《生物技術(shù)概論：第六講2植物體細(xì)胞雜交技術(shù)》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《生物技術(shù)概論：第六講2植物體細(xì)胞雜交技術(shù)（44頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、植 物 體 細(xì) 胞 雜 交 技 術(shù) 周口師范學(xué)院生命科學(xué)系 植 物 體 細(xì) 胞 雜 交 的 意 義v 有 性 雜 交 是 植 物 遺 傳 改 良 的 一 種 傳 統(tǒng) 手 段 。 作 用 空 間 ： 主 要 限 于 種 內(nèi) 的 品 種 之 間 。 種 及 種 以 上 分 類(lèi) 單 位 之 間 的 雜 交 ， 例 如種 間 或 屬 間 雜 交 ， 則 常 常 遭 遇 有 性 不 親 和 性障 礙 。 在 無(wú) 性 繁 殖 植 物 和 性 不 育 植 物 中 ， 如 在馬 鈴 薯 、 甘 薯 、 木 薯 、 甘 蔗 和 香 蕉 中 ， 更 是難 以 通 過(guò) 有 性 雜 交 進(jìn) 行 遺 傳 改 良 。 因

2、 此 ， 建 立 在 原 生 質(zhì) 體 全 能 性 基 礎(chǔ) 上 的體 細(xì) 胞 雜 交 和 胞 質(zhì) 雜 交 技 術(shù) ， 對(duì) 于 植 物 的 遺傳 改 良 具 有 重 要 的 意 義 。 體 細(xì) 胞 雜 交 （ somatic hybridization): 在 離 體 條 件 下 通 過(guò) 兩 個(gè) 親 本 體 細(xì) 胞 原 生 質(zhì)體 的 融 合 以 及 隨 后 將 融 合 產(chǎn) 物 培 養(yǎng) 成 雜 種 植株 的 過(guò) 程 。 1972年 ， Carlson首 次 獲 得 粉 藍(lán) 煙 草 和 郎氏 煙 草 的 細(xì) 胞 雜 種 ， 這 也 是 第 一 個(gè) 植 物 體 細(xì)胞 雜 種 。 1978年 梅 爾 徹

3、斯 (Melchers)等 首 次 獲 得了 番 茄 和 馬 鈴 薯 的 屬 間 體 細(xì) 胞 雜 種 “ Potamato” 。 去掉細(xì)胞壁 原生質(zhì)體融合 白 菜 甘 藍(lán) 體 細(xì) 胞 雜 交 步 驟 ：1 原 生 質(zhì) 體 的 制 備2 原 生 質(zhì) 體 的 融 合3 雜 種 細(xì) 胞 選 擇4 雜 種 細(xì) 胞 培 養(yǎng)5 由 愈 傷 組 織 再 生 植 株6 雜 種 植 株 的 鑒 定 雜 交 的 兩 個(gè) 細(xì) 胞用 纖 維 素 酶 、 果 膠 酶 處理 細(xì) 胞 壁原 生 質(zhì) 體 、 經(jīng) 離 心 、 振動(dòng) 、 電 刺 激 用 聚 二 乙 醇（ ）誘 導(dǎo)融 合 后 的 原 生 質(zhì) 體再 生 細(xì) 胞 壁雜

4、 種 細(xì) 胞 脫 分 化細(xì) 胞 分 裂愈 傷 組 織雜 種 植 株 再 分 化 （ 植 物 體 細(xì) 胞融 合 完 成 的 標(biāo)志 ）植物細(xì)胞融合 植 物組 織培 養(yǎng) 2 原 生 質(zhì) 體 融 合2.1自 發(fā) 融 合2.2 誘 發(fā) 融 合2.2.1 NaNO3處 理2.2.2 高 PH-高 濃 度 鈣 離 子 處 理2.2.3 PEG（ 聚 乙 二 醇 ） 處 理2.2.4 電 融 合 2 原 生 質(zhì) 體 融 合2.1自 發(fā) 融 合 在 酶 解 細(xì) 胞 壁 的 過(guò) 程 中 ， 有 些 相 鄰 的 原 生質(zhì) 體 能 彼 此 融 合 形 成 同 核 體 (homokaryon)，每 個(gè) 同 核 體 包

