質(zhì) 易 于 沉 淀 ， 有 時(shí) 蛋 白 質(zhì) 發(fā) 生 沉淀 ， 但 并 不 變 性 。 蛋 白 質(zhì) 變 性 后 的 絮 狀 物 加 熱 可 變 成 比 較 堅(jiān) 固的 凝

37、 塊 ， 此 凝 塊 不 易 再 溶 于 強(qiáng) 酸 和 強(qiáng) 堿 中 。 n蛋 白 質(zhì) 沉 淀n蛋 白 質(zhì) 的 凝 固 作 用 (protein coagulation) 四 、 蛋 白 質(zhì) 在 紫 外 光 譜 區(qū) 有 特 征 性 吸 收 峰由 于 蛋 白 質(zhì) 分 子 中 含 有 共 軛 雙 鍵 的 酪 氨 酸和 色 氨 酸 ， 因 此 在 280nm波 長 處 有 特 征 性 吸 收峰 。 蛋 白 質(zhì) 的 OD280與 其 濃 度 呈 正 比 關(guān) 系 ， 因此 可 作 蛋 白 質(zhì) 定 量 測 定 。 蛋 白 質(zhì) 經(jīng) 水 解 后 產(chǎn) 生 的 氨 基 酸 也 可 發(fā) 生 茚三 酮 反 應(yīng) 。 蛋 白

38、 質(zhì) 和 多 肽 分 子 中 肽 鍵 在 稀 堿 溶 液 中 與硫 酸 銅 共 熱 ， 呈 現(xiàn) 紫 色 或 紅 色 ， 此 反 應(yīng) 稱 為 雙縮 脲 反 應(yīng) ， 雙 縮 脲 反 應(yīng) 可 用 來 檢 測 蛋 白 質(zhì) 水 解程 度 。五 、 應(yīng) 用 蛋 白 質(zhì) 呈 色 反 應(yīng) 可 測 定 蛋 白 質(zhì)溶 液 含 量1. 茚 三 酮 反 應(yīng) (ninhydrin reaction)2. 雙 縮 脲 反 應(yīng) (biuret reaction) 第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein

39、 一 、 透 析 及 超 濾 法 可 去 除 蛋 白 質(zhì) 溶 液 中 的小 分 子 化 合 物應(yīng) 用 正 壓 或 離 心 力 使 蛋 白 質(zhì) 溶 液 透 過 有 一定 截 留 分 子 量 的 超 濾 膜 ， 達(dá) 到 濃 縮 蛋 白 質(zhì) 溶 液的 目 的 。n 透 析 (dialysis)n 超 濾 法利 用 透 析 袋 把 大 分 子 蛋 白 質(zhì) 與 小 分 子 化 合物 分 開 的 方 法 。 二 、 丙 酮 沉 淀 、 鹽 析 及 免 疫 沉 淀 是 常 用的 蛋 白 質(zhì) 沉 淀 方 法使 用 丙 酮 沉 淀 時(shí) ， 必 須 在 0 4 低 溫 下 進(jìn) 行 ，丙 酮 用 量 一 般 10倍

40、 于 蛋 白 質(zhì) 溶 液 體 積 。 蛋 白 質(zhì)被 丙 酮 沉 淀 后 ， 應(yīng) 立 即 分 離 。 除 了 丙 酮 以 外 ，也 可 用 乙 醇 沉 淀 。 鹽 析 (salt precipitation)是 將 硫 酸 銨 、 硫 酸 鈉 或氯 化 鈉 等 加 入 蛋 白 質(zhì) 溶 液 ， 使 蛋 白 質(zhì) 表 面 電 荷被 中 和 以 及 水 化 膜 被 破 壞 ， 導(dǎo) 致 蛋 白 質(zhì) 沉 淀 。 免 疫 沉 淀 法 ： 將 某 一 純 化 蛋 白 質(zhì) 免 疫 動 物 可 獲 得抗 該 蛋 白 的 特 異 抗 體 。 利 用 特 異 抗 體 識 別 相 應(yīng) 的抗 原 蛋 白 ， 并 形 成 抗

