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1、 第一章第一章緒緒論論n教學(xué)重點(diǎn)教學(xué)重點(diǎn):酶工程的概念、固定化酶活性測定、酶工程的概念、固定化酶活性測定、酶的生產(chǎn)方法。酶的生產(chǎn)方法。n講授要點(diǎn)：講授要點(diǎn)：1、酶工程概念、酶工程概念2、酶工程發(fā)展概況、酶工程發(fā)展概況3、酶的基本知識（復(fù)習(xí)）、酶的基本知識（復(fù)習(xí)）4、酶的生產(chǎn)方法、酶的生產(chǎn)方法一、一、酶工程酶工程(enzymeengineering)概念概念n酶是具有生物催化功能的生物大分子。酶是具有生物催化功能的生物大分子。n酶酶工工程程又又稱稱酶酶技技術(shù)術(shù)，是是圍圍繞繞著著酶酶所所特特有有的的生生物物催催化化性性能能使使其其在在工工農(nóng)農(nóng)業(yè)業(yè)、醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)和和其其他他方方面面發(fā)發(fā)揮揮作作用用的的應(yīng)

2、應(yīng)用用技技術(shù)術(shù)，是是酶酶學(xué)學(xué)基基本本原原理理與與化化學(xué)學(xué)工工程程技技術(shù)術(shù)、基基因因重重組組技技術(shù)術(shù)及及微微生生物物學(xué)學(xué)技技術(shù)術(shù)有有機(jī)機(jī)結(jié)結(jié)合合的產(chǎn)物的產(chǎn)物。第一節(jié)第一節(jié)酶工程概念、研究內(nèi)容和主要任務(wù)酶工程概念、研究內(nèi)容和主要任務(wù)二、二、酶工程的主要內(nèi)容包括：酶工程的主要內(nèi)容包括：1、酶的生產(chǎn)和分離純化；、酶的生產(chǎn)和分離純化；2、酶分子改造與化學(xué)修飾、遺傳修飾、酶分子改造與化學(xué)修飾、遺傳修飾；3、酶、細(xì)胞和原生質(zhì)體固定化；、酶、細(xì)胞和原生質(zhì)體固定化；4、酶反應(yīng)器；、酶反應(yīng)器；5、酶的非水相催化；、酶的非水相催化；6、核酸酶、抗體酶的研究、核酸酶、抗體酶的研究7、模模擬擬酶酶、合合成成酶酶以以及及

3、酶酶分分子子的的人人工工設(shè)設(shè)計計、合合成成的研究的研究8、酶的應(yīng)用。、酶的應(yīng)用。三、酶工程的主要任務(wù)三、酶工程的主要任務(wù)通通過過預(yù)預(yù)先先設(shè)設(shè)計計，經(jīng)經(jīng)過過人人工工操操作作控控制制而而大大量量所所需需的的酶酶，并并通通過過各各種種方方法法使使酶酶發(fā)發(fā)揮揮其其最最大大的的催化功能。催化功能。對酶及生物催化劑的認(rèn)識的發(fā)展對酶及生物催化劑的認(rèn)識的發(fā)展生物催化劑生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質(zhì)類：蛋白質(zhì)類：天然酶（天然酶（Enzyme）極端酶（極端酶（extremozyme）抗體酶抗體酶（abzyme）生物工程生物工程酶酶核酸類：核酸類：Ribozyme模擬生物催化劑模擬生物催化劑 克隆酶克隆

4、酶 遺傳修飾酶遺傳修飾酶 蛋白質(zhì)工程新酶蛋白質(zhì)工程新酶采用生物體生產(chǎn)酶劑是從采用生物體生產(chǎn)酶劑是從19世紀(jì)末開始的。世紀(jì)末開始的。1894年年，日日本本的的高高峰峰讓讓吉吉首首先先從從米米曲曲霉霉中中制制備備得得到到高高峰峰淀淀粉粉酶酶，用用作作消消化化劑劑，開開創(chuàng)創(chuàng)了了近近代代酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的先例。酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的先例。1908年年，德德國國的的羅羅姆姆（Rohm)從從動動物物胰胰臟臟中中制得制得胰酶胰酶，用于皮革的軟化；，用于皮革的軟化；第二節(jié)第二節(jié)酶工程發(fā)展概況酶工程發(fā)展概況1908年，法國的波伊登制備得到年，法國的波伊登制備得到細(xì)菌淀粉酶細(xì)菌淀粉酶，應(yīng)用于紡織品的退漿；應(yīng)用于紡織品的退

5、漿；1911年美國的華勒斯坦制成年美國的華勒斯坦制成木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶，用于，用于除去啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁。此后，酶的生產(chǎn)和除去啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁。此后，酶的生產(chǎn)和應(yīng)用逐步發(fā)展。應(yīng)用逐步發(fā)展。1949年年，用用液液體體深深層層培培養(yǎng)養(yǎng)法法進(jìn)進(jìn)行行細(xì)細(xì)菌菌-淀淀粉粉酶酶的的發(fā)發(fā)酵酵生生產(chǎn)產(chǎn)，揭揭開開了了近近代代酶酶工工業(yè)業(yè)的的序序幕幕。50年年代代以以后后，隨隨著著生生化化工工程程的的發(fā)發(fā)展展，大大多多數(shù)數(shù)酶酶制制劑劑的的生生產(chǎn)已轉(zhuǎn)向微生物液體深層發(fā)酵的方法。產(chǎn)已轉(zhuǎn)向微生物液體深層發(fā)酵的方法。1960年年，法法國國的的雅雅各各和和莫莫諾諾德德提提出出操操縱縱子子學(xué)學(xué)說說，闡闡明明了了酶酶生生物物

6、全全面面的的調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)機(jī)機(jī)制制。使使酶酶的的生生物物合合成成可可以以按按照照人人們們的的意意愿愿加加以以調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)控控制制。通通過過酶酶的誘導(dǎo)和解除阻遏，可以顯著地提高酶的產(chǎn)量。的誘導(dǎo)和解除阻遏，可以顯著地提高酶的產(chǎn)量。20世世紀(jì)紀(jì)80年年代代迅迅速速發(fā)發(fā)展展起起來來的的動動、植植物物細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)技技術(shù)術(shù)。植植物物細(xì)細(xì)胞胞、動動物物細(xì)細(xì)胞胞都都可可以以如如同同微微生生物物細(xì)細(xì)胞胞一一樣樣，在在人人工工控控制制條條件件的的生生物物反反應(yīng)應(yīng)器器中中進(jìn)進(jìn)行行培培養(yǎng)養(yǎng)，通通過過細(xì)細(xì)胞胞的的生生命命活活動動，得得到到人人們們所所需需的的各各種種產(chǎn)產(chǎn)物物，其中包括各種酶。其中包括各種酶。例例如如，通通過過

7、植植物物細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)可可以以獲獲得得超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶、木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶、木木瓜瓜凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶、過過氧氧化化物物酶酶、糖糖苷苷酶酶、糖糖化化酶酶等等。通通過過動動物物細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)可可以以獲獲得得血血纖纖維維蛋白酶原活化劑、膠原酶等。蛋白酶原活化劑、膠原酶等。1953年年，德德國國的的格格魯魯布布霍霍費(fèi)費(fèi)和和施施來來斯斯首首先先將將聚聚氨氨基基苯苯乙乙烯烯樹樹脂脂重重氮氮化化，然然后后將將淀淀粉粉酶酶、胃胃蛋蛋白白酶酶、羧羧肽肽酶酶和和核核糖糖核核酸酸酶酶等等與與上上述述載載體體結(jié)結(jié)合合，制制成成固定化酶。固定化酶。1969年年，日日本本的的千千煙煙一一郎郎首首次次

8、在在工工業(yè)業(yè)上上應(yīng)應(yīng)用用固固定化氨基?；付ɑ被；笍膹腄L-氨基酸生產(chǎn)氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸。氨基酸。學(xué)學(xué)者者們們開開始始用用“酶酶工工程程”這這個個新新名名詞詞來來代代表表有有效效地地利利用用酶酶的的科科學(xué)學(xué)技技術(shù)術(shù)領(lǐng)領(lǐng)域域。1971年年第第一一次次國國際際酶酶工工程程學(xué)學(xué)術(shù)術(shù)會會議議在在美美國國召召開開，當(dāng)當(dāng)時時壓壓倒倒的的主主題題是是固定化酶。固定化酶。此此后后，為為了了省省去去酶酶的的分分離離純純化化過過程程，出出現(xiàn)現(xiàn)了了固固定化菌體定化菌體（固定化死細(xì)胞）技術(shù)。（固定化死細(xì)胞）技術(shù)。1973年年日日本本在在工工業(yè)業(yè)上上成成功功地地利利用用固固定定化化大大腸腸桿桿菌菌菌菌體體中中的

