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1、 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查2010.12 目 錄v1、 實(shí) 驗 原 理v2、 實(shí) 驗 試 劑v3、 試 驗 器 具v4、 檢 查 方 法 概 述v5、 供 試 品 溶 液 的 制 備 v6、 內(nèi) 毒 素 限 值 的 確 定v7、 最 大 有 效 稀 釋 倍 數(shù) （ MVD） 的 確 定 v8、 鱟 試 劑 靈 敏 度 復(fù) 核v9、 干 擾 試 驗v10、 供 試 品 的 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查 實(shí) 驗 原 理v利 用 鱟 試 劑 與 微 量 內(nèi) 毒 素 產(chǎn)生 凝 集 反 應(yīng) 的 現(xiàn) 象 ， 以 判 斷供 試 品 中 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 的 限 量是 否 符 合 規(guī) 定 的 一 種 方

2、 法 。陽 性 結(jié) 果v細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 的 量 用 內(nèi) 毒 素 單 位 (EU)表 示 。 實(shí) 驗 試 劑v鱟 試 劑 從 海 洋 無 脊 椎 動 物 “ 鱟 ”的 藍(lán) 色 血 液 中 提 取 的 變 形 細(xì) 胞 溶 解物 ， 經(jīng) 低 溫 冷 凍 干 燥 精 制 而 成 的 生物 制 劑 。 鱟 試 劑 的 生 物 活 性 以 其 能 檢 出 細(xì) 菌內(nèi) 毒 素 的 最 低 有 效 濃 度 表 示 ， 即 鱟試 劑 的 靈 敏 度 ， 單 位 為 EU/ml。當(dāng) 使 用 新 批 號 的 鱟 試 劑 或 試 驗 條件 發(fā) 生 可 能 影 響 檢 驗 結(jié) 果 的 改 變時 ， 應(yīng) 進(jìn) 行 鱟

3、試 劑 靈 敏 度 復(fù) 核 試驗 。 實(shí) 驗 試 劑v細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 國 家 標(biāo) 準(zhǔn) 品 系 自 大 腸 埃 希 菌 提 取 精 制 得 到 的內(nèi) 毒 素 ， 用 于 標(biāo) 定 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 工 作 標(biāo) 準(zhǔn) 品 和 標(biāo) 定 ， 仲 裁 鱟 試劑 靈 敏 度 。v細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 工 作 標(biāo) 準(zhǔn) 品 系 以 細(xì)菌 內(nèi) 毒 素 國 家 標(biāo) 準(zhǔn) 品 為 基 準(zhǔn) 標(biāo) 定 其效 價 ， 用 于 試 驗 中 鱟 試 劑 靈 敏 度 復(fù)核 、 干 擾 試 驗 及 各 種 陽 性 對 照 。v細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查 用 水 指 內(nèi) 毒 素含 量 小 于 0.015EU/ml（ 用 于 凝 膠

4、法 ）或 0.005EU/ml（ 用 于 光 度 測 定 法 ）且 對 內(nèi) 毒 素 試 驗 無 干 擾 作 用 的 滅 菌注 射 用 水 。 試 驗 器 具 v刻 度 吸 管 、 凝 集 管 （ 10 75mm） 、 三 角 瓶 、 小 試 管（ 16 100mm） 、 試 管 架 、 洗 耳 球 、 封 口 膜 或 金 屬 試 管帽 、 時 鐘 、 脫 脂 棉 、 吸 水 紙 、 剪 刀 砂 輪 。v耐 熱 器 皿 常 用 干 熱 滅 菌 法 （ 250 、 30 分 鐘 以 上 ） 去 除 ，塑 料 用 具 應(yīng) 選 用 標(biāo) 明 無 內(nèi) 毒 素 并 且 對 試 驗 無 干 擾 的 器 械（

