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1、 基 因 工 程 基 本 操 作 的 四 個 步 驟1、 目 的 基 因 的 獲 取2、 基 因 表 達 載 體 的 構 建3、 將 目 的 基 因 導 入 受 體 細 胞4、 目 的 基 因 的 檢 測 與 鑒 定 一 、 目 的 基 因 的 獲 ?。?一 ） 從 基 因 文 庫 中 直 接 獲 取1.基 因 文 庫 ： 概 念 見 P92.基 因 文 庫 的 分 類 :按 外 源 DNA片 段 的 來 源 分 類種類 基 因 組 DNA文 庫 ： 含 有 一 種 生 物 的 全 部 基 因部 分 基 因 文 庫 ： 只 包 含 了 一 種 生 物 的 部 分 基 因 ， 如 ： cDNA文

2、 庫3.基 因 文 庫 的 目 的為 了 在 不 知 目 的 基 因 序 列 的 情 況 下 ， 便 于 獲 得 所 需 的目 的 基 因 。4.獲 取 目 的 基 因 的 根 據(jù) ： 見 課 本 P9 提 取 某 生 物全 部 DNA 用 適 當限 制 酶 切 割 許 多DNA片 段 與 載 體 連 接導 入 受 體 菌 群 該 生 物 基因 組 文 庫（ 每 個 受 體 菌 含 有 一 段 不 同 的 DNA片 段 ）與 載 體 連 接導 入 受 體 菌 群mRNA逆 轉 錄 酶雜 交 雙 鏈核 酸 酶 H單 鏈 DNADNA聚 合 酶 雙 鏈 DNA(cDNA) 該 生 物cDNA文 庫

3、 2.基 因 文 庫 的 構 建 方 法 鳥 槍 法 ：供 體 細 胞 中 的 DNA許 多 DNA片 段運 載 體 限 制 酶與 載 體 連 接載 入受 體 細 胞 產(chǎn) 生 特 定 性 狀導 入 外 源 DNA擴 增 目 的 基 因 分 離(直 接 分 離 法 ) (一 )從 基 因 文 庫 中 獲 取 目 的 基 因 反 轉 錄 法 ： 以 目 的 基 因 轉 錄 成的 信 使 RNA為 模 板 ， 反轉 錄 成 互 補 的 單 鏈 DNA，然 后 在 酶 的 作 用 下 合 成雙 鏈 DNA， 從 而 獲 得 所需 的 基 因 。 形 成 的 事cDNA文 庫 目 的 基 因 的 mRN

4、A雜 交 雙 鏈(單 鏈 RNA/單 鏈 DNA)單 鏈 DNA反 轉 錄 酶核 酸 酶 H2.基 因 文 庫 的 構 建 方 法 DNA聚 合 酶雙 鏈 DNA(目 的 基 因 ) 1、 概 念 ： PCR全 稱 為 _， 是 一 項 在 生 物 _復 制 _的 核 酸 合 成 技 術 通 過 這 項 技 術 可 在 短 時 間 內(nèi) 大 量 擴 增 目 的 基 因 因 為 整 個 過 程 是 在 體 外 進 行 ， 所 以 又 叫 做 體 外 DNA擴 增 技 術 。 聚 合 酶 鏈 式 反 應體 外 特 定 DNA片 段2、 原 理 ： DNA復 制（ 二 ） 利 用 PCR技 術 擴 增

5、 目 的 基 因 四 種 脫 氧 核 苷 酸 (dNTP) 一 對 引 物 ：熱 穩(wěn) 定 DNA聚 合 酶 (Taq酶 ）模 板 DNA( 需 含 有 目 的 基 因 ) 一 對 寡 核 苷 酸 序 列 ： 與 目 的 基 因的 起 始 段 互 補一 段 已 知 目 的 基 因 的 核 苷 酸 序 列 ， 以 便根 據(jù) 這 一 序 列 合 成 引 物溫 度 控 制 5/ 3/GG TC3/ 5/GACC5/ 3/引 物 GG 變 性復 性延 伸1、 變 性 (90-95度 )： 目 的 基 因 DNA受 熱 變 性 ， 解 鏈 為 單 鏈 ；2.復 性 （ 55-60） ： 引 物 與 兩 條

