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1、實驗八 熒光分光光度法測定諾氟沙星片的含量 儀 器 名 稱熒 光 分 光 光 度 計 國 別 廠 家 ： 日 本 島 津 公 司 儀 器 型 號 ： RF-5301PC 一 概 述 什 么 是 熒 光 呢 ？ 當 紫 外 光 照 射 到 某 些 物 質 的 時 候 ，這 些 物 質 會 發(fā) 射 出 各 種 顏 色 和 不 同 強 度 的 可 見 光 ，而 當 紫 外 光 停 止 照 射 時 ， 這 種 光 線 也 隨 之 很 快 地 消失 ， 這 種 光 線 稱 為 熒 光 。 第 一 次 發(fā) 現 熒 光 現 象 的 是16世 紀 西 班 牙 的 內 科 醫(yī) 生 和 植 物 學 家 N.Mon

2、ardes,提出 到 在 含 有 一 種 稱 為 “ Lignum Nephriticum” 的 木頭 切 片 的 水 溶 液 中 ， 呈 現 了 極 為 可 愛 的 天 藍 色 。 直 到 1852年 Stokes在 考 察 奎 寧 和 葉 綠 素 的熒 光 時 ， 用 分 光 計 觀 察 到 其 熒 光 的 波 長 比入 射 光 的 波 長 稍 長 些 ， 才 判 明 這 種 現 象 是這 些 物 質 在 吸 收 光 能 后 重 新 發(fā) 射 不 同 波 長的 光 ， 而 不 是 由 光 的 漫 射 作 用 所 引 起 的 ，從 而 導 入 了 熒 光 是 光 發(fā) 射 的 概 念 。 到 1

3、9世紀 末 人 們 已 經 知 道 了 包 括 熒 光 素 、 曙 紅 、多 環(huán) 芳 烴 等 600種 以 上 的 熒 光 物 質 。 20世 紀 以 來 ， 熒 光 現 象 被 研 究 得 更 多 了 ，發(fā) 現 了 共 振 熒 光 、 增 感 熒 光 ， 能 夠 進 行 熒 光 產率 得 絕 對 測 定 ， 還 進 行 了 熒 光 壽 命 的 直 接 測 定等 等 。 熒 光 分 析 方 法 的 發(fā) 展 ， 與 儀 器 應 用 是 分 不開 的 。 19世 紀 以 前 ， 熒 光 的 觀 察 是 靠 肉 眼 進 行的 ， 直 到 1928年 ， 才 由 Jette 和 West提 出 了 第

4、一 臺 光 電 熒 光 計 。 1948年 由 Studer推 出 了 第 一臺 自 動 光 譜 校 正 裝 置 ， 到 1952年 才 出 現 商 品 化的 校 正 光 譜 儀 器 。 近 幾 十 年 來 ， 在 其 它 學 科 迅 速 發(fā) 展 的 影 響下 ， 隨 著 激 光 、 微 處 理 機 和 電 子 學 的 新 成 就 等一 些 新 的 科 學 技 術 的 引 入 ， 大 大 推 動 了 熒 光 分析 方 法 在 理 論 方 面 的 進 展 ， 并 且 相 應 地 加 速 了各 式 各 樣 新 型 熒 光 分 析 儀 器 的 問 世 ， 使 熒 光 分析 法 不 斷 朝 著 高 效

5、 、 痕 量 、 微 觀 和 自 動 化 的 方向 發(fā) 展 ， 方 法 的 靈 敏 度 、 準 確 度 和 選 擇 性 日 益提 高 ， 方 法 的 應 用 范 圍 很 寬 ， 包 括 工 業(yè) 、 農 業(yè) 、醫(yī) 藥 衛(wèi) 生 、 環(huán) 境 保 護 、 公 安 情 報 和 科 學 研 究 等各 個 領 域 中 。 如 今 ， 熒 光 分 析 法 已 發(fā) 展 為 一 種重 要 且 有 效 的 光 譜 化 學 分 析 手 段 。 工 作 原 理 熒 光 分 光 光 度 計 基 本 結 構 和 原 理 圖 由 光 源 氙 弧 燈 發(fā) 出 的 光 通 過 切 光 器 使 其 變 成斷 續(xù) 之 光 以 及 激

6、 發(fā) 光 單 色 器 變 成 單 色 光 后 ， 此 光即 為 熒 光 物 質 的 激 發(fā) 光 ， 被 測 的 熒 光 物 質 在 激 發(fā)光 照 射 下 所 發(fā) 出 的 熒 光 ， 經 過 單 色 器 變 成 單 色 熒光 后 照 射 于 測 樣 品 用 的 光 電 倍 增 管 上 ， 由 其 所 發(fā)生 的 光 電 流 經 過 放 大 器 放 大 輸 至 記 錄 儀 ， 激 發(fā) 光單 色 器 和 熒 光 單 色 器 的 光 柵 均 由 電 動 機 帶 動 的 凸輪 所 控 制 ， 當 測 繪 熒 光 發(fā) 射 光 譜 時 ， 將 激 發(fā) 光 單 色 器 的 光 柵 ， 固 定 在 最 適 當 的