5、 目 前 多 為 無 熱 原 的 一 次 性 用 品 ） 。 檢 查 方 法 概 述v凝 膠 法 限 量 試 驗 半 定 量 試 驗v光 度 測 定 法 濁 度 法 （ 終 點(diǎn) 濁 度 法 和 動 態(tài) 濁 度 法 ） 顯 色 基 質(zhì) 法 （ 終 點(diǎn) 顯 色 法 和 動 態(tài) 顯 色 法 ） 凝 膠 法 ： 最 簡 單 、 經(jīng) 濟(jì) 、 應(yīng) 用 最 廣 泛 ， 中 國 藥 典 的 “ 仲 裁 ”方 法 對 干 擾 相 對 不 敏 感 。 較 光 度 測 定 法 不 靈 敏 供 試 品 溶 液 的 制 備 v某 些 供 試 品 需 進(jìn) 行 復(fù) 溶 、 稀 釋 或 在 水 性 溶 液 中 浸提 制

6、成 供 試 品 溶 液 。v一 般 要 求 供 試 品 溶 液 的 pH 值 在 6.0 8.0 的 范 圍 內(nèi) 。v可 使 用 酸 、 堿 溶 液 或 適 宜 的 緩 沖 液 調(diào) 節(jié) pH 值 。 內(nèi) 毒 素 限 值 的 確 定v一 般 按 公 式 ： L=K/M 式 中 L 為 供 試 品 的 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 限 值 ， 以 EU/ml、 EU/mg 或 EU/U（ 活 性 單 位 ） 表 示 。 K 為 人 每 公 斤 體 重 每 小 時 最 大 可 接 受 的 內(nèi) 毒 素 劑 量 。 注 射劑 K=5EU/（ kgh） ， 放 射 性 藥 品 注 射 劑 K=2.5EU/（ kg

7、h） ， 鞘 內(nèi) 用 注 射 劑 K=0.2EU/（ kgh） 。 M 為 人 用 每 公 斤 體 重 每 小 時 的 最 大 供 試 品 劑 量 ， 依 據(jù) 藥 品使 用 說 明 書 ， 臨 床 用 藥 須 知 確 定 。v例 ： 某 產(chǎn) 品 M為 14.3mg/kg， L=5/14.3=0.35EU/mg 假 如 此 產(chǎn) 品 的 濃 度 為 100mg/ml， 那 么 ， L=0.35100=35EU/ml 最 大 有 效 稀 釋 倍 數(shù) 的 確 定 v最 大 有 效 稀 釋 倍 數(shù) （ MVD） 指 在 試 驗 中 供 試 品 溶 液被 允 許 稀 釋 的 最 大 倍 數(shù) ， 在 不

8、超 過 此 稀 釋 倍 數(shù) 的 濃 度 下 進(jìn)行 內(nèi) 毒 素 限 值 的 檢 測 。vMVD=cL/ 式 中 L 為 供 試 品 的 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 限 值 ； c 為 供 試 品 溶 液 的 濃度 ， 當(dāng) L 以 EU/ml 表 示 時 ， 則 c 等 于 1.0ml/ml， 當(dāng) L以EU/mg 或 EU/U 表 示 時 ， c 的 單 位 需 為 mg/ml 或 U/ml。 如供 試 品 為 注 射 用 無 菌 粉 末 或 原 料 藥 ， 則 MVD 取 1， 可 計 算供 試 品 的 最 小 有 效 稀 釋 濃 度 c=/L； 為 在 凝 膠 法 中 鱟 試 劑的 標(biāo) 示 靈 敏 度

9、 （ EU/ml） 。 鱟 試 劑 靈 敏 度 復(fù) 核v目 的 考 察 鱟 試 劑 的 靈 敏 度 是 否 準(zhǔn) 確 、 考 察 檢 驗 人 員 操 作方 法 是 否 正 確 及 實(shí) 驗 條 件 是 否 符 合 規(guī) 定 。 當(dāng) 使 用 新 批 號 的 鱟 試 劑 或 試 驗 條 件 發(fā) 生 可 能 影 響 檢 驗 結(jié) 果的 改 變 時 ， 應(yīng) 進(jìn) 行 鱟 試 劑 靈 敏 度 復(fù) 核 試 驗 。v細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 的 準(zhǔn) 備 1、 取 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 工 作 標(biāo) 準(zhǔn) 品 （ 或國 家 標(biāo) 準(zhǔn) 品 ） 一 支 ， 輕 彈 瓶 壁 ，使 粉 末 落 入 瓶 底 ， 然 后 用