9、的天天門門冬冬氨氨酸酸酶酶，由由反反丁丁烯烯二二酸酸連連續(xù)續(xù)生生產(chǎn)產(chǎn)L-天門冬氨酸。天門冬氨酸?，F(xiàn)現(xiàn)在在已已經(jīng)經(jīng)有有多多種種固固定定化化酶酶用用于于大大規(guī)規(guī)模模工工業(yè)業(yè)化化生生產(chǎn)產(chǎn)。例例如如，利利用用固固定定化化葡葡萄萄糖糖異異構(gòu)構(gòu)酶酶由由葡葡萄萄糖糖生生產(chǎn)產(chǎn)果果葡葡糖糖漿漿；利利用用固固定定化化青青霉霉素素酰酰化化酶酶生生產(chǎn)產(chǎn)半半合合成成青青霉霉素素或或頭頭孢孢霉霉素素；利利用用固固定定化化-半半乳乳糖糖苷苷酶酶生產(chǎn)低乳糖奶等。生產(chǎn)低乳糖奶等。在在此此基基礎(chǔ)礎(chǔ)上上，70年年代代后后期期，出出現(xiàn)現(xiàn)了了固固定定化化細(xì)細(xì)胞胞（又又稱稱固固定定化化活活細(xì)細(xì)胞胞或或固固定定化化增增殖殖細(xì)細(xì)胞胞）技技術(shù)

10、術(shù)。固固定定化化細(xì)細(xì)胞胞是是指指固固定定在在載載體體上上，在在一一定定的的空空間間范范圍圍內(nèi)內(nèi)進(jìn)進(jìn)行行生生命命活活動動（包包括括生生長長、增增殖殖、新新陳陳代代謝謝）的的細(xì)細(xì)胞胞，可可以以反反復(fù)復(fù)或或連連續(xù)續(xù)使使用用在在發(fā)發(fā)酵生產(chǎn)上。酵生產(chǎn)上。1978年年，日日本本的的鈴鈴木木等等人人用用固固定定化化細(xì)細(xì)胞胞生生產(chǎn)產(chǎn)淀淀粉粉酶酶研研究究成成功功。此此后后用用固固定定化化細(xì)細(xì)胞胞生生產(chǎn)產(chǎn)蛋蛋白白酶酶、糖糖化化酶酶、溶溶菌菌酶酶、天天冬冬酰酰胺胺酶酶、果果膠膠酶酶等等的的研研究究蓬蓬勃勃展展開開。然然而而，固固定定化化細(xì)細(xì)胞胞只只能能用用于于生生產(chǎn)產(chǎn)胞胞外外酶酶等等容容易易分分泌泌到到細(xì)細(xì)胞胞外外

11、的的產(chǎn)產(chǎn)物物。對對于于胞胞內(nèi)內(nèi)酶酶及及其其他他胞胞內(nèi)內(nèi)產(chǎn)產(chǎn)物物的的生生產(chǎn)產(chǎn)必必須須采采用用8080年年代代中中期期才才發(fā)發(fā)展展起起來來的的固定化原生質(zhì)體技術(shù)。固定化原生質(zhì)體技術(shù)。19861986年年開開始始，華華南南理理工工大大學(xué)學(xué)生生物物工工程程研研究究所所用用固固定定化化原原生生質(zhì)質(zhì)體體發(fā)發(fā)酵酵生生產(chǎn)產(chǎn)堿堿性性磷磷酸酸酶酶、葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶、谷谷氨氨酸酸脫脫氫氫酶酶等等的的研研究究相相繼繼取取得得成成功功，為為胞胞內(nèi)內(nèi)酶的連續(xù)生產(chǎn)開辟了嶄新的途徑。酶的連續(xù)生產(chǎn)開辟了嶄新的途徑。20世世紀(jì)紀(jì)80年年代代以以來來，酶酶分分子子修修飾飾技技術(shù)術(shù)發(fā)發(fā)展展很很快快，修修飾飾的的方方法法主主要

12、要有有：酶酶分分子子主主鏈鏈修修飾飾，酶酶分分子子側(cè)側(cè)鏈鏈基基團(tuán)團(tuán)修修飾飾，酶酶分分子子組組成成單單位位置置換換修修飾飾，酶酶分分子子中中金金屬屬離離子子置置換換修修飾飾和和物物理理修修飾飾等等。通通過過酶酶分分子子修修飾飾，可可以以提提高高酶酶活活力力，增增加加酶酶的的穩(wěn)穩(wěn)定定性性，消消除除或或降降低低酶酶的抗原性等，的抗原性等，尤尤其其是是20世世紀(jì)紀(jì)80年年代代中中期期發(fā)發(fā)展展起起來來的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)工工程程，已已把把酶酶分分子子修修飾飾與與基基因因工工程程技技術(shù)術(shù)結(jié)結(jié)合合在在一一起起。通通過過基基因因定定位位突突變變技技術(shù)術(shù)，可可把把酶酶分分子子修修飾飾后后的的信信息息儲儲存存于于DN

13、A之之中中，經(jīng)經(jīng)過過基基因因克克隆隆和和表表達(dá)達(dá)，就就可可以以通通過過生生物合成的方法獲得具有新的特性和功能的酶。物合成的方法獲得具有新的特性和功能的酶。1984年年，克克利利巴巴諾諾夫夫（Klibanov)等等人人進(jìn)進(jìn)行行了了有有機(jī)機(jī)介介質(zhì)質(zhì)中中酶酶的的催催化化作作用用的的研研究究，發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)脂脂肪肪酶酶在在有有機(jī)機(jī)介介質(zhì)質(zhì)中中不不但但具具有有催催化化活活性性，而而且且還還具具有有很很高高的的穩(wěn)穩(wěn)定定性性。改變了酶只能在水溶液中進(jìn)行催化的傳統(tǒng)概念。改變了酶只能在水溶液中進(jìn)行催化的傳統(tǒng)概念。與與水水溶溶液液中中酶酶的的催催化化相相比比，酶酶在在有有機(jī)機(jī)介介質(zhì)質(zhì)中中的的催催化化具具有有提提高高非非

14、極極性性底底物物或或產(chǎn)產(chǎn)物物的的溶溶解解度度、進(jìn)進(jìn)行行在在水水溶溶液液中中無無法法進(jìn)進(jìn)行行的的合合成成反反應(yīng)應(yīng)、減減少少產(chǎn)產(chǎn)物物對對酶酶的的反反饋饋抑抑制制作作用用、提提高高手手性性化化合合物物不不對對稱稱反反應(yīng)應(yīng)的的對對映映體體選選擇擇性性等等顯著特點(diǎn)。顯著特點(diǎn)。近近2020多多年年來來，在在酶酶和和細(xì)細(xì)胞胞固固定定化化技技術(shù)術(shù)發(fā)發(fā)展展的的同同時時，其其他他的的酶酶分分子子修修飾飾技技術(shù)術(shù)也也不不斷斷發(fā)發(fā)展展。此此外外，核核酶酶、抗抗體體酶酶、酶酶的的化化學(xué)學(xué)合合成成、人人工工模模擬擬，以以及及各各種種酶酶的的應(yīng)應(yīng)用用技技術(shù)術(shù)的的研研究究，使使酶酶工工程程已已經(jīng)經(jīng)成成為為生生物物工工程程的的

15、主主要要內(nèi)內(nèi)容容。今今后后將將不不斷斷地地向向廣廣度度和和深深度度發(fā)展，顯示出廣闊而誘人的前景。發(fā)展，顯示出廣闊而誘人的前景。一、酶作用的特點(diǎn)一、酶作用的特點(diǎn) 極高的催化效率極高的催化效率 高度的專一性高度的專一性 酶酶催化作用的條件溫和催化作用的條件溫和 酶酶活性可調(diào)控活性可調(diào)控 有的酶需輔助因子有的酶需輔助因子第三節(jié)第三節(jié)酶的基本知識酶的基本知識（一）、酶的專一性（一）、酶的專一性酶酶催催化化作作用用的的專專一一性性是是酶酶是是最最重重要要的的特特性性之之一一，是酶與其他非酶催化劑的最主要的不同之處。是酶與其他非酶催化劑的最主要的不同之處。酶酶的的專專一一性性是是指指一一種種酶酶只只能能催

16、催化化一一種種或或一一類類結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)相似的底物進(jìn)行某種類型的反應(yīng)。相似的底物進(jìn)行某種類型的反應(yīng)。酶酶的的專專一一性性可可以以按按其其嚴(yán)嚴(yán)格格程程度度的的不不同同，分分為為下下列列兩大類兩大類：1、結(jié)構(gòu)專一性、結(jié)構(gòu)專一性 概概念念：酶酶對對所所催催化化的的分分子子（底底物物，Substrate）化化學(xué)結(jié)構(gòu)的特殊要求和選擇學(xué)結(jié)構(gòu)的特殊要求和選擇類別類別：絕對專一性絕對專一性和和相對專一性相對專一性2、立體異構(gòu)專一性、立體異構(gòu)專一性概概念念：酶酶除除了了對對底底物物分分子子的的化化學(xué)學(xué)結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)有有要要求求外外，對其立體異構(gòu)也有一定的要求對其立體異構(gòu)也有一定的要求類別類別：旋光異構(gòu)專一性旋光異構(gòu)專一性和