5、含 2 40個(gè) 核 。 形 成 的 原 因 ： 由 不 同 細(xì) 胞 間 胞 間 連 絲 的擴(kuò) 展 和 粘 連 造 成 的 。 減 少 自 發(fā) 融 合 的 措 施 ： 在 用 酶 液 處 理 之前 ， 使 細(xì) 胞 受 到 強(qiáng) 烈 的 質(zhì) 壁 分 離 藥 物 的 作 用 ，切 斷 胞 間 連 絲 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2 誘 發(fā) 融 合 2.2.1 NaNO3處 理 1909年 ， Kuster在 一 個(gè) 發(fā) 生 了 質(zhì) 壁 分 離 的表 皮 細(xì) 胞 中 ， 低 滲 NaNO3溶 液 可 以 引 起 2個(gè) 亞原 生 質(zhì) 體 的 融 合 。 缺 點(diǎn) ： 異 核 體 (heterokar

6、yon)形 成 頻 率 不高 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.2 高 PH-高 濃 度 鈣 離 子 處 理 1973年 ， Keller和 Melchers， 用 強(qiáng) 堿 性(PH10.5)的 高 濃 度 鈣 離 子 （ 50mmol.L-1)溶 液在 37 下 處 理 約 30min， 兩 個(gè) 品 系 的 煙 草 葉肉 原 生 質(zhì) 體 很 容 易 融 合 。 但 對(duì) 于 有 些 原 生 質(zhì) 體 系 統(tǒng) ， 這 樣 高 的 PH值 是 有 毒 的 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 PEG的 作 用 機(jī) 理 ： Kao等 認(rèn) 為 ， 由 于PE

7、G分 子 具 有 輕 微 的 負(fù) 極 性 ， 故 可 以 與 具 有正 極 性 基 團(tuán) 的 水 、 蛋 白 質(zhì) 和 碳 水 化 合 物 等 形成 H鍵 ， 從 而 在 原 生 質(zhì) 體 之 間 形 成 分 子 橋 ， 其結(jié) 果 是 使 原 生 質(zhì) 體 發(fā) 生 粘 連 進(jìn) 而 促 使 原 生 質(zhì)體 的 融 合 。 另 外 ， PEG能 增 加 類(lèi) 脂 膜 的 流 動(dòng) 性 ， 也 使原 生 質(zhì) 體 的 核 、 細(xì) 胞 器 發(fā) 生 融 合 成 為 可 能 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 PEG作 為 融 合 劑 的 優(yōu) 點(diǎn) : 異 核 體 形 成 的 頻

8、率 高 ， 可 重 復(fù) 性 強(qiáng) ， 對(duì)大 多 數(shù) 細(xì) 胞 低 毒 ； 形 成 雙 核 異 核 體 的 頻 率 高 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 據(jù) Burgess和 Flenming（ 1974年 ） 報(bào) 道 ： 在 37 下 用 高 鈣 離 子 的 強(qiáng) 堿 性 溶 液 處 理 時(shí) ，產(chǎn) 生 的 聚 集 體 很 大 ， 每 個(gè) 包 含 很 大 原 生 質(zhì) 體 。 以 PEG為 融 合 劑 時(shí) ， 多 數(shù) 聚 集 體 包 含 2 3個(gè) 原 生 質(zhì) 體 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG (聚 乙 二 醇 )處 理融 合 基 本 過(guò)

9、程 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 注 意 事 項(xiàng) ： PEG的 分 子 量 （ MW 1500 6000） 酶 溶 液 濃 度 原 生 質(zhì) 體 來(lái) 源 PEG的 稀 釋 逐 步 進(jìn) 行 在 PEG溶 液 中 ， 加 入 鈣 離 子 可 以 提 高 融 合效 率 ） 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 高 溫 （ 35 37 ） 4% 5%（ V/V） 的 原 生 質(zhì) 體 懸 浮 液 所 用 酶 種 類(lèi) 和 濃 度 ， 一 般 用 崩 潰 酶 。 材 料 預(yù) 培 養(yǎng) 融 合 地 點(diǎn) （ 在 離 心 管 中 ， 在