41、 原 抗 體 復(fù) 合 物 的 性 質(zhì) ， 可 從蛋 白 質(zhì) 混 合 溶 液 中 分 離 獲 得 抗 原 蛋 白 。 三 、 利 用 荷 電 性 質(zhì) 可 用 電 泳 法 將蛋 白 質(zhì) 分 離蛋 白 質(zhì) 在 高 于 或 低 于 其 pI的 溶 液 中 為 帶 電 的顆 粒 ， 在 電 場 中 能 向 正 極 或 負(fù) 極 移 動 。 這 種 通 過蛋 白 質(zhì) 在 電 場 中 泳 動 而 達(dá) 到 分 離 各 種 蛋 白 質(zhì) 的 技術(shù) , 稱 為 電 泳 (elctrophoresis) 。根 據(jù) 支 撐 物 的 不 同 ， 可 分 為 薄 膜 電 泳 、 凝 膠電 泳 等 。 SDS-聚 丙 烯 酰

42、胺 凝 膠 電 泳 ， 常 用 于 蛋 白 質(zhì) 分 子量 的 測 定 。等 電 聚 焦 電 泳 ， 通 過 蛋 白 質(zhì) 等 電 點(diǎn) 的 差 異 而 分離 蛋 白 質(zhì) 的 電 泳 方 法 。雙 向 凝 膠 電 泳 是 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 研 究 的 重 要 技 術(shù) 。n 幾 種 重 要 的 蛋 白 質(zhì) 電 泳 : 四 、 應(yīng) 用 相 分 配 或 親 和 原 理 可 將 蛋 白 質(zhì)進(jìn) 行 層 析 分 離待 分 離 蛋 白 質(zhì) 溶 液 （ 流 動 相 ） 經(jīng) 過 一 個(gè) 固態(tài) 物 質(zhì) （ 固 定 相 ） 時(shí) ， 根 據(jù) 溶 液 中 待 分 離 的 蛋白 質(zhì) 顆 粒 大 小 、 電 荷 多 少 及 親

43、 和 力 等 ， 使 待 分離 的 蛋 白 質(zhì) 組 分 在 兩 相 中 反 復(fù) 分 配 ， 并 以 不 同速 度 流 經(jīng) 固 定 相 而 達(dá) 到 分 離 蛋 白 質(zhì) 的 目 的 。n 層 析 (chromatography)分 離 蛋 白 質(zhì) 的 原 理 離 子 交 換 層 析 ： 利 用 各 蛋 白 質(zhì) 的 電 荷 量 及性 質(zhì) 不 同 進(jìn) 行 分 離 。凝 膠 過 濾 (gel filtration)又 稱 分 子 篩 層 析 ， 利用 各 蛋 白 質(zhì) 分 子 大 小 不 同 分 離 。n 蛋 白 質(zhì) 分 離 常 用 的 層 析 方 法 五 、 利 用 蛋 白 質(zhì) 顆 粒 沉 降 行 為

44、不 同可 進(jìn) 行 超 速 離 心 分 離超 速 離 心 法 (ultracentrifugation)既 可 以用 來 分 離 純 化 蛋 白 質(zhì) 也 可 以 用 作 測 定 蛋白 質(zhì) 的 分 子 量 。 蛋 白 質(zhì) 在 離 心 場 中 的 行 為 用 沉 降 系 數(shù)(sedimentation coefficient, S)表 示 ， 沉降 系 數(shù) 與 蛋 白 質(zhì) 的 密 度 和 形 狀 相 關(guān) 。 因 為 沉 降 系 數(shù) S大 體 上 和 分 子 量 成 正 比關(guān) 系 ， 故 可 應(yīng) 用 超 速 離 心 法 測 定 蛋 白 質(zhì) 分 子量 ， 但 對 分 子 形 狀 的 高 度 不 對 稱