17、和幾何異構(gòu)專一性幾何異構(gòu)專一性絕對專一性和相對專一性絕對專一性和相對專一性 絕對專一性絕對專一性 有的酶對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)要求非常有的酶對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)要求非常嚴(yán)格，只作用于一種底物，不作用于其它任何物質(zhì)。嚴(yán)格，只作用于一種底物，不作用于其它任何物質(zhì)。相對專一性相對專一性有的酶對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)要求比有的酶對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)要求比上述絕對專一性略低一些，它們能作用于一類化合上述絕對專一性略低一些，它們能作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵。物或一種化學(xué)鍵。1）鍵專一性鍵專一性有的酶只作用于一定的鍵，而對有的酶只作用于一定的鍵，而對鍵鍵兩端的基團(tuán)并無嚴(yán)格要求。兩端的基團(tuán)并無嚴(yán)格要求。2）基團(tuán)專一性基團(tuán)專一性另

18、一些酶，除要求作用于一定另一些酶，除要求作用于一定的鍵以外，對鍵兩端的基團(tuán)還有一定要求，往往的鍵以外，對鍵兩端的基團(tuán)還有一定要求，往往是對其中一個基團(tuán)要求嚴(yán)格，對另一個基團(tuán)則要是對其中一個基團(tuán)要求嚴(yán)格，對另一個基團(tuán)則要求不嚴(yán)格。求不嚴(yán)格。鎖鎖鑰鑰學(xué)學(xué)說說：將將酶酶的的活活性性中中心心比比喻喻作作鎖鎖孔孔，底底物物分分子子象鑰匙，底物能專一性地插入到酶的活性中心。象鑰匙，底物能專一性地插入到酶的活性中心。誘誘導(dǎo)導(dǎo)契契合合學(xué)學(xué)說說：酶酶的的活活性性中中心心在在結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)上上具具柔柔性性，底底物物接接近近活活性性中中心心時時，可可誘誘導(dǎo)導(dǎo)酶酶蛋蛋白白構(gòu)構(gòu)象象發(fā)發(fā)生生變變化化，這這樣樣就就使使使使酶酶活

19、活性性中中心心有有關(guān)關(guān)基基團(tuán)團(tuán)正正確確排排列列和和定定向向，使使之之與底物成互補(bǔ)形狀有機(jī)的結(jié)合而催化反應(yīng)進(jìn)行。與底物成互補(bǔ)形狀有機(jī)的結(jié)合而催化反應(yīng)進(jìn)行。3、有關(guān)酶專一性的學(xué)說、有關(guān)酶專一性的學(xué)說酶專一性的酶專一性的“鎖鑰學(xué)說鎖鑰學(xué)說”酶專一性的酶專一性的“誘導(dǎo)契合學(xué)說誘導(dǎo)契合學(xué)說”4、酶的專一性的確定酶的專一性的確定確定某種酶的專一性有好幾個步驟。確定某種酶的專一性有好幾個步驟。（1）首首先先要要選選擇擇一一種種酶酶可可催催化化的的物物質(zhì)質(zhì)作作為為該該酶酶的的作作用用底底物物，通通過過試試驗(yàn)驗(yàn)確確定定其其最最適適的的pH值值、溫溫度度等等反反應(yīng)應(yīng)條件；條件；（2）其其次次是是試試驗(yàn)驗(yàn)底底物物濃

20、濃度度對對反反應(yīng)應(yīng)速速度度的的影影響響，確確定定其米氏常數(shù)其米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度；和最大反應(yīng)速度；（3）然然后后用用其其他他有有可可能能是是該該酶酶作作用用底底物物的的物物質(zhì)質(zhì)，在在相相同同的的條條件件下下逐逐個個進(jìn)進(jìn)行行試試驗(yàn)驗(yàn)，有有時時要要在在不不同同的的條條件件下下逐逐個個試試驗(yàn)驗(yàn)，觀觀察察是是否否有有催催化化反反應(yīng)應(yīng)發(fā)發(fā)生生，從從而而確確定定該該酶是屬于絕對專一性還是相對專一性。酶是屬于絕對專一性還是相對專一性。（4）對對于于相相對對專專一一性性的的酶酶，可可作作用用于于一一類類物物質(zhì)質(zhì)。可可以以選選擇擇幾幾種種有有代代表表性性的的底底物物，求求出出各各自自的的Km值值。在在某某

21、些些情情況況下下，不不同同的的底底物物有有不不同同的的最最適適pH值值，而而pH值值對對Km有有一一定定的的影影響響。此此時時必必須須作作出出不不同同底底物物各各自自的的pH曲曲線線。然然后后再再在在各各自自的的最最適適pH值值條條件件下下進(jìn)行試驗(yàn)，以確定各底物相應(yīng)的進(jìn)行試驗(yàn)，以確定各底物相應(yīng)的Km值。值。（5）在在進(jìn)進(jìn)行行酶酶的的專專一一性性試試驗(yàn)驗(yàn)時時，所所使使用用的的酶酶和和各各種種底底物物都都要要盡盡可可能能地地純純。對對于于有有不不對對稱稱碳碳原原子子的的物物質(zhì)，應(yīng)分別對不同的光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行試驗(yàn)。質(zhì)，應(yīng)分別對不同的光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行試驗(yàn)。（二）酶具有很高的二）酶具有很高的催化效率催化效率

22、 酶的催化效率可比一般催化劑高酶的催化效率可比一般催化劑高10106 610102020倍。倍。如：如：H H2 2O O2 2 H H2 2O+OO+O2 2 H H2 2O O2 2酶為酶為 5 510106 6 mol mol ；Fe Fe2+2+為為6 61010-4-4 molmol（三）反應(yīng)條件溫和，酶易三）反應(yīng)條件溫和，酶易變性失活變性失活（四）體內(nèi)酶活性是受（四）體內(nèi)酶活性是受調(diào)控調(diào)控的的（五）酶的催化活性與輔基、輔酶和金屬離子（五）酶的催化活性與輔基、輔酶和金屬離子有關(guān)有關(guān)E+SP+EES能能量量水水平平反應(yīng)過程反應(yīng)過程 G E1 E2酶（酶（E）與底物（與底物（S）結(jié)合生成

23、不穩(wěn)定的中間結(jié)合生成不穩(wěn)定的中間物（物（ES），），再分解成產(chǎn)再分解成產(chǎn)物（物（P）并釋放出酶，使并釋放出酶，使反應(yīng)沿一個低活化能的反應(yīng)沿一個低活化能的途徑進(jìn)行，降低反應(yīng)所途徑進(jìn)行，降低反應(yīng)所需活化能，所以能加快需活化能，所以能加快反應(yīng)速度。反應(yīng)速度。酶催化的中間產(chǎn)物理論酶催化的中間產(chǎn)物理論 二、酶催化機(jī)理二、酶催化機(jī)理1、鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)、鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng) 鄰鄰近近效效應(yīng)應(yīng)(proximity effect)是是指指在在酶酶促促反反應(yīng)應(yīng)中中，底底物物分分子子結(jié)結(jié)合合到到酶酶的的活活性性中中心心，底底物物在在酶酶活活性性中中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應(yīng)速度；心的有效濃度大大增加，有

24、利于提高反應(yīng)速度；定定向向效效應(yīng)應(yīng)(orientation effect)是是指指酶酶的的活活性性中中心心的的立立體體結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)和和相相關(guān)關(guān)基基團(tuán)團(tuán)的的誘誘導(dǎo)導(dǎo)和和定定向向作作用用，使使底底物物分分子子中中參參與與反反應(yīng)應(yīng)的的基基團(tuán)團(tuán)相相互互接接近近，并并被被嚴(yán)嚴(yán)格格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點(diǎn)。定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點(diǎn)。（二）（二）底物形變底物形變（張力學(xué)說）（張力學(xué)說）酶酶與與底底物物結(jié)結(jié)合合，不不僅僅使使酶酶分分子子構(gòu)構(gòu)象象發(fā)發(fā)生生變變化化，同同時時也也使使底底物物分分子子發(fā)發(fā)生生扭扭曲曲變變形形，稱稱為為應(yīng)應(yīng)變變或或形形變變效效應(yīng)應(yīng)（strain effe