6、 單 鏈 通 過 堿 基 互 補 配 對 原 則 結 合 ；3.延 伸 （ 70-75） ： 在 DNA聚 合 酶 （ Taq酶 ） 作 用 下 ， 從 5端 3端 進 行 延 伸 。 5/3/AG引 物 5、 擴 增 過 程 利 用 PCR技 術 擴 增 目 的 基 因 PCR技 術 擴 增 過 程a、 DNA變 性 （ 90 -95 ） ： 雙 鏈 DNA模 板 在 熱 作 用 下 ， 斷 裂 ， 形 成 _ b、 復 性 （ 55 -60 ） ： 系 統(tǒng) 溫 度 降 低 ， 引 物 與 DNA模 板 結 合 ， 形 成 局 部 _。 c、 延 伸 （ 70 -75 ） ： 在 TaqDN

7、A聚 合 酶 的 作用 下 ， 從 引 物 的 _延 伸 ， 合 成 與模 板 互 補 的 _。 氫 鍵 單 鏈 DNA雙 鏈DNA鏈 5端 3端 DNA合 成 儀推測 推測 合成 質 粒目 的 基 因限 制 酶 DNA連 接 酶重 組 DNA 1.用 一 定 的 _切 割 質 粒 ， 使 其 出 現(xiàn) 一 個 切 口 ， 露 出 _。2.用 _切 斷 目 的 基 因 ， 使 其 產(chǎn) 生 _ _。 核 心3.將 切 下 的 目 的 基 因 片 段 插 入 質 粒 的 _處 ， 再 加 入 適 量 _， 形 成 了 一 個 重 組 DNA分 子 （ 重 組 質 粒 ）限 制 酶黏 性 末 端同 一

8、 種 限 制 酶的 黏 性 末 端 切 口DNA連 接 酶相 同(二 )基 因 表 達 載 體 的 構 建 基 因 表 達 載 體 的 構 建 核 心質 粒 DNA分 子一 個 切 口兩 個 黏 性 末 端 兩 個 切 口獲 得 目 的 基 因DNA 連 接 酶重 組 DNA分 子 （ 重 組 質 粒 ）同 一 種 限 制 酶 科 學 家 在 培 育 抗 蟲 棉 時 ， 經(jīng) 過 了 許 多 復 雜 的過 程 和 不 懈 的 努 力 ， 才 獲 得 成 功 。 起 初 把 蘇 云 金 芽 孢 桿 菌 的 抗 蟲 基 因 插 入 載 體質 粒 中 ， 然 后 導 入 棉 花 的 受 精 卵 中 ，

9、 結 果 抗 蟲 基因 在 棉 花 體 內(nèi) 沒 有 表 達 。 然 后 在 插 入 抗 蟲 基 因 的 質 粒 中 插 入 啟 動 子 (抗蟲 基 因 首 端 )， 導 入 棉 花 受 精 卵 ， 長 成 的 棉 花 植 株還 是 沒 有 抗 蟲 能 力 。 科 學 家 又 在 有 啟 動 子 、 抗 蟲基 因 的 質 粒 中 插 入 終 止 子 (抗 蟲 基 因 末 端 )， 導 入棉 花 受 精 卵 ， 結 果 成 長 的 植 株 ， 有 了 抗 蟲 能 力 。 基 因 表 達 載 體 的 組 成 ：目 的 ： 使 目 的 基 因 在 受 體 細 胞 中 穩(wěn) 定 存在 ， 并 且 可 以

10、遺 傳 給 下 一 代 ， 同 時 使 目的 基 因 能 夠 表 達 和 發(fā) 揮 作 用 。a、 目 的 基 因b、 啟 動 子c、 終 止 子d、 標 記 基 因 知 識 點 一 ： 1.原 核 細 胞 的 基 因 結 構非 編 碼 區(qū) 非 編 碼 區(qū)編 碼 區(qū)編 碼 區(qū) 上 游 編 碼 區(qū) 下 游 與 RNA聚 合 酶 結 合 位 點啟 動 子 終 止 子啟 動 子 ： 位 于 基 因 首 端 一 段 能 與 RNA聚 合 酶 結 合 并 能 起始 mRNA合 成 的 序 列 。 沒 有 啟 動 子 ， 基 因 就 不 能 轉 錄 。終 止 子 ： 位 于 基 因 的 尾 端 的 一 段