45、的 大 多 數(shù) 纖維 狀 蛋 白 質(zhì) 不 適 用 。 六 、 應(yīng) 用 化 學(xué) 或 反 向 遺 傳 學(xué) 方 法 可 分 析多 肽 鏈 的 氨 基 酸 序 列分 析 已 純 化 蛋 白 質(zhì) 的 氨 基 酸 殘 基 組 成測 定 多 肽 鏈 的 氨 基 末 端 與 羧 基 末 端 為 何 種 氨 基 酸 殘 基把 肽 鏈 水 解 成 片 段 ， 分 別 進(jìn) 行 分 析測 定 各 肽 段 的 氨 基 酸 排 列 順 序 ， 一 般 采 用 Edman降 解 法一 般 需 用 數(shù) 種 水 解 法 ， 并 分 析 出 各 肽 段 中 的 氨 基 酸順 序 ， 然 后 經(jīng) 過 組 合 排 列 對 比 ， 最

46、 終 得 出 完 整 肽 鏈 中 氨 基 酸 順 序 的 結(jié) 果 。 n 通 過 核 酸 來 推 演 蛋 白 質(zhì) 中 的 氨 基 酸 序 列按 照 三 聯(lián) 密 碼 的 原 則 推 演 出 氨 基 酸 的 序 列分 離 編 碼 蛋 白 質(zhì) 的 基 因測 定 DNA序 列排 列 出 mRNA序 列 七 、 應(yīng) 用 物 理 學(xué) 、 生 物 信 息 學(xué) 原 理可 進(jìn) 行 蛋 白 質(zhì) 空 間 結(jié) 構(gòu) 測 定n二 級 結(jié) 構(gòu) 測 定通 常 采 用 圓 二 色 光 譜 (circular dichroism，CD)測 定 溶 液 狀 態(tài) 下 的 蛋 白 質(zhì) 二 級 結(jié) 構(gòu) 含 量 。 -螺 旋 的 CD峰

47、有 222nm處 的 負(fù) 峰 、 208nm處 的負(fù) 峰 和 198 nm處 的 正 峰 三 個(gè) 成 分 ； 而 -折 疊 的CD譜 不 很 固 定 。 n三 級 結(jié) 構(gòu) 測 定X射 線 衍 射 法 (X-ray diffraction)和 核 磁 共振 技 術(shù) (nuclear magnetic resonance, NMR)是研 究 蛋 白 質(zhì) 三 維 空 間 結(jié) 構(gòu) 最 準(zhǔn) 確 的 方 法 。 同 源 模 建 ： 將 待 研 究 的 序 列 與 已 知 結(jié) 構(gòu) 的 同 源 蛋 白質(zhì) 序 列 對 齊 補(bǔ) 償 氨 基 酸 替 補(bǔ) 、 插 入 和 缺 失 通 過 模 建 和 能 量 優(yōu) 化 計(jì) 算 ， 產(chǎn) 生 目 標(biāo) 序 列 三 維 結(jié) 構(gòu)。 序 列 相 似 性 越 高 ， 預(yù) 測 的 模 型 也 越 準(zhǔn) 確 。折 疊 識 別 ： 通 過 預(yù) 測 二 級 結(jié) 構(gòu) 、 預(yù) 測 折 疊 方 式 和 參考 其 它 蛋 白 的 空 間 結(jié) 構(gòu) ， 從 而 產(chǎn) 生 目 標(biāo) 序 列 的 三 維結(jié) 構(gòu) 。從 無 到 有 ： 根 據(jù) 單 個(gè) 氨 基 酸 形 成 二 級 結(jié) 構(gòu) 的 傾 向 ，加 上 各 種 作 用 力 力 場 信 息 ， 直 接 產(chǎn) 生 目 標(biāo) 序 列 三 維結(jié) 構(gòu) 。 n 根 據(jù) 蛋 白 質(zhì) 的 氨 基 酸 序 列 預(yù) 測 其 三 維 空 間 結(jié) 構(gòu) ：