10、砂 輪 在瓶 頸 上 部 輕 輕 劃 痕 ， 75%酒 精 棉球 擦 拭 后 啟 開 ， 啟 開 過 程 中 應(yīng) 防止 玻 璃 屑 落 入 瓶 內(nèi) 。 鱟 試 劑 靈 敏 度 復(fù) 核 2、 按 照 標(biāo) 準(zhǔn) 品 說 明 書 ， 加 入 規(guī) 定 量 的細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查 用 水 溶 解 其 內(nèi) 容 物 ， 用封 口 膜 將 瓶 口 封 嚴(yán) ， 置 漩 渦 混 合 器 上 混合 15分 鐘 。 然 后 進(jìn) 行 稀 釋 ， 制 備 成 4個濃 度 的 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 ， 即 2、 、0.5和 0.25（ 為 所 復(fù) 核 的 鱟 試 劑 的 標(biāo)示 靈 敏 度 ） 四 個 濃

11、 度 的 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 ，每 稀 釋 一 步 均 應(yīng) 在 旋 渦 混 合 器 上 混 勻30 秒 鐘 。v示 例 某 待 復(fù) 核 鱟 試 劑 的 靈 敏 度 標(biāo) 示 值 為 0.25EU/ml， 細(xì)菌 內(nèi) 毒 素 工 作 標(biāo) 準(zhǔn) 品 規(guī) 格 為 150 EU/ml， 將 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 工 作標(biāo) 準(zhǔn) 品 用 1ml細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查 用 水 溶 解 ， 再 稀 釋 制 備 成 濃 度為 0.50 EU/ml， 0.25EU/ml， 0.125EU/ml和 0.06EU/ml的 細(xì)菌 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 。 鱟 試 劑 靈 敏 度 復(fù) 核v細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素

12、標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 的 制 備 圖 示 ： 鱟 試 劑 靈 敏 度 復(fù) 核v待 復(fù) 核 鱟 試 劑 的 準(zhǔn) 備 取 規(guī) 格 為 0.1ml/支 的 鱟 試 劑 18支 ， 每 支 加 入 0.1ml檢 查 用 水使 溶 解 備 用 （ 規(guī) 格 大 于 0.1ml 支 的 鱟 試 劑 ， 按 其 標(biāo) 示 量加 入 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查 用 水 復(fù) 溶 后 按 0.1ml/管 分 裝 到 凝 聚 管中 ， 至 少 準(zhǔn) 備 18管 ） 。v加 樣 將 已 充 分 溶 解 的 待 復(fù) 核 鱟 試 劑 18支 （ 管 ） 放 在 試 管 架 上 ， 排 成 5列 ， 其 中 4列 4支 ， 1列 2

13、支 。 其 中4支 4列 分 別 加 入 0.1ml的 2、 、0.5和 0.25的 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 ；另 2支 （ 管 ） 加 入 0.1ml檢 查 用 水 作 為 陰 性 對 照 。 鱟 試 劑 靈 敏 度 復(fù) 核 加 樣 結(jié) 束 后 ， 將 鱟 試 劑 用 封 口 膜 封 口 ， 輕 輕 振 動 混 勻 ， 垂直 放 入 37 1 恒 溫 器 中 ， 保 溫 60 2分 鐘 。v結(jié) 果 觀 察 將 試 管 輕 輕 取 出 ， 緩 緩 倒 轉(zhuǎn) 180 ， 若 管 內(nèi) 形 成 凝 膠 ， 并且 凝 膠 不 變 形 、 不 從 管 壁 滑 脫 者 為 陽 性 ， 未 形 成 凝