10、小 液 滴 中 ） 在 PEG溶 液 中 的 保 溫 時(shí) 間 太 長(zhǎng) 會(huì) 降 低 異 核體 形 成 頻 率 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.4 電 融 合 將 一 定 密 度 的 原 生 質(zhì) 體 懸 浮 液 置 于 一 個(gè) 融合 小 室 中 ， 小 室 兩 端 有 電 極 ， 在 不 均 勻 的 交變 電 場(chǎng) 的 作 用 下 ， 原 生 質(zhì) 體 彼 此 靠 近 ， 在 兩個(gè) 電 極 間 排 列 成 串 珠 狀 。 這 時(shí) ， 如 果 有 足 夠強(qiáng) 度 的 電 脈 沖 ， 就 可 以 使 質(zhì) 膜 發(fā) 生 可 逆 性 電擊 穿 ， 從 而 導(dǎo) 致 融 合 。 兩 個(gè) 電 極 間 串 珠 狀

11、 原 生 質(zhì) 體 細(xì) 胞 電 融 合 儀 2.3 融 合 產(chǎn) 物 的 細(xì) 胞 學(xué) 在 膜 融 合 以 后 的 數(shù) 小 時(shí) 內(nèi) ， 2個(gè) 細(xì) 胞 的 細(xì) 胞質(zhì) 混 在 一 起 ， 形 成 一 個(gè) 雙 核 異 核 體 。 在 雙 親 親 緣 關(guān) 系 較 近 的 異 核 體 中 ， 兩 個(gè) 核有 可 能 同 步 進(jìn) 行 第 一 次 有 絲 分 裂 ， 而 且 在 這個(gè) 過(guò) 程 中 ， 二 者 的 染 色 體 被 一 個(gè) 共 同 的 紡 錘體 所 牽 引 ， 在 有 絲 分 裂 末 期 形 成 兩 個(gè) 雜 種 子細(xì) 胞 。 最 終 分 化 出 體 細(xì) 胞 雜 種 ， 其 核 內(nèi) 具 有雙 親 的 染

12、色 體 組 。 2.3 融 合 產(chǎn) 物 的 細(xì) 胞 學(xué) 在 雙 親 親 緣 關(guān) 系 比 較 遠(yuǎn) 的 雜 種 細(xì) 胞 中 ， 兩個(gè) 來(lái) 源 不 同 的 染 色 體 組 常 常 不 能 完 全 結(jié) 合 在一 起 。 在 動(dòng) 物 體 細(xì) 胞 雜 種 細(xì) 胞 系 中 ， 已 知 雙 親 之一 的 染 色 體 會(huì) 逐 漸 消 除 ， 在 植 物 中 也 看 到 這種 現(xiàn) 象 。 3 雜 種 細(xì) 胞 的 選 擇 系 統(tǒng)3.1 根 據(jù) 物 理 特 性 選 擇3.2 突 變 互 補(bǔ) 選 擇3.3 根 據(jù) 生 長(zhǎng) 和 再 生 能 力 的 差 別 選 擇 3.1 根 據(jù) 物 理 特 性 選 擇3.1.1 根 據(jù)

13、可 見(jiàn) 標(biāo) 志 選 擇 主 要 用 于 非 綠 色 原 生 質(zhì) 體 與 含 有 葉 綠 體 的原 生 質(zhì) 體 的 融 合 。 （ 半 綠 半 白 ）3.1.2 根 據(jù) 熒 光 標(biāo) 記 選 擇 將 2種 原 生 質(zhì) 體 群 體 分 別 用 不 同 的 熒 光 染 料標(biāo) 記 ， 然 后 通 過(guò) 熒 光 顯 微 鏡 鑒 別 異 核 體 。3.1.3 低 密 度 植 板 選 擇 對(duì) 細(xì) 胞 進(jìn) 行 追 蹤 選 擇 。 3.2 突 變 互 補(bǔ) 選 擇3.2.1 隱 性 突 變 互 補(bǔ) 選 擇3.2.2 顯 性 抗 性 互 補(bǔ) 選 擇3.2.3 隱 性 突 變 與 野 生 型 互 補(bǔ) 選 擇3.2.4 顯

14、 -隱 性 雙 突 變 體 選 擇 3.3 根 據(jù) 生 長(zhǎng) 和 再 生 能 力 的 差 別 選 擇3.3.1 根 據(jù) 愈 傷 組 織 生 長(zhǎng) 差 別 選 擇3.3.2 植 株 再 生 能 力 的 差 別 選 擇3.3.3 根 據(jù) 生 長(zhǎng) 和 分 化 對(duì) 培 養(yǎng) 基 要 求 的 差 別 選 擇 3.3 根 據(jù) 生 長(zhǎng) 和 再 生 能 力 的 差 別 選 擇3.3.1 根 據(jù) 愈 傷 組 織 生 長(zhǎng) 差 別 選 擇 在 曼 陀 羅 和 煙 草 種 間 體 細(xì) 胞 雜 交 以 及 在小 麥 和 某 些 其 他 禾 谷 類(lèi) 植 物 屬 間 體 細(xì) 胞 雜 交中 ， 發(fā) 現(xiàn) 雜 種 愈 傷 組 織 表