25、ct)。這這是是由由于于酶酶與與底底物物結(jié)結(jié)合合之之后后,一一部部分分結(jié)結(jié)合合能能被被用用來來削削弱弱底底物物分分子子中中的的敏敏感感鍵鍵,產(chǎn)產(chǎn)生生鍵鍵扭扭變變,有有助助于于過過渡渡態(tài)態(tài)的的形形成成,降降低低了了底底物物反應(yīng)的活化能反應(yīng)的活化能,從而使反應(yīng)速度大大加快。從而使反應(yīng)速度大大加快。（三）、共價催化（三）、共價催化 某某些些酶酶分分子子的的催催化化基基團(tuán)團(tuán)可可以以通通過過共共價價鍵鍵與與底底物物分分子子結(jié)結(jié)合合形形成成不不穩(wěn)穩(wěn)定定的的共共價價中中間間產(chǎn)產(chǎn)物物，這這個個中中間間產(chǎn)產(chǎn)物物極極易易變變成成過過渡渡態(tài)態(tài)，因因而而大大大大降降低低了了活活化化能能，使使反反應(yīng)應(yīng)速速度度大大為為提

26、提高高。這這種種催催化化稱稱為為共共價價催催化化（covalent catalysis)。1、親親核核催催化化（nucleophilic catalysis)是是指指酶酶活活性性中中心心的的親親核核催催化化基基團(tuán)團(tuán)提提供供一一對對電電子子，與與底底物物分分子子中中的的缺缺少少電電子子具具有有部部分分正正電電荷荷的的碳碳原原子子形形成成共共價價鍵鍵，從從而而產(chǎn)產(chǎn)生生不不穩(wěn)穩(wěn)定的共價中間物。定的共價中間物。酶分子中可作為親核基團(tuán)酶分子中可作為親核基團(tuán)2、親親電電子子催催化化 是是指指酶酶活活性性中中心心上上的的親親電電子子催催化化基基團(tuán)團(tuán)從從底底物物分分子子的的親親核核原原子子上上爭爭奪奪一一對對

27、電電子子，形形成成共共價價鍵鍵，從從而而產(chǎn)產(chǎn)生生不不穩(wěn)穩(wěn)定定的的共共價價中間物。中間物。（四）、酸堿催化（四）、酸堿催化 在在酶酶活活性性中中心心上上，有有些些催催化化基基團(tuán)團(tuán)是是酸酸催催化化基基團(tuán)團(tuán)向向底底物物分分子子提提供供質(zhì)質(zhì)子子；有有些些催催化化基基團(tuán)團(tuán)是是堿堿催催化化基基團(tuán)團(tuán)從從底底物物分分子子接接受受質(zhì)質(zhì)子子。當(dāng)當(dāng)酸酸催催化化基基團(tuán)團(tuán)和和堿堿催催化化基基團(tuán)團(tuán)共共同同發(fā)發(fā)揮揮作作用用時時，可可以以大大大大提提高高底底物物反反應(yīng)應(yīng)速速度度，這這種種催催化化就就稱稱為為酸酸堿堿催催化化。His咪咪唑唑基基就是許多酶的酸堿催化基團(tuán)。就是許多酶的酸堿催化基團(tuán)。酶分子中可作為酸鹼催化的功能基團(tuán)

28、酶分子中可作為酸鹼催化的功能基團(tuán)（五）活性部位疏水空穴的影響（五）活性部位疏水空穴的影響 已已知知某某些些化化學(xué)學(xué)反反應(yīng)應(yīng)，在在非非極極性性（低低介介電電常常數(shù)數(shù)）的的介介質(zhì)質(zhì)中中，其其反反應(yīng)應(yīng)速速度度比比在在極極性性（高高介介電電常常數(shù)數(shù)）介介質(zhì)質(zhì)中中快快得得多多。酶酶分分子子的的活活性性中中心心是是位位于于非非極極性性的的空空穴穴中中的的，因因此此，非非極極性性的空穴有利于提高酶促底物反應(yīng)速度。的空穴有利于提高酶促底物反應(yīng)速度。與酶的高效率有關(guān)的主要因素與酶的高效率有關(guān)的主要因素“鄰近鄰近”和定向效應(yīng)和定向效應(yīng)張力學(xué)說張力學(xué)說共價催化共價催化酸堿催化酸堿催化微環(huán)境影響微環(huán)境影響三、影響酶催

29、化作用的因素三、影響酶催化作用的因素（一）底物濃度與酶反應(yīng)速度的關(guān)系（一）底物濃度與酶反應(yīng)速度的關(guān)系nMichaelisMichaelis&MentenMenten 于于19131913年年推推導(dǎo)導(dǎo)出出了了上上述述矩矩形形雙雙曲曲線線的的數(shù)數(shù)學(xué)學(xué)表表達(dá)達(dá)式式，即著名的即著名的米氏方程米氏方程。Vmax 米氏常數(shù)的意義米氏常數(shù)的意義 （1 1）當(dāng)當(dāng)=V=Vmaxmax/2/2時，時，K Km m=S=S。因此，因此，K Km m等于酶等于酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值一半時的底物濃度。促反應(yīng)速度達(dá)最大值一半時的底物濃度。（2 2）K Km m可以反映酶與底物親和力的大小可以反映酶與底物親和力的大小K Km

30、 m越小，酶與底物的親和力越大。越小，酶與底物的親和力越大。（3 3）可可用用于于判判斷斷反反應(yīng)應(yīng)級級數(shù)數(shù)：當(dāng)當(dāng) S0.01KS100KS100Km m時時，=V Vmaxmax，反反應(yīng)為零級反應(yīng)應(yīng)為零級反應(yīng).（4 4）.K Km m是是酶酶的的特特征征性性常常數(shù)數(shù)：在在一一定定條條件件下下，某某種種酶酶的的K Km m值值是是恒恒定定的的，因因而而可可以以通通過過測測定定不不同同酶酶（特特別別是是一一組組同同工工酶酶）的的K Km m值值，來來判判斷斷是是否否為不同的酶。為不同的酶。（5 5）.K Km m可可用用來來判判斷斷酶酶的的最最適適底底物物：當(dāng)當(dāng)酶酶有有幾幾種種不不同同的的底底物物

31、存存在在時時，通通過過測測定定酶酶在在不不同同底底物物存存在在時時的的K Km m值值，K Km m值值最最小小者者，即即為為該該酶酶的的最最適適底底物。物。（二）、抑制劑對反應(yīng)速度的影響（二）、抑制劑對反應(yīng)速度的影響n 凡凡是是能能降降低低酶酶促促反反應(yīng)應(yīng)速速度度，但但不不引引起起酶酶分分子子變變 性性 失失 活活 的的 物物 質(zhì)質(zhì) 統(tǒng)統(tǒng) 稱稱 為為 酶酶 的的 抑抑 制制 劑劑(inhibitor)inhibitor)。n 按按照照抑抑制制劑劑的的抑抑制制作作用用，可可將將其其分分為為不不可可逆逆抑抑制制作作用用(irreversible irreversible inhibition)i

32、nhibition)和和可可逆逆抑制作用抑制作用(reversible inhibition)reversible inhibition)兩大類。兩大類。1、可逆抑制作用、可逆抑制作用：n 抑抑制制劑劑以以非非共共價價鍵鍵與與酶酶分分子子可可逆逆性性結(jié)結(jié)合合造造成成酶酶活活性性的的抑抑制制，且且可可采采用用透透析析等等簡簡單單方方法法去去除除抑抑制制劑劑而而使使酶酶活活性性完完全全恢恢復(fù)復(fù)的的抑抑制制作作用用就就是是可可逆抑制作用。逆抑制作用。n 可可逆逆抑抑制制作作用用包包括括競競爭爭性性和和非非競競爭爭性性抑抑制制兩兩種類型。種類型。競競爭爭性性抑抑制制的的速速度度方方程程與與圖圖形形特特

33、征征競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征n 競爭性抑制的特點(diǎn)競爭性抑制的特點(diǎn)：競爭性抑制劑往往是酶的競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物底物類似物或反應(yīng)產(chǎn)物；或反應(yīng)產(chǎn)物；抑抑制制劑劑與與酶酶的的結(jié)結(jié)合合部部位位與與底底物物與與酶酶的的結(jié)結(jié)合合部部位位相相同；同；抑抑制制劑劑濃濃度度越越大大，則則抑抑制制作作用用越越大大；但但增增加加底底物物濃度可使抑制程度減?。粷舛瓤墒挂种瞥潭葴p小；動力學(xué)參數(shù)：動力學(xué)參數(shù)：KmKm值增大，值增大，VmVm值不變值不變。非競爭性抑制作用非競爭性抑制作用：n抑抑制制劑劑既既可可以以與與游游離離酶酶結(jié)結(jié)合合，也也可可以以與與ESES復(fù)復(fù)合合物物結(jié)結(jié)合合，

34、使使酶酶的的催催化化活活性性降降低低，稱稱為為非非競競爭性抑制。爭性抑制。非非競競爭爭性性抑抑制制的的速速度度方方程程與與圖圖形形特特征征非競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征非競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征n非競爭性抑制的特點(diǎn)：非競爭性抑制的特點(diǎn)：非非競競爭爭性性抑抑制制劑劑的的化化學(xué)學(xué)結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)不不一一定定與與底底物物的的分子結(jié)構(gòu)類似；分子結(jié)構(gòu)類似；底底物物和和抑抑制制劑劑分分別別獨(dú)獨(dú)立立地地與與酶酶的的不不同同部部位位相相結(jié)合；結(jié)合；抑抑制制劑劑對對酶酶與與底底物物的的結(jié)結(jié)合合無無影影響響，故故底底物物濃濃度的改變對抑制程度無影響；度的改變對抑制程度無影響；動力學(xué)參數(shù)：動力學(xué)參數(shù)：KmKm值不變，值不變