14、膠 或 形成 的 凝 膠 不 堅 實(shí) 、 變 形 并 從 管 壁 滑 脫 者 為 陰 性 。 陽性 陰性 鱟 試 劑 靈 敏 度 復(fù) 核v計 算 當(dāng) 最 大 濃 度 2管 均 為 陽 性 ， 最 低 濃 度 0.25管 均 為 陰 性 ，陰 性 對 照 為 陰 性 時 實(shí) 驗 為 有 效 ， 按 下 式 計 算 反 應(yīng) 終 點(diǎn) 濃 度的 幾 何 平 均 值 即 為 鱟 試 劑 靈 敏 度 的 復(fù) 核 結(jié) 果 。 c=lg-1（ X/4） 式 中 X 為 反 應(yīng) 終 點(diǎn) 濃 度 的 對 數(shù) 值 （ lg） 。 反 應(yīng) 終 點(diǎn) 濃 度 是 指 系 列 遞 減 的 內(nèi) 毒 素 濃 度 中 最 后

15、一 個 呈 陽性 結(jié) 果 的 濃 度 。 鱟 試 劑 靈 敏 度 復(fù) 核v例 子 ：v結(jié) 果 判 斷 當(dāng) c 在 0.5 2（ 包 括 0.5和 2） 時 ， 方 可 用 于 細(xì) 菌 內(nèi) 毒素 檢 查 ， 并 以 標(biāo) 示 靈 敏 度 為 該 批 鱟 試 劑 的 靈 敏 度 。 干 擾 實(shí) 驗 v目 的 確 定 供 試 品 在 多 大 的 稀 釋 倍 數(shù) 或 濃 度 下 對 內(nèi) 毒 素 和鱟 試 劑 的 反 應(yīng) 不 存 在 干 擾 作 用 ， 為 能 否 使 用 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢查 法 提 供 依 據(jù) 。v當(dāng) 進(jìn) 行 新 藥 的 內(nèi) 毒 素 檢 查 試 驗 前 ， 或 無 內(nèi) 毒 素

16、檢查 項 的 品 種 建 立 內(nèi) 毒 素 檢 查 法 時 ， 須 進(jìn) 行 干 擾 試驗 。v當(dāng) 鱟 試 劑 、 供 試 品 的 配 方 、 生 產(chǎn) 工 藝 改 變 或 試 驗環(huán) 境 中 發(fā) 生 了 任 何 有 可 能 影 響 試 驗 結(jié) 果 的 變 化 時 ，須 進(jìn) 行 干 擾 試 驗 。 干 擾 實(shí) 驗v進(jìn) 行 干 擾 試 驗 一 般 步 驟 供 試 品 限 值 確 定 根 據(jù) 鱟 試 劑 的 靈 敏 度 確 定 MVD范 圍 （ 供 試 品 溶 液 濃 度 范 圍 ） 預(yù) 試 驗 （ 初 篩 試 驗 ） 確 定 樣 品 最 大 不 干 擾 濃 度 正 式 干 擾 試 驗v干 擾 實(shí) 驗

17、預(yù) 實(shí) 驗 目 的 初 步 確 定 供 試 品 的 最 大 不 干 擾 濃 度 （ 當(dāng) 限 值 以EU/mg或 EU/U活 性 單 位 表 示 ） 或 最 小 不 干 擾 稀 釋 倍 數(shù)（ 當(dāng) 限 值 以 EU/ml表 示 ） ， 為 正 式 干 擾 實(shí) 驗 提 供 依 據(jù) ,避 免干 擾 試 驗 的 盲 目 性 。 干 擾 實(shí) 驗v操 作 方 法 1、 將 無 可 檢 測 到 內(nèi) 毒 素 的 供 試 品 進(jìn) 行 一 系 列 倍 數(shù) 的 稀 釋 ，但 最 大 的 稀 釋 倍 數(shù) 不 得 超 過 MVD=CL/0.03（ 0.03EU/ml為 現(xiàn) 今 我 國 市 售 鱟 試 劑 的 最 高 靈

