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1、,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,*,JASCO J-1500,圓二色譜儀操作培訓,-,食品科技學院 中心實驗室 唐老師,目 錄,1,、,圓二色譜儀基本原理與應用,2,、,JASCO J-1500,基本組成與附件,3,、開機與基本操作規(guī)程,4,、數(shù)據(jù)分析,5,、關機與試驗注意事項,1,、圓二色譜儀基本原理,平面偏振光的電向量,E,起偏振器,自然光的電向量,E,橢圓偏振光,：,兩束偏振光的振幅,(,強度,),不相同,圓二色性,(CD),：活性物質對左、右旋圓偏振光的吸收率差值，將傳播的左右圓偏振光變成橢圓偏振光。,兩束互相垂直，振幅相等的平

2、面偏振光，其位相相差,1/4,波長時，合成圓偏振光。,圓二色性,(CD),的表示：,CD,單位轉換方法：,http:/www.eryi.org/blog/post/circular-dichroism-units-conversion.html,Ellipticity,（橢圓率,）,：,mdeg,，定義單位，儀器測定直接顯示,CD,圖,y,坐標。,Mean residue ellipticity or,Molar ellipticity(,摩爾橢圓率,),：單位為,deg.cm,2,.dmol,-1,，文獻中通常都使用,根據(jù),Beer-Lambert law,有：,=,.,l.c,或,=,md

3、eg/(l.c)(c-,摩爾濃度,),計算出的值最后再乘以,1000,即可轉換為,deg.cm,2,.dmol,-1,對于,蛋白質,，使用的是,mean residue ellipticity,。由于,mean residue molecular weight=protein formula weight/number of residues.,摩爾圓二色性為摩爾消光系數(shù)的差值（,delta epsilon,），即：,=LCP-RCP,在分子模擬中通過高斯理論計算,CD,光譜時，得到的結果通常是以,摩爾圓二色性,表示,。,與摩爾橢圓率（,molar ellipticity,）,之間的轉換：,=

4、3298.2,CD,光譜與,ORD,光譜,：,同時產(chǎn)生，包括同樣的分子結構信息，光學活性物質分子中的不對稱生色團。,CD,反應光與分子間能量的轉換，旋光性則是與分子中電子的運動有關。,差異：,CD,比,ORD,容易辨別重疊峰，易檢測弱吸收帶、更容易擬合、能夠提供較多意義明確的信息。,旋光性,(ORD),：光學活性分子對左、右圓偏光的折射率不同，透射光仍然為平面偏振光，但其旋轉了一定的角度（旋光度）。,圓二色譜儀應用：,蛋白質折疊研究,蛋白質構象研究,DNA/RNA,相互作用,酶動力學研究,有機立體化學研究,光化學物質純度檢測,藥物量的分析,天然有機化學,生化和大分子,金屬復合物化學,醫(yī)學,農(nóng)業(yè)

5、化學,物理化學,快速掃描實驗,通過,CD,光譜可用于分析諸如,核酸、蛋白質、多糖等生物大分子光活性物質,的空間結構。,蛋白質：,氨基酸的圓二色性：在可見光區(qū)沒有吸收，紫外區(qū)只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。,2,、,JASCO J-1500,基本組成與附件,配置：,1,）檢測器：,UV-VIS,163-950nm,NIR,400-1250nm,2),光源：,氙燈,3),氣體：高純,N2,4),多通道,測定（,CD/HT/Abs,），,CD,測定范圍：,20,200,2000,10000 mdeg,5),蛋白質二級結構,分析軟件,6),其他,附件,：變溫支架、停流附件等,附件,1),變溫樣品支

6、架（,-40130,）,石英比色皿,:1,、,10mm,石英比色皿,:1,、,2,、,5,、,10mm,附件,2),固體樣品支架與積分球檢測器,制樣工具,可做透射法或反射法，,壓片制樣或直接上樣,3),停流附件,注射器：,10ml,單管路死體積：,46ul,注射器,Flow rate,Max,:,5ml/min,Mixing Ratio:,整數(shù)倍,反應動力學檢測,4)N2,吹掃裝置,只能用于標準樣品支架，用于,190nm,以下樣品測試,3,、開機與基本操作規(guī)程,1,）,開氣,：,打開氮氣,，調節(jié)分壓在,0.02mPa,左右，依據(jù)測定波長范圍在儀器右側的流量控制器中調節(jié)所需的氣體流量。(190n

7、m 2L/min;185-190nm 5-10L/min;2,時，測試不準確。適宜的,A,范圍,0.6-1,。,b),控制,HT,范圍在,170-700,之間,，降低,HT,方法：降低樣品濃度、使用短光程長比色皿、增加帶寬、注意溶劑效應。,HT700,時沒有足夠的光到達檢測器，測試結果不準確。狹縫寬太大，,HT170,可損壞,PMT,檢測器。,4,、數(shù)據(jù)分析,1,）數(shù)據(jù)類型：,2D,數(shù)據(jù)：,.jws,格式，光譜分析軟件以及二級結構分析軟件都是需要這種格式數(shù)據(jù)文件。,3D,數(shù)據(jù)：,.jwb,格式，需根據(jù)需要提取,2D,數(shù)據(jù)后進行相關分析。,2,）蛋白質二級結構軟件分析：,CD,單位需為摩爾濃度，

8、故需已知蛋白濃度（,mg/ml,），氨基酸殘基平均分子量（未知時，一般取,110,）。,“蛋白質中,20,中氨基酸的平均分子質量約為,138,，但在多數(shù)蛋白質中較小的氨基酸占優(yōu)勢，因此平均相對分子質量約為,128,。又因每形成一個肽鍵將除去一分子水（相對分子質量,18,），所以氨基酸殘基的平均相對分子質量約為,128-18=110,?！?-,王鏡巖版,生物化學,第三版上冊,p160,2D,數(shù)據(jù)分析：,二級結構分析：,打開,protein Secondary structure estimation,軟件，打開轉換單位后另存的文件數(shù)據(jù),。,3D,數(shù)據(jù)分析：,需進行,2D,數(shù)據(jù)提取后方可進行有關分

9、析。點擊,Interval Data Analysis,軟件，打開,.jwb,格式,3D,數(shù)據(jù)文件。,5,、關機與測試注意事項,1,）關機程序：,關閉軟件、關閉電腦和,J-1500,主機電源、關閉水循環(huán)、通氣,10min,后關閉氮氣,。,2,）樣品架確認：,儀器開機前確認安裝的是何種樣品支架，若是變溫支架必須先開循環(huán)水才能開機。,3,）禁止未開氣體開機：,高壓氙燈，使空氣在,O2,變成臭氧，腐蝕光路配件表面。,4,）比色皿：,石英比色皿由于加工過程產(chǎn)生形變可顯示圓二色性，故需使用低,CD,信號的比色皿。,比色皿清洗：保證測試重復性。禁止超聲清洗，,Pierced,等專門清洗劑（清洗劑洗后建議用,2M,）、堿溶液、,50%,硝酸等。,for protein:,近紫外區(qū)使用光程長,5mm,的，遠紫外區(qū)使用,1mm-0.1mm,。,End,