35、，VmVm值降低值降低。競爭性抑制作用競爭性抑制作用非競爭性抑制作用非競爭性抑制作用競競爭爭性性非非競競爭爭性性抑抑制制作作用用機(jī)機(jī)理理示示意意圖圖底物與酶專一性結(jié)合底物與酶專一性結(jié)合2 2、不可逆抑制作用、不可逆抑制作用n 抑抑制制劑劑與與酶酶分分子子的的必必需需基基團(tuán)團(tuán)共共價價結(jié)結(jié)合合引引起起酶酶活活性性的的抑抑制制，且且不不能能采采用用透透析析等等簡簡單單方方法法使使酶酶活活性性恢恢復(fù)的抑制作用就是復(fù)的抑制作用就是不可逆抑制作用。不可逆抑制作用。n 酶酶的的不不可可逆逆抑抑制制作作用用（如如有有機(jī)機(jī)磷磷農(nóng)農(nóng)藥藥對對膽膽堿堿酯酯酶酶的抑制和的抑制和重金屬、碘乙酰胺重金屬、碘乙酰胺對巰基酶的

36、抑制）。對巰基酶的抑制）。專一性不可逆抑制劑專一性不可逆抑制劑 這類抑制劑選擇性很強(qiáng)，它只能專一性地與這類抑制劑選擇性很強(qiáng)，它只能專一性地與酶活性中心的某些基團(tuán)不可逆結(jié)合，引起酶的活酶活性中心的某些基團(tuán)不可逆結(jié)合，引起酶的活性喪失。性喪失。實(shí)例：實(shí)例：有機(jī)磷殺蟲劑有機(jī)磷殺蟲劑-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX非專一性不可逆抑制劑非專一性不可逆抑制劑抑抑制制劑劑作作用用于于酶酶分分子子中中的的一一類類或或幾幾類類基基團(tuán)團(tuán)，這這些些基團(tuán)中包含了必需基團(tuán)，因而引起酶失活。基團(tuán)中包含了必需基團(tuán)，因而引起酶失活。類型類型：（三）、激活劑對反應(yīng)速度的影響（三）、激活劑對反應(yīng)速度的

37、影響n 能能夠夠促促使使酶酶促促反反應(yīng)應(yīng)速速度度加加快快的的物物質(zhì)質(zhì)稱稱為為酶酶的激活劑。的激活劑。n 酶酶的的激激活活劑劑大大多多數(shù)數(shù)是是無無機(jī)機(jī)離離子子，如如K K+、MgMg2+2+、MnMn2+2+、ClCl-等。等。（四）、酶濃度對反應(yīng)速度的影響四）、酶濃度對反應(yīng)速度的影響n當(dāng)當(dāng)反反應(yīng)應(yīng)系系統(tǒng)統(tǒng)中中底底物物的的濃濃度度足足夠夠大大時時，酶酶促促反應(yīng)速度與酶濃度成反應(yīng)速度與酶濃度成正比正比，即，即=kEkE。（五）、溫度對反應(yīng)速度的影響（五）、溫度對反應(yīng)速度的影響n一一般般來來說說，酶酶促促反反應(yīng)應(yīng)速速度度隨隨溫溫度度的的增增高高而而加加快快。但但當(dāng)當(dāng)溫溫度度增增加加達(dá)達(dá)到到某某一一點(diǎn)

38、點(diǎn)后后，由由于于酶酶蛋蛋白白的的熱熱變變性性作作用用，反反應(yīng)應(yīng)速速度度迅迅速速下下降降，直直到到完全失活。完全失活。n 酶酶促促反反應(yīng)應(yīng)速速度度隨隨溫溫度度升升高高而而達(dá)達(dá)到到一一最最大大值值時時的溫度就稱為的溫度就稱為酶的最適溫度酶的最適溫度。溫度對酶促反應(yīng)速度的影響溫度對酶促反應(yīng)速度的影響（六）、溶液（六）、溶液pHpH對反應(yīng)速度的影響對反應(yīng)速度的影響n 觀觀察察pHpH對對酶酶促促反反應(yīng)應(yīng)速速度度的的影影響響，通通常常為為一一“鐘鐘形形”曲曲線線，即即pHpH過過高高或或過過低低均均可可導(dǎo)導(dǎo)致致酶酶催化活性的下降。催化活性的下降。n 酶酶催催化化活活性性最最高高時時溶溶液液的的pHpH值

39、值就就稱稱為為酶酶的的最適最適pHpH。pHpH對酶促反應(yīng)速度的影響對酶促反應(yīng)速度的影響n 人體內(nèi)大多數(shù)酶的最適人體內(nèi)大多數(shù)酶的最適pHpH在在6.56.58.08.0之間。之間。n 酶的最適酶的最適pHpH不是酶的特征性常數(shù)不是酶的特征性常數(shù)。n pHpH對酶促反應(yīng)速度的影響，其原因主要是由對酶促反應(yīng)速度的影響，其原因主要是由于于pHpH的改變導(dǎo)致了酶的催化基團(tuán)以及底物分的改變導(dǎo)致了酶的催化基團(tuán)以及底物分子的解離狀態(tài)改變或者導(dǎo)致了酶蛋白的變性。子的解離狀態(tài)改變或者導(dǎo)致了酶蛋白的變性。四、酶的活力測定四、酶的活力測定在在酶酶的的生生產(chǎn)產(chǎn)及及應(yīng)應(yīng)用用過過程程中中，經(jīng)經(jīng)常常要要進(jìn)進(jìn)行行酶酶的的活活

40、力測定，以確定酶量的多少及其變化情況。力測定，以確定酶量的多少及其變化情況。酶酶活活力力是是指指在在一一定定條條件件下下，酶酶所所催催化化的的反反應(yīng)應(yīng)速速度。反應(yīng)速度越大，意味著酶活力越高。度。反應(yīng)速度越大，意味著酶活力越高。酶催化反應(yīng)速度，用單位時間內(nèi)底物的減少量酶催化反應(yīng)速度，用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量表示。即：或產(chǎn)物的增加量表示。即：V=S/tV=S/t或或P/tP/t1、酶活力測定方法、酶活力測定方法酶酶活活力力測測定定方方法法多多種種多多樣樣?？偪偟牡囊笄笫鞘强炜焖偎?、簡便、準(zhǔn)確。簡便、準(zhǔn)確。酶酶活活力力測測定定均均包包括括兩兩個個階階段段。首首先先要要在在一一定定的

41、的條條件件下下，酶酶與與其其作作用用底底物物反反應(yīng)應(yīng)一一段段時時間間，然然后后再再測測定定反反應(yīng)應(yīng)液液中中底底物物或或產(chǎn)產(chǎn)物物變變化化的的量量。一一般般采采取取如下步驟：如下步驟：（1）根根據(jù)據(jù)酶酶的的專專一一性性，選選擇擇適適宜宜的的底底物物，并并配配制制成一定濃度的底物溶液。成一定濃度的底物溶液。（2）根根據(jù)據(jù)酶酶的的動動力力學(xué)學(xué)性性質(zhì)質(zhì)，確確定定酶酶促促反反應(yīng)應(yīng)的的溫溫度度，pH值、底物濃度、激活劑濃度等值、底物濃度、激活劑濃度等條件條件。（3）在在一一定定條條件件下下，將將一一定定量量的的酶酶液液與與底底物物溶溶液液混合均勻，適時記下反應(yīng)開始的混合均勻，適時記下反應(yīng)開始的時間時間。（4

42、 4）反應(yīng)到一定的時間，取出適量的反應(yīng)液運(yùn)用）反應(yīng)到一定的時間，取出適量的反應(yīng)液運(yùn)用各種生化檢測技術(shù)，各種生化檢測技術(shù)，測定產(chǎn)物的生產(chǎn)量或底物的減測定產(chǎn)物的生產(chǎn)量或底物的減少量。少量。為了準(zhǔn)確地反映酶促反應(yīng)的結(jié)果，應(yīng)盡量采為了準(zhǔn)確地反映酶促反應(yīng)的結(jié)果，應(yīng)盡量采用快速、簡便的方法，立即測出結(jié)果。若不能立即用快速、簡便的方法，立即測出結(jié)果。若不能立即測出結(jié)果的，則要及時終止酶反應(yīng)，然后再測定。測出結(jié)果的，則要及時終止酶反應(yīng)，然后再測定。終止酶反應(yīng)終止酶反應(yīng)的方法很多，的方法很多，常用的有：常用的有：反應(yīng)時間一到，立即取出適量的反應(yīng)液，置于沸水反應(yīng)時間一到，立即取出適量的反應(yīng)液，置于沸水浴中，浴中，