18、 敏 度 ） 。 2、 使 用 鱟 試 劑 對 每 一 稀 釋 倍 數(shù) 進(jìn) 行 檢 驗 。 每 一 稀 釋 倍 數(shù)下 做 2支 供 試 品 管 和 2支 供 試 品 陽 性 對 照 （ 即 該 濃 度 的 供 試品 稀 釋 液 將 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 品 制 成 2濃 度 ） 。 另 取 2支 細(xì) 菌 內(nèi)毒 素 檢 查 用 水 作 陰 性 對 照 ， 2支 加 入 2濃 度 的 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn)溶 液 作 為 陽 性 對 照 。 例 制 備 稀 釋 倍 數(shù) 為 4的 供 試 品 陽 性 對 照 溶 液 ：0.3ml4.0EU/ml的 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 液 +0.3ml稀 釋 倍 數(shù) 為 2

19、的 供試 品 稀 釋 液 0.6ml含 2EU/ml內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 液 的 稀 釋 倍 數(shù) 為4的 供 試 品 稀 釋 液 3、 保 溫 60 2分 鐘 ， 觀 察 并 記 錄 結(jié) 果 。 干 擾 實(shí) 驗 4、 當(dāng) 陰 性 對 照 為 陰 性 ， 陽 性 對 照 為 陽 性 時 ， 實(shí) 驗 有 效 。當(dāng) 系 列 濃 度 中 出 現(xiàn) 供 試 品 溶 液 2管 為 陰 性 ， 供 試 品 陽 性 對照 2管 為 陽 性 時 ， 認(rèn) 為 供 試 品 在 該 濃 度 下 不 干 擾 實(shí) 驗 ， 此稀 釋 倍 數(shù) 即 為 最 小 不 干 擾 稀 釋 倍 數(shù) 。 即 可 選 擇 該 稀 釋 倍 數(shù)進(jìn)

20、 行 正 式 干 擾 實(shí) 驗 。 5、 當(dāng) 系 列 濃 度 中 所 有 濃 度 的 供 試 品 管 都 不 為 陰 性 ， 或 供試 品 陽 性 對 照 不 為 陽 性 時 ， 說 明 供 試 品 對 內(nèi) 毒 素 與 鱟 試 劑的 反 應(yīng) 存 在 干 擾 ， 則 應(yīng) 對 供 試 品 進(jìn) 行 更 大 稀 釋 倍 數(shù) （ 不 得超 過 MVD=CL/0.03 ） ， 或 通 過 其 他 適 宜 的 方 法 （ 如 過 濾 、中 和 、 透 析 或 加 熱 處 理 等 ） 排 除 干 擾 。 6、 當(dāng) 供 試 品 的 內(nèi) 毒 素 限 值 單 位 為 EU/mg或 EU/U活 性 單 位時 ， 應(yīng) 將

21、 最 小 不 干 擾 稀 釋 倍 數(shù) 換 算 成 最 大 不 干 擾 濃 度 （ 即稀 釋 倍 數(shù) 下 溶 液 的 濃 度 ） ， 以 mg/ml或 活 性 單 位 /ml表 示 。 干 擾 實(shí) 驗v舉 例 某 注 射 液 限 值 為 2.5EU/ml， 按 MVD CL/計 算 出 靈 敏 度 為0.03EU/ml下 的 MVD為 83倍 ， 將 供 試 品 溶 液 進(jìn) 行 一 系 列 稀釋 ， 用 靈 敏 度 為 0.25 EU/ml的 鱟 試 劑 預(yù) 實(shí) 驗 ， 結(jié) 果 如 下 ：稀 釋 倍 數(shù) 原 液 5 10 20 40 80供 試 品 溶 液 供 試 品 陽 性 對 照 + +

22、+ + + +由 以 上 結(jié) 果 可 初 步 確 定 該 樣 品 的 最 小 不 干 擾 稀 釋 倍 數(shù)為 20倍 ， 可 在 此 濃 度 下 進(jìn) 行 正 式 干 擾 試 驗 。 干 擾 實(shí) 驗v正 式 干 擾 實(shí) 驗 制 備 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 對 照 溶 液 取 1支 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 品 ， 用 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查 用 水 稀 釋 成 4個 濃 度 的 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 即 2、 、 0.5、 0.25。 制 備 含 內(nèi) 毒 素 的 供 試 品 溶 液 將 供 試 品 稀 釋 至 預(yù) 實(shí) 驗 中 確 定 的 不 干 擾 稀 釋 倍 數(shù) ， 再 用 此稀 釋 液 將 同