15、現(xiàn) 生 長(zhǎng) 優(yōu) 勢(shì) 現(xiàn) 象 ，因 此 融 合 處 理 后 只 要 挑 選 生 長(zhǎng) 快 、 長(zhǎng) 的 最 大的 愈 傷 組 織 ， 就 會(huì) 從 中 分 化 出 體 細(xì) 胞 雜 種 。 3.3 根 據(jù) 生 長(zhǎng) 和 再 生 能 力 的 差 別 選 擇3.3.2 植 株 再 生 能 力 的 差 別 選 擇 不 同 來(lái) 源 的 原 生 質(zhì) 體 分 化 再 生 植 株 的 能 力不 同 。 在 體 細(xì) 胞 雜 交 中 ， 只 要 有 一 個(gè) 親 本 的 原 生質(zhì) 體 能 夠 再 生 植 株 ， 融 合 產(chǎn) 生 的 雜 種 細(xì) 胞 就能 再 生 植 株 。 3.3 根 據(jù) 生 長(zhǎng) 和 再 生 能 力 的 差

16、別 選 擇3.3.3 根 據(jù) 生 長(zhǎng) 和 分 化 對(duì) 培 養(yǎng) 基 要 求 的 差 別 選 擇 不 同 來(lái) 源 的 原 生 質(zhì) 體 對(duì) 培 養(yǎng) 基 成 分 和 激 素的 要 求 不 同 。 設(shè) 計(jì) 的 培 養(yǎng) 基 只 有 雜 種 細(xì) 胞 能 夠 生 長(zhǎng) 。 4 胞 質(zhì) 雜 交 和 胞 質(zhì) 雜 種 有 性 雜 交 ， 細(xì) 胞 質(zhì) 基 因 組 來(lái) 源 于 母 本 。 體 細(xì)胞 雜 交 ， 雜 種 有 兩 個(gè) 親 本 的 細(xì) 胞 質(zhì) 基 因 組 。胞 質(zhì) 雜 種 (cybrid): 兩 種 來(lái) 源 不 同 的 核 外 遺 傳 成 分 （ 細(xì) 胞 器 ）與 一 個(gè) 特 定 的 核 基 因 組 結(jié) 合 在

17、 一 起 。核 質(zhì) 雜 種 (nucleo-cytoplasmic hybrid): 一 個(gè) 親 本 的 細(xì) 胞 核 與 另 一 個(gè) 親 本 的 細(xì) 胞質(zhì) 基 因 組 結(jié) 合 。 4 胞 質(zhì) 雜 交 和 胞 質(zhì) 雜 種獲 得 胞 質(zhì) 雜 種 的 方 法 ： 常 先 把 異 種 胞 質(zhì) 供 體 物 種 原 生 質(zhì) 體 的 核 滅活 ， 然 后 再 將 它 與 異 種 胞 質(zhì) 受 體 物 種 的 原 生質(zhì) 體 融 合 。 通 過(guò) 射 線 輻 照 滅 活 胞 質(zhì) 供 體 細(xì) 胞 核 胞 質(zhì) 體 和 原 生 質(zhì) 體 的 融 合 4 胞 質(zhì) 雜 交 和 胞 質(zhì) 雜 種 通 過(guò) 射 線 輻 照 滅 活 胞

18、 質(zhì) 供 體 細(xì) 胞 核 阻 止 沒(méi) 融 合 的 胞 質(zhì) 供 體 細(xì) 胞 的 分 裂 ， 細(xì) 胞核 部 分 或 完 全 失 活 。 阻 止 沒(méi) 融 合 的 受 體 細(xì) 胞 的 分 裂 胞 質(zhì) 體 和 原 生 質(zhì) 體 的 融 合 利 用 細(xì) 胞 質(zhì) 供 體 細(xì) 胞 的 去 核 原 生 質(zhì) 體 與 受 體親 本 的 完 整 原 生 質(zhì) 體 融 合 。 5 體 細(xì) 胞 雜 種 和 胞 質(zhì) 雜 種 的 鑒 定5.1 形 態(tài) 和 育 性 鑒 定5.2 細(xì) 胞 學(xué) 和 分 子 細(xì) 胞 學(xué) 鑒 定5.3 生 化 鑒 定5.4 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 5 體 細(xì) 胞 雜 種 和 胞 質(zhì) 雜 種 的 鑒 定