43、加熱加熱使酶失活；使酶失活；立即加入適宜的立即加入適宜的酶變性劑酶變性劑，如三氯醋酸等，使酶變，如三氯醋酸等，使酶變性失活；性失活；加入加入酸或堿溶液酸或堿溶液，使反應(yīng)液的，使反應(yīng)液的pH值迅速遠(yuǎn)離酶催化值迅速遠(yuǎn)離酶催化反應(yīng)的最適反應(yīng)的最適pH，從而終止反應(yīng)；從而終止反應(yīng)；將取出的反應(yīng)液立即置于低溫冰箱、冰粒堆或冰鹽將取出的反應(yīng)液立即置于低溫冰箱、冰粒堆或冰鹽溶液中，使反應(yīng)液的溶液中，使反應(yīng)液的溫度迅速降低至溫度迅速降低至100C以下以下等等。等等。測定反應(yīng)液中物質(zhì)的變化量，可采用光學(xué)檢測法，測定反應(yīng)液中物質(zhì)的變化量，可采用光學(xué)檢測法，化學(xué)檢測法等化學(xué)檢測法等生化檢測技術(shù)生化檢測技術(shù)。例如，用

44、分光光度法測定堿性磷酸酶催化硝基酚磷例如，用分光光度法測定堿性磷酸酶催化硝基酚磷酸水解生成的對硝基酚的量；酸水解生成的對硝基酚的量；用化學(xué)滴定法測定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄用化學(xué)滴定法測定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量等等。糖的量等等。一種酶可能有多種測定方法，要根據(jù)實(shí)際情況選用。一種酶可能有多種測定方法，要根據(jù)實(shí)際情況選用。2、酶活力單位酶活力單位活力單位活力單位（activeunit）習(xí)慣單位（習(xí)慣單位（U）:底物底物(或產(chǎn)物或產(chǎn)物)變化量變化量/單位時間單位時間國際單位（國際單位（IU）:1moL變化量變化量/分鐘分鐘Katal（Kat）：）：1moL變化量變化量/秒秒比活力比活

45、力=總活力單位總活力單位總蛋白總蛋白mg數(shù)數(shù)=U(或或IU)mg蛋白蛋白量度酶催化能力大小量度酶催化能力大小量度酶純度量度酶純度比活力比活力（specificactivity）3.固定化酶的活力測定固定化酶的活力測定 與與水水不不溶溶性性載載體體結(jié)結(jié)合合，在在一一定定的的空空間間范范圍圍內(nèi)內(nèi)起起催催化化作作用用的的酶酶稱稱為為固固定定化化酶酶。固固定定化化酶酶的的性性質(zhì)質(zhì)與與游游離離酶酶有有一一些些區(qū)區(qū)別別。所所以以固固定定化化酶酶的的活活力力測測定定與與游離酶活力測定方法也有一些不同。游離酶活力測定方法也有一些不同。常用的固定化酶測定方法：常用的固定化酶測定方法：（1）振振蕩蕩測測定定：稱稱

46、取取一一定定重重量量的的固固定定化化酶酶，放放在在一一定定形形狀狀，一一定定大大小小的的容容器器中中，加加入入一一定定量量的的底底物物溶溶液液,在在特特定定的的條條件件下下,一一邊邊振振蕩蕩或或攪攪拌拌,一一邊邊進(jìn)進(jìn)行行催催化化反反應(yīng)應(yīng)，經(jīng)過一定時間，取出一定量的反應(yīng)液進(jìn)行測定。經(jīng)過一定時間，取出一定量的反應(yīng)液進(jìn)行測定。固固定定化化酶酶反反應(yīng)應(yīng)液液的的測測定定方方法法與與游游離離酶酶反反應(yīng)應(yīng)液液的的測測定定方方法法完完全全相相同同，振振蕩蕩或或攪攪拌拌速速度度對對反反應(yīng)應(yīng)速速度度有有很很大大影影響響。過過大大過過小小都都對對反反應(yīng)應(yīng)速速度度有有明明顯顯影影響響。所所以以，在在測測定定固固定定化

47、化酶酶的的活活力力時時，要要在在一一定定的的振振蕩蕩或或攪攪拌拌速速度度下進(jìn)行。下進(jìn)行。（2 2）柱法測定）柱法測定：將一定量的固定化酶裝進(jìn)具有：將一定量的固定化酶裝進(jìn)具有恒溫裝置的反應(yīng)柱中，讓底物溶液以一定的速度恒溫裝置的反應(yīng)柱中，讓底物溶液以一定的速度流過酶柱，收集流出的反應(yīng)液。按常規(guī)方法測定流過酶柱，收集流出的反應(yīng)液。按常規(guī)方法測定底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量。測定方法與游離底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量。測定方法與游離酶反應(yīng)液的測定方法相同。酶反應(yīng)液的測定方法相同。但在測定固定化酶活力要在但在測定固定化酶活力要在固定的流速條件固定的流速條件下下進(jìn)行。而且酶柱的形狀和徑高比都對反應(yīng)速度有進(jìn)行。

48、而且酶柱的形狀和徑高比都對反應(yīng)速度有明顯影響。所有明顯影響。所有這些條件都必須固定不變。這些條件都必須固定不變。（3）連連續(xù)續(xù)測測定定法法：利利用用連連續(xù)續(xù)分分光光光光度度法法等等測測定定方方法法可可以以對對固固定定化化酶酶反反應(yīng)應(yīng)液液進(jìn)進(jìn)行行連連續(xù)續(xù)測測定定，從從而而測測定定固固定定化化酶酶的的酶酶活活力力。測測定定時時，可可將將振振蕩蕩反反應(yīng)應(yīng)器器中中的的反反應(yīng)應(yīng)液液連連續(xù)續(xù)引引起起連連續(xù)續(xù)測測定定儀儀（例例如如，雙雙束束紫紫外外光光分分光光光光度度計計等等）的的流流動動比比色色杯杯中中進(jìn)進(jìn)行行連連續(xù)續(xù)分分光光測測定定?；蚧蛘哒呤故构坦潭ǘɑ该噶髁鞒龀龅牡姆捶磻?yīng)應(yīng)液液連連續(xù)續(xù)流流經(jīng)經(jīng)流

49、流動動比比色色杯杯進(jìn)行連續(xù)分光測定。進(jìn)行連續(xù)分光測定。酶酶活活力力的的連連續(xù)續(xù)測測定定，可可以以及及時時并并準(zhǔn)準(zhǔn)確確地地知知道道某某一一時時刻刻的的酶酶活活力力變變化化情情況況，對對利利用用固固定定化化酶酶進(jìn)進(jìn)行行連連續(xù)續(xù)生生產(chǎn)產(chǎn)和和自自動動控控制制有有重重大大意意義義，這這方方面面正正在在不不斷斷地地研究發(fā)展之中。研究發(fā)展之中。（4）固定化酶的比活力測定固定化酶的比活力測定：游游離離酶酶的的比比活活力力可可以以用用每每1ml酶酶蛋蛋白白所所具具有有的的酶酶活活力力單單位位數(shù)數(shù)表表示示。在在固固定定化化酶酶中中，一一般般要要采采用用每每1mg干干固固定定化化酶酶所所具有的酶活力單位數(shù)表示，即為

50、具有的酶活力單位數(shù)表示，即為單位單位/mg干固定化酶干固定化酶。為為此此，測測定定固固定定化化酶酶比比活活力力時時，首首先先用用濕濕固固定定化化酶酶測測定定其其酶酶活活力力，然然后后將將固固定定化化酶酶在在一一定定條條件件下下干干燥燥，稱稱取取一一定定量量的的干干重重，然然后后計計算算兩兩者者的的商商,才才得得到到固固定定化化酶酶的的比比活活力力。也也可可稱稱取取一一定定量量的的干干固固定定化化酶酶，讓讓它它在在一一定定條條件件下下充充分分溶溶漲漲后后進(jìn)行固定化酶活力測定，再計算比活力。進(jìn)行固定化酶活力測定，再計算比活力。對對于于酶酶膜膜，酶酶板板或或酶酶管管等等固固定定化化酶酶，其其比比活活

51、力力則則以以單單位位面面積的活力單位表示。即為積的活力單位表示。即為酶活力（單位）酶活力（單位）/cm2。（5）酶結(jié)合效率與酶活力回收率的測定）酶結(jié)合效率與酶活力回收率的測定：將將一一定定量量的的酶酶進(jìn)進(jìn)行行固固定定化化時時，不不是是全全部部都都成成為為固固定定化化酶酶，而而總總是是有有一一部部分分酶酶沒沒有有與與載載體體結(jié)結(jié)合合在在一一起起。為為了了確確定定固固定定化化的的效效果果，需需要要測測定定酶酶的的結(jié)結(jié)合合效效率率或或酶活力回收率。酶活力回收率。酶酶結(jié)結(jié)合合效效率率一一般般由由加加入入的的總總酶酶活活力力減減去去未未結(jié)結(jié)合合的的酶活力的差值與加入的酶活力的百分比來表示。酶活力的差值與