23、支 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 品 稀 釋 成 4個 濃 度 即 2、 、0.5、 0.25的 含 內(nèi) 毒 素 的 供 試 品 溶 液 。 鱟 試 劑 的 準(zhǔn) 備 取 規(guī) 格 為 0.1ml/支 的 鱟 試 劑 36支 ， 備 用 。 干 擾 實(shí) 驗 加 樣 準(zhǔn) 備 好 的 36支 鱟 試 劑 放 在 試 管 架 上 ， 按 下 圖 加 樣 。0.1ml內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 液 0.1ml檢 查 用 水 0.1ml含 內(nèi) 毒 素 的 供 試 品 液 0.1ml供 試 品 液加 樣 結(jié) 束 后 ， 用 封 口 膜 封 口 ， 輕 輕 振 動 混 勻 ， 避 免 產(chǎn) 生氣 泡 ， 放 入 37 1

24、 恒 溫 器 中 ， 保 溫 60 2分 鐘 ， 觀 察并 記 錄 結(jié) 果 。 干 擾 實(shí) 驗 實(shí) 驗 結(jié) 果 計 算 如 兩 組 最 大 濃 度 2.0均 為 陽 性 ， 最 低 濃 度 0.25均 為 陰 性 ，陰 性 對 照 4管 均 為 陰 性 時 ， 按 下 式 計 算 用 檢 查 用 水 制 成 的內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 的 反 應(yīng) 終 點(diǎn) 濃 度 的 幾 何 平 均 值 （ Es） 和 用供 試 品 溶 液 或 稀 釋 液 制 成 的 內(nèi) 毒 素 溶 液 的 反 應(yīng) 終 點(diǎn) 濃 度 的幾 何 平 均 值 （ Et） 。Es=lg-1（ Xs/4）Et=lg-1（ Xt/4）

25、 式 中 Xs、 Xt 分 別 為 用 檢 查 用 水 和 供 試 品 溶 液 或 稀 釋 液 制 成 的 內(nèi)毒 素 溶 液 的 反 應(yīng) 終 點(diǎn) 濃 度 的 對 數(shù) 值 （ lg） 。 干 擾 實(shí) 驗 當(dāng) Es 在 0.5 2（ 包 括 0.和 2） 及 Et 在 0.5Es 2Es（ 包括 0.5Es和 2Es） 時 ， 則 認(rèn) 為 供 試 品 在 該 濃 度 下 無 干 擾 作 用 ，可 在 該 濃 度 下 對 此 供 試 品 進(jìn) 行 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查 。 當(dāng) Et不 在 0.5Es 2Es（ 包 括 0.5Es和 2Es） 時 ， 則 認(rèn) 為 供試 品 在 該 濃 度 下 干

26、 擾 實(shí) 驗 。 應(yīng) 使 用 適 宜 方 法 排 除 干 擾 ， 如可 將 供 試 品 進(jìn) 行 更 大 倍 數(shù) 稀 釋 （ 不 超 過 MVD ） 。 v建 立 新 品 種 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查 方 法 時 ， 每 個 廠 家 至 少 取 三 個批 號 的 供 試 品 。 用 兩 個 以 上 鱟 試 劑 生 產(chǎn) 廠 家 的 鱟 試 劑 進(jìn) 行干 擾 實(shí) 驗 。 供 試 品 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查v在 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查 中 ， 每 批 供 試 品 必 須 做 2支 供 試 品 管 和 2支 供 試 品 陽 性 對 照 ， 同 時 每 次 實(shí) 驗 必 須 做 2支 陽 性 對