11、特 殊 的 DNA片 斷 ， 它 能阻 礙 RNA聚 合 酶 的 移 動 ， 并 使 其 從 DNA模 板 鏈 上 脫 離 下 來 ，使 轉 錄 終 止 。RNA聚 合 酶 :能 夠 識 別 啟 動 子 上 的 結 合 位 點 并 與 其 結 合的 一 種 蛋 白 質 .(以 模 板 轉 錄 然 后 脫 落 ) 不 能 轉 錄 為 信 使 RNA， 不 能 編 碼 蛋 白 質 。： 能 轉 錄 相 應 的 信 使 RNA， 能 編 碼 蛋 白 質 編 碼 區(qū)非 編 碼 區(qū)原 核細 胞的 基 因結 構 有 調 控 遺 傳 信 息 表 達 的 核 苷 酸 序 列 ， 在 該 序 列 中 ， 最 重

12、 要 的 是 位 于 編 碼 區(qū) 上 游 的 RNA聚 合 酶 結 合 位 點 。非 編 碼 區(qū) 非 編 碼 區(qū)編 碼 區(qū)編 碼 區(qū) 上 游 編 碼 區(qū) 下 游 啟 動 子 終 止 子 編 碼 區(qū)非 編 碼 區(qū) 非 編 碼 區(qū)與 RNA聚 合 酶結 合 位 點 內(nèi) 含 子 外 顯 子 能 夠 編 碼 蛋 白 質 的 序 列 叫 做 外 顯 子 不 能 夠 編 碼 蛋 白 質 的 序 列 叫 做 內(nèi)含 子啟 動 子 終 止 子編 碼 區(qū) 上 游 編 碼 區(qū) 下 游 內(nèi) 含 子 ： 外 顯 子 ： 知 識 點 一 ： 2.真 核 細 胞 的 基 因 結 構 真 核細 胞的 基 因結 構 編 碼 區(qū)

13、非 編 碼 區(qū) 外 顯 子 ： 能 編 碼 蛋 白 質 的 序 列內(nèi) 含 子 ： 不 能 編 碼 蛋 白 質 的 序 列： 有 調 控 作 用 的 核 苷 酸 序 列 ， 包 括 位 于 編 碼 區(qū) 上 游 的 RNA 聚 合 酶 結 合 位 點 等 。 原 核 細 胞 真 核 細 胞不 同 點 編 碼 區(qū) 是_的 編 碼 區(qū) 是 間 隔 的 、_的相 同 點 都 由 能 夠 編 碼 蛋 白 質 的 _和 具有 調 控 作 用 的 _區(qū) 組 成 的原 核 細 胞 與 真 核 細 胞 的 基 因 結 構 比 較思 考 編 碼 相 同 數(shù) 目 氨 基 酸 的 蛋 白 質 ， 原 核細 胞 與 真

14、核 細 胞 基 因 結 構 一 樣 長 嗎 ？連 續(xù) 不 連 續(xù)編 碼 區(qū)非 編 碼 DUCK179制 作 三 、 目 的 基 因 導 入 受 體 細 胞 1、 導 入 植 物 細 胞 常 用 的 方 法 是 什么 ？ 具 體 過 程 是 怎 樣 的 ？ 2、 導 入 動 物 細 胞 常 用 的 方 法 是 什么 ？ 基 本 操 作 程 序 是 怎 樣 的 ？ 3、 導 入 大 腸 桿 菌 的 方 法 是 怎 樣 的 ？鈣 離 子 有 什 么 作 用 ？哪 些 細 胞 可 以 作 為 目 的 基 因 的 受 體 ？ 四 、 目 的 基 因 的 檢 測 與 鑒 定 導 入 目 的 基 因 后 需 要 檢 測 哪 些 方 面 ？各 采 取 什 么 方 法 ？ 什 么 是 DNA分 子 探 針 ？ 檢 測 時 的DNA探 針 通 過 什 么 原 理 來 檢 測 目 的基 因 和 相 應 的 mRNA？ 利 用 抗 體 抗 原 雜 交 檢 測 的 原 理 是什 么 ？ DUCK179制 作