52、加入的酶活力的百分比來表示。未未結(jié)結(jié)合合酶酶活活力力，包包括括固固定定化化后后濾濾出出固固定定化化酶酶后后的的濾濾液液以以及及洗洗滌滌固固定定化化酶酶的的洗洗滌滌液液中中所所含含有有的的酶酶活活力力的和。的和。酶酶活活力力回回收收率率是是指指固固定定化化酶酶的的總總活活力力與與用用于于固固定化酶總活力的百分比。定化酶總活力的百分比。當(dāng)當(dāng)固固定定化化方方法法對對酶酶活活力力沒沒有有明明顯顯影影響響時時，酶酶結(jié)結(jié)合合效效率率與與酶酶活活力力回回收收率率的的數(shù)數(shù)值值相相近近。然然后后固固定定化化方方法法往往往往對對酶酶活活力力有有一一定定影影響響，兩兩者者的的數(shù)數(shù)值值往往往往有有較較大大的的差差別別

53、。所所以以，通通常常都都通通過過測測定定酶酶結(jié)結(jié)合合效效率來表示固定化的效果。率來表示固定化的效果。（6）相對酶活力測定）相對酶活力測定：具具有有相相同同酶酶蛋蛋白白量量的的固固定定化化酶酶活活力力與與游游離離酶酶活活力的比值稱為相對酶活力。力的比值稱為相對酶活力。固固定定化化酶酶的的相相對對酶酶活活力力與與載載體體結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)，顆顆粒粒大大小小，底底物物分分子子量量大大小小及及酶酶結(jié)結(jié)合合效效率率等等有有密密切切關(guān)關(guān)系系。相相對對酶酶活活力力的的高高低低表表明明了了固固定定化化酶酶應(yīng)應(yīng)用用價價值值的的大大小小。故故此此，在在固固定定化化酶酶的的研研制制過過程程中中，應(yīng)應(yīng)從從固固定定化化載載體體，

54、固固定定化化技技術(shù)術(shù)等等方方面面進(jìn)進(jìn)行行研研究究和和改改進(jìn)進(jìn)，以以提提高高固固定定化化酶的相對酶活力。酶的相對酶活力。第四節(jié)第四節(jié)酶的生產(chǎn)方法酶的生產(chǎn)方法n酶酶的的生生產(chǎn)產(chǎn)是是指指經(jīng)經(jīng)過過預(yù)預(yù)先先設(shè)設(shè)計計，通通過過人人工工操操作作控控制制而獲得所需的酶的過程。而獲得所需的酶的過程。n酶酶的的生生產(chǎn)產(chǎn)方方法法可可分分為為提提取取法法、發(fā)發(fā)酵酵法法以以及及化化學(xué)學(xué)合合成成法法等等3 3種種。其其中中，提提取取法法是是最最早早采采用用而而沿沿用用至至今今的的方方法法，發(fā)發(fā)酵酵法法是是5050年年代代以以來來酶酶生生產(chǎn)產(chǎn)的的主主要要方方法。而化學(xué)合成法仍在實(shí)驗(yàn)室階段。法。而化學(xué)合成法仍在實(shí)驗(yàn)室階段。一

55、、提取分離法一、提取分離法 提提取取分分離離法法是是指指將將酶酶從從細(xì)細(xì)胞胞或或其其他他含含酶酶原原料料中中提提取取出出來來，再再與與雜雜質(zhì)質(zhì)分分開開，而而獲獲得得符符合合研研究究或或使使用用要要求求的的酶酶制制品品的的過過程程。提取法分離法是最早采用的酶生產(chǎn)方法。提取法分離法是最早采用的酶生產(chǎn)方法。酶酶的的提提取取是是指指在在一一定定的的條條件件下下，用用適適當(dāng)當(dāng)?shù)牡娜苋軇﹦┨幪幚砝砗该冈狭?，使使酶酶充充分分溶溶解解到到溶溶劑劑中中的的過過程程，也也稱稱為為酶酶的的抽抽提提。酶酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)果和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)果和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇８?/p>

56、根據(jù)據(jù)酶酶提提取取時時所所采采用用的的溶溶劑劑或或溶溶液液的的不不同同，酶酶的的提提取取方方法法主主要要有有鹽鹽溶溶液液提提取取、酸酸溶溶液液提提取取、堿堿溶溶液液提提取取和和有有機(jī)機(jī)溶溶劑劑提取提取等方法。等方法。酶酶的的分分離離純純化化是是采采用用各各種種生生化化分分離離技技術(shù)術(shù)使使酶酶與與各各種種雜雜質(zhì)分離，達(dá)到所需的純度，以滿足使用的要求。質(zhì)分離，達(dá)到所需的純度，以滿足使用的要求。酶的分離純化方法主要有：酶的分離純化方法主要有：1 1、沉淀分離、沉淀分離 （1 1）鹽鹽析析沉沉淀淀法法 （2 2）等等電電點(diǎn)點(diǎn)沉沉淀淀法法 （3 3）有有機(jī)機(jī)溶溶劑劑沉淀法沉淀法 （4 4）復(fù)合沉淀法）復(fù)

57、合沉淀法 （5 5）選擇性變性沉淀法）選擇性變性沉淀法 2 2、離心分離、離心分離 3 3、過濾與膜分離、過濾與膜分離 4 4、層析分離、層析分離 （1 1）吸附層析）吸附層析 （2 2）分配層析）分配層析 （3 3）離子交換層析）離子交換層析 （4 4）凝膠層析）凝膠層析 （5 5）親和層析）親和層析 （6 6）層析聚焦）層析聚焦 5、電泳分離、電泳分離（1）紙電泳）紙電泳（2）薄層電泳）薄層電泳（3）薄膜電泳）薄膜電泳（4）凝膠電泳）凝膠電泳（5）等電點(diǎn)聚焦電泳）等電點(diǎn)聚焦電泳6、萃取分離、萃取分離（1）有機(jī)溶劑萃取有機(jī)溶劑萃?。?）雙水相萃?。╇p水相萃取（3）超臨界萃?。┏R界萃?。?）

58、反膠束萃?。┓茨z束萃取7、結(jié)晶、結(jié)晶（1）鹽析結(jié)晶法）鹽析結(jié)晶法（2）有機(jī)溶劑結(jié)晶法）有機(jī)溶劑結(jié)晶法（3）透析平衡結(jié)晶法）透析平衡結(jié)晶法（4）等電點(diǎn)結(jié)晶法）等電點(diǎn)結(jié)晶法8、濃縮與干燥、濃縮與干燥選用酶的分離純化的要點(diǎn)：選用酶的分離純化的要點(diǎn)：1、目標(biāo)酶分子特性及其他物理化學(xué)性質(zhì)；、目標(biāo)酶分子特性及其他物理化學(xué)性質(zhì)；2、酶分子和雜質(zhì)的主要性質(zhì)差異；、酶分子和雜質(zhì)的主要性質(zhì)差異；3、酶的使用目的和要求；、酶的使用目的和要求；4、技術(shù)實(shí)施的難易程度；、技術(shù)實(shí)施的難易程度；5、分離成本的高低；、分離成本的高低；6、是否會造成環(huán)境污染等、是否會造成環(huán)境污染等 從從動動物物、植植物物或或微微生生物物的的組

59、組織織、細(xì)細(xì)胞胞中中提提取取分分離離所所需需的的酶，至今仍然使用。酶，至今仍然使用。例例如如，從從動動物物胰胰臟臟中中提提取取胰胰蛋蛋白白酶酶、胰胰淀淀粉粉酶酶、胰胰脂脂肪肪酶酶或或這這些些酶酶的的混混合合物物胰胰酶酶；從從動動物物胃胃中中提提取取胃胃蛋蛋白白酶酶；從從動動物物小小腸腸中中提提取取堿堿性性磷磷酸酸酶酶；從從木木瓜瓜中中提提取取木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶；從從菠菠蘿蘿中中提提取取菠菠蘿蘿蛋蛋白白酶酶；從從檸檸檬檬酸酸發(fā)發(fā)酵酵的的廢廢菌菌體體黑黑曲霉菌體中提取果膠酶等。曲霉菌體中提取果膠酶等。酶酶的的分分離離提提取取技技術(shù)術(shù)不不但但在在酶酶的的提提取取分分離離法法生生產(chǎn)產(chǎn)中中使使用用，而