27、 照 和 2支 陰 性 對 照 。v供 試 品 溶 液 的 制 備 根 據(jù) 內(nèi) 毒 素 限 度 值 ， 計 算 MVD=CL/。 然 后 將 供 試 品 進(jìn) 行稀 釋 ， 其 稀 釋 倍 數(shù) 不 得 超 過 MVD。 一 般 稀 釋 至 MVD； 如 樣 品 有 干 擾 作 用 ， 選 擇 符 合 干 擾 試 驗要 求 的 第 二 濃 度 作 為 日 常 檢 查 濃 度 。v陽 性 對 照 溶 液 的 制 備 用 檢 查 用 水 將 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 品 稀 釋 制 成 2濃 度 的 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn)溶 液 。 供 試 品 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查v供 試 品 陽 性 對 照 溶 液

28、的 制 備 用 待 檢 測 的 供 試 品 溶 液 或 其 稀 釋 液 將 內(nèi) 毒 素 標(biāo) 準(zhǔn) 品 制 成 2濃 度 的 內(nèi) 毒 素 溶 液 。v陰 性 對 照 即 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查 用 水 。v鱟 試 劑 的 準(zhǔn) 備 取 規(guī) 格 為 0.1ml/支 的 鱟 試 劑 8支 ， 每 支 加 入 0.1ml檢 查 用 水使 溶 解 備 用 。v加 樣 8支 管 中 2支 加 入 0.ml供 試 品 溶 液 或 其 稀 釋 液 作 為 供 試 品 管 ，2支 加 入 0.1ml陽 性 對 照 溶 液 作 為 陽 性 對 照 管 ， 2支 加 入0.1ml檢 查 用 水 作 為 陰 性 對

29、照 管 ,2支 加 入 0.1ml供 試 品 陽 性對 照 溶 液 作 為 供 試 品 陽 性 對 照 管 。 將 試 管 中 溶 液 輕 輕 混 勻 后 ， 用 封 口 膜 封 閉 管 口 ， 垂 直 放 入37 1 水 浴 或 適 宜 恒 溫 器 中 ， 保 溫 60 2分 鐘 。 供 試 品 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查v結(jié) 果 判 斷 當(dāng) 陽 性 對 照 都 為 陽 性 、 供 試 品 陽 性 對 照 都 為 陽 性 且 陰 性 對照 都 為 陰 性 時 ， 實(shí) 驗 方 有 效 。 若 供 試 品 2管 均 為 陰 性 ， 認(rèn) 為 該 供 試 品 符 合 規(guī) 定 ； 如 供 試品 2管

30、 均 為 均 為 陽 性 ， 應(yīng) 認(rèn) 為 不 符 合 規(guī) 定 ； 如 2管 中 1管 陽性 ， 1管 陰 性 ， 則 另 取 4支 供 試 品 管 復(fù) 試 ， 4管 中 如 有 1管 為陽 性 ， 即 認(rèn) 為 不 符 合 規(guī) 定 。 若 第 一 次 實(shí) 驗 時 供 試 品 的 稀 釋倍 數(shù) 小 于 MVD而 結(jié) 果 出 現(xiàn) 2管 均 為 陽 性 或 2管 中 1管 為 陽 性時 ， 按 同 樣 方 法 復(fù) 試 ， 復(fù) 試 時 要 求 將 稀 釋 至 MVD。 供 試 品 細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 檢 查v例 某 葡 萄 糖 注 射 液 ， 其 內(nèi) 毒 素 限 值 為 0.5EU/ml， 設(shè) 所用 鱟 試 劑 的 靈 敏 度 為 0.125EU/ml。 MVD=CL/=0.5/0.125=4 將 樣 品 進(jìn) 行 4倍 稀 釋 ， 并 做 4倍 稀 釋 下 的 供 試 品 陽 性 對 照 。供 試 品 供 試 品 陽 性 對 照 陽 性 對 照 陰 性 對 照 + + + + 結(jié) 果 是 否 有 效 有 效結(jié) 果 判 斷 該 葡 萄 糖 注 射 液 內(nèi) 毒 素 含 量 小 于 0.5EU/ml， 符 合 規(guī) 定 。 結(jié) 束 ， 謝 謝 ！