19、5.1 形 態(tài) 和 育 性 鑒 定 株 型 、 葉 形 、 花 形 ， 莖 、 葉 茸 毛 的 有 無(wú) 或 多 或 少 有 雙 親 的 特 點(diǎn) 育 性 取 決 于 雙 親 親 緣 關(guān) 系 的 遠(yuǎn) 近 ， 雜 種 或是 育 性 很 低 ， 或 是 完 全 不 育 。 5 體 細(xì) 胞 雜 種 和 胞 質(zhì) 雜 種 的 鑒 定 5.2 細(xì) 胞 學(xué) 和 分 子 細(xì) 胞 學(xué) 鑒 定 通 過(guò) 確 定 雜 種 染 色 體 數(shù) 和 染 色 體 形 態(tài) 5 體 細(xì) 胞 雜 種 和 胞 質(zhì) 雜 種 的 鑒 定 5.3 生 化 鑒 定 同 工 酶 譜 分 析 法 ： 將 體 細(xì) 胞 雜 種 的 同 工 酶 譜 與 其

20、 雙 親 的 酶 譜比 較 ： 雜 種 植 株 的 酶 譜 可 能 是 雙 親 酶 譜 帶 的 總 和 可 能 只 出 現(xiàn) 雙 親 的 部 分 酶 帶 或 缺 少 雙 親 的 某 些 酶 譜 而 出 現(xiàn) 新 的 譜 帶 。 5 體 細(xì) 胞 雜 種 和 胞 質(zhì) 雜 種 的 鑒 定 5.4 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 RAPD (Random amplified polymorphic DNA， 隨 機(jī) 擴(kuò) 增 多 態(tài) 性 DNA) AFLP ( Amplified fragment length polymorphism， 擴(kuò) 增 片 段 長(zhǎng) 度 多 態(tài) 性 ) SRAP(sequence-re

21、lated amplified polymorphism,序 列 相 關(guān) 擴(kuò) 增 多 態(tài) 性 ) SSR （ Simple sequence repeat， 簡(jiǎn) 單 序 列 重 復(fù) ） 6 體 細(xì) 胞 雜 種 在 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 上 的 應(yīng) 用6.1 對(duì) 無(wú) 性 繁 殖 植 物 或 性 不 育 植 物 進(jìn) 行 遺 傳 重 組 對(duì) 2個(gè) 不 能 進(jìn) 行 有 性 繁 殖 的 物 種 之 間 實(shí) 現(xiàn) 遺傳 重 組 ， 體 細(xì) 胞 融 合 目 前 看 來(lái) 是 唯 一 途 徑 。 性 不 育 植 物 （ 單 倍 體 、 三 倍 體 和 非 整 倍體 ） ， 融 合 后 產(chǎn) 生 可 育 的 二 倍 體 或

22、 多 倍 體 。 6 體 細(xì) 胞 雜 種 在 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 上 的 應(yīng) 用 6.2 克 服 有 性 不 親 和 性 障 礙 由 于 存 在 不 親 和 障 礙 ， 種 間 或 屬 間 有 性 雜交 雖 能 進(jìn) 行 ， 但 難 以 產(chǎn) 生 雜 種 ， 而 通 過(guò) 體 細(xì) 胞融 合 ， 有 可 能 突 破 有 性 雜 交 的 這 種 局 限 性 。 6 體 細(xì) 胞 雜 種 在 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 上 的 應(yīng) 用6.3 細(xì) 胞 質(zhì) 遺 傳 性 狀 的 轉(zhuǎn) 移 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 （ cms） 性 狀 的 轉(zhuǎn) 移 轉(zhuǎn) 移 由 細(xì) 胞 質(zhì) 基 因 控 制 的 重 要 農(nóng) 藝 性 狀 ，如 光 和 速 率 、 對(duì) 高 溫 和 低 溫 的 耐 性 ， 以 及 抗 病性 和 抗 除 草 劑 特 性 等 。