60、而且且在在采采用用其其他他生生產(chǎn)產(chǎn)方方法法生生產(chǎn)產(chǎn)酶酶的的過過程程中中也也是是不不可可缺缺少少的的技技術(shù)術(shù)，此此外外，在在酶酶的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)與與功功能能、酶酶的的催催化化機(jī)機(jī)制制、酶酶催催化化動力學(xué)等酶學(xué)研究方面也是不可缺少的重要手段。動力學(xué)等酶學(xué)研究方面也是不可缺少的重要手段。二、生物合成法二、生物合成法 生生物物合合成成法法是是5050年年代代以以來來酶酶生生產(chǎn)產(chǎn)的的主主要要方方法法。它它是是利利用用微微生生物物細(xì)細(xì)胞胞、植植物物細(xì)細(xì)胞胞或或動動物物細(xì)細(xì)胞胞的的生生命命活活動動而而獲獲得人們所需酶的技術(shù)過程。得人們所需酶的技術(shù)過程。生物合成法產(chǎn)酶程序生物合成法產(chǎn)酶程序1 1、經(jīng)經(jīng)過過篩篩選選

61、、誘誘變變、細(xì)細(xì)胞胞融融合合、基基因因重重組組等等方方法法獲獲得得優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞；優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞；2 2、在在人人工工控控制制條條件件的的生生物物反反應(yīng)應(yīng)器器中中進(jìn)進(jìn)行行細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)，通通過細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的新陳代謝作用，生成各種代謝產(chǎn)物。過細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的新陳代謝作用，生成各種代謝產(chǎn)物。3 3、再經(jīng)過分離純化得到所需的酶。、再經(jīng)過分離純化得到所需的酶。經(jīng)經(jīng)過過預(yù)預(yù)先先設(shè)設(shè)計計，通通過過人人工工操操作作，利利用用微微生生物物細(xì)細(xì)胞胞的的生生命命活活動動合合成成所所需需酶酶的的方方法法又又稱稱為為發(fā)發(fā)酵酵法法，根根據(jù)據(jù)微微生生物物培培養(yǎng)養(yǎng)方方式式的的不不同同，發(fā)發(fā)酵酵法法可可分分為為固固體體培培養(yǎng)養(yǎng)發(fā)

62、發(fā)酵酵、液液體體深深層層發(fā)發(fā)酵酵、固固定定化化細(xì)細(xì)胞胞發(fā)發(fā)酵酵和和固固定化原生質(zhì)體發(fā)酵等。定化原生質(zhì)體發(fā)酵等。固固體體培培養(yǎng)養(yǎng)發(fā)發(fā)酵酵的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基,以以麩麩皮皮、米米糠糠為為原原料料，加加入入其其他他必必要要的的營營養(yǎng)養(yǎng)成成分分，制制成成固固體體或或半半固固體體的的麩麩曲曲，經(jīng)經(jīng)過過滅滅菌菌、冷冷卻卻后后，接接種種菌菌株株后后在在一一定定條條件下進(jìn)行發(fā)酵，已獲得所需的酶。件下進(jìn)行發(fā)酵，已獲得所需的酶。其其優(yōu)優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)是是：設(shè)設(shè)備備簡簡單單，操操作作方方便便，麩麩曲曲中中酶酶的的濃度較高，特別適合各種霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶。濃度較高，特別適合各種霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶。其其缺缺點(diǎn)點(diǎn)是是勞勞動動強(qiáng)強(qiáng)度

63、度較較大大，原原料料利利用用率率較較低低，生生產(chǎn)周期較長。產(chǎn)周期較長?，F(xiàn)現(xiàn)在在普普遍遍使使用用的的是是液液體體深深層層發(fā)發(fā)酵酵技技術(shù)術(shù)。是是置置于于生生物物反反應(yīng)應(yīng)器器中中，經(jīng)經(jīng)過過滅滅菌菌、冷冷卻卻后后，接接種種產(chǎn)產(chǎn)酶酶細(xì)細(xì)胞胞，在在一一定定條條件件下下，進(jìn)進(jìn)行行發(fā)發(fā)酵酵，生生產(chǎn)產(chǎn)所所需需的的酶酶。例例如如，利利用用枯枯草草桿桿菌菌細(xì)細(xì)胞胞生生產(chǎn)產(chǎn)淀淀粉粉酶酶、蛋蛋白白酶酶，利利用用黑黑曲曲霉霉生生產(chǎn)產(chǎn)糖糖化化酶酶、果果膠膠酶酶，利利用用大大腸腸桿桿菌菌生生產(chǎn)產(chǎn)谷谷氨氨酸酸脫脫羧羧酶酶、多多核核苷苷酸酸聚聚合合酶等。酶等。其其特特點(diǎn)點(diǎn)是是：機(jī)機(jī)械械化化程程度度較較高高，技技術(shù)術(shù)管管理理較較嚴(yán)

64、嚴(yán)格格，酶酶的的產(chǎn)率較高，質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率較高。產(chǎn)率較高，質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率較高。用用固固定定化化細(xì)細(xì)胞胞生生產(chǎn)產(chǎn)胞胞外外酶酶。固固定定化化細(xì)細(xì)胞胞是是指指固固定定在在水水不不溶溶性性的的載載體體上上，在在一一定定空空間間范范圍圍內(nèi)內(nèi)進(jìn)進(jìn)行行生生命命活活動動的的細(xì)細(xì)胞胞。例例如如，固固定定化化枯枯草草桿桿菌菌細(xì)細(xì)胞胞生生產(chǎn)產(chǎn) 淀粉酶，固定化黑曲霉細(xì)胞生產(chǎn)糖化酶、果膠酶等。淀粉酶，固定化黑曲霉細(xì)胞生產(chǎn)糖化酶、果膠酶等。其其特特點(diǎn)點(diǎn)是是：1 1、細(xì)細(xì)胞胞密密度度大大，可可提提高高產(chǎn)產(chǎn)酶酶能能力力；2 2、發(fā)發(fā)酵酵穩(wěn)穩(wěn)定定性性好好，可可以以反反復(fù)復(fù)使使用用或或連連續(xù)續(xù)使使用用較較長長時時間間；

65、3 3、細(xì)細(xì)胞胞固固定定在在載載體體上上，流流失失較較少少，可可以以在在高高稀稀釋釋率率的的條條件件下下連連續(xù)續(xù)發(fā)發(fā)酵酵，利利于于自自動動化化生生產(chǎn)產(chǎn)；4 4、發(fā)發(fā)酵酵液液中中含菌教少，利于產(chǎn)品分離純化，提高質(zhì)量等。含菌教少，利于產(chǎn)品分離純化，提高質(zhì)量等。利利用用固固定定化化原原生生質(zhì)質(zhì)體體生生產(chǎn)產(chǎn)胞胞內(nèi)內(nèi)酶酶。是是指指固固定定在在載載體體上上、在在一一定定空空間間范范圍圍內(nèi)內(nèi)進(jìn)進(jìn)行行生生命命活活動動的的原原生生質(zhì)質(zhì)體體。例例如如，固固定定化化枯枯草草桿桿菌菌原原生生質(zhì)質(zhì)體體生生產(chǎn)產(chǎn)堿堿性性磷磷酸酸酶酶；固固定定化化黑黑曲曲霉霉原原生生質(zhì)質(zhì)體體生生產(chǎn)產(chǎn)葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶；固固定定化化谷氨

66、酸棒桿菌原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸脫氫酶等。谷氨酸棒桿菌原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸脫氫酶等。其其特特點(diǎn)點(diǎn)是是：1、有有利利于于胞胞內(nèi)內(nèi)物物質(zhì)質(zhì)透透過過細(xì)細(xì)胞胞膜膜分分泌泌到到細(xì)胞外。細(xì)胞外。2、有利于細(xì)胞間質(zhì)中的物質(zhì)游離到細(xì)胞外。、有利于細(xì)胞間質(zhì)中的物質(zhì)游離到細(xì)胞外。3、穩(wěn)定性好，可以連續(xù)或重復(fù)使用一段時間。、穩(wěn)定性好，可以連續(xù)或重復(fù)使用一段時間。8080年年代代以以來來，除除了了利利用用微微生生物物細(xì)細(xì)胞胞進(jìn)進(jìn)行行發(fā)發(fā)酵酵以以外外，還還發(fā)發(fā)展展起起了了用用植植物物細(xì)細(xì)胞胞或或動動物物細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)技技術(shù)術(shù)，即即通通過過特特定定技技術(shù)術(shù)獲獲得得優(yōu)優(yōu)良良的的動動、植植物物細(xì)細(xì)胞胞，然然后后在在人人工工控控制制的的條條件件的的反反應(yīng)應(yīng)器器中中進(jìn)進(jìn)行行細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)以以得得到所需的酶的過程。到所需的酶的過程。例例如如，利利用用大大蒜蒜細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)生生產(chǎn)產(chǎn)超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶；利利用用木木瓜瓜細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)生生產(chǎn)產(chǎn)木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶、木木瓜瓜凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶；利利用用人人黑黑色色素素瘤瘤細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)生生產(chǎn)產(chǎn)血血纖纖維維蛋蛋白白溶酶原激活劑等。溶酶原激活劑等。動物細(xì)胞的獲得：動物細(xì)胞