7、激 發(fā) 光 波 長 處 ， 而 讓 熒 光 單 色 器 凸 輪 轉 動 ，將 各 波 長 的 熒 光 強 度 訊 號 輸 出 至 記 錄 儀 上 ，所 記 錄 的 光 譜 即 發(fā) 射 光 譜 （ emission spectrum） ,簡 稱 熒 光 光 譜 。 當 測 繪 熒 光 激 發(fā) 光 譜 時 ， 將 熒 光 單 色器 的 光 柵 固 定 在 最 適 當 的 熒 光 波 長 處 ， 只讓 激 發(fā) 光 單 色 口 的 凸 輪 轉 動 ， 將 各 波 長 的激 發(fā) 光 的 強 度 訊 號 輸 出 至 記 錄 儀 ， 所 記 錄的 光 譜 即 激 發(fā) 光 譜 (excitation spec

8、trum） 。 下 圖 為 諾 氟 沙 星 的 激 發(fā) 光 譜 (A)和 發(fā) 射 光 譜 (B) 當 進 行 樣 品 溶 液 的 定 量 分 析 時 ， 將 激發(fā) 光 單 色 器 固 定 在 所 選 擇 的 激 發(fā) 光 波 長 處 ，將 熒 光 單 色 器 固 定 至 所 選 擇 的 熒 光 波 長 處 ，由 記 錄 儀 得 出 的 信 號 是 樣 品 溶 液 的 熒 光 強度 。 一 、 實 驗 目 的1、 掌 握 熒 光 光 度 法 的 基 本 原 理 ；2、 了 解 熒 光 分 光 光 度 計 的 基 本 操 作 。 二 、 實 驗 原 理 按 照 受 激 方 法 的 不 同 ， 分 子

9、 發(fā) 光 可 分為 不 同 類 型 。 如 果 分 子 因 吸 收 外 來 輻 射 的光 子 能 量 而 被 激 發(fā) ， 所 產 生 的 發(fā) 光 現 象 稱為 光 致 發(fā) 光 ； 如 果 分 子 的 激 發(fā) 能 量 是 由 反應 的 化 學 能 或 由 生 物 體 釋 放 出 的 能 量 所 提供 ， 其 發(fā) 光 現 象 分 別 稱 為 化 學 發(fā) 光 和 生 物發(fā) 光 。 通 俗 地 講 ， 當 紫 外 光 或 可 見 光 照 射 某 些 物質 時 ， 這 些 物 質 會 發(fā) 射 出 各 種 顏 色 和 不 同強 度 的 波 長 更 長 的 可 見 光 ， 而 當 紫 外 光 停止 照 射

10、時 ， 這 種 光 線 也 隨 之 很 快 地 消 失 ，這 種 光 線 稱 為 熒 光 。 按 分 子 激 發(fā) 態(tài) 的 類 型來 劃 分 時 ， 由 第 一 電 子 激 發(fā) 單 重 態(tài) 的 產 生的 輻 射 躍 遷 而 伴 隨 的 發(fā) 光 現 象 稱 為 熒 光 ，而 由 最 低 的 電 子 激 發(fā) 三 重 態(tài) 所 產 生 的 輻 射躍 遷 ， 其 發(fā) 光 現 象 稱 為 磷 光 ， 如 圖 所 示 。 熒 光 是 物 質 在 吸 光 之 后 發(fā) 射 出 的 波 長較 長 的 輻 射 ， 因 此 ， 溶 液 的 熒 光 強 度 (F)與 該 溶 液 的 吸 光 程 度 及 溶 液 中 熒 光

11、 物 質 的熒 光 量 子 產 率 有 關 。 熒 光 定 量 分 析 基 于 下式 公 式 ： F=2.303IO bC=kC 式 中 :F為 熒 光 強 度 , Io為 入 射 光 強 度 ， 為 物 質 的 熒 光 量 子 產 率 ， 為 摩 爾 吸 光 系數 ， b為 光 程 ， C為 熒 光 物 質 的 濃 度 。 以 F-C或 logF-logC作 圖 ， 即 得 標 準 曲 線 。 樣 品測 其 F值 后 ， 根 據 標 準 曲 線 查 得 相 應 濃 度 ，即 可 計 算 出 含 量 。 三 、 試 劑1.諾 氟 沙 星 標 準 溶 液 的 配 制2.各 種 不 同 pH緩 沖

12、 溶 液 的 配 制 四 、 實 驗 步 驟1、 掃 描 諾 氟 沙 星 的 激 發(fā) 光 譜 和 發(fā) 射 光 譜2、 酸 度 對 諾 氟 沙 星 熒 光 強 度 影 響 的 測 定3、 諾 氟 沙 星 標 準 曲 線 的 測 定4、 諾 氟 沙 星 藥 片 的 測 定 五 、 數 據 處 理 1.以 F值 對 pH作 圖 ， 繪 制 出 pH影 響 曲 線 ；2.以 F值 對 g值 作 圖 ， 繪 制 出 標 準 曲 線 ；3.計 算 出 藥 片 中 諾 氟 沙 星 含 量 。 六 、 思 考 題1、 熒 光 強 度 測 量 與 吸 光 度 測 量 有 何 不 同 ？為 什 么 ？2、 物 質 的 熒 光 強 度 與 哪 些 因 素 有 關 ？