《實(shí)驗(yàn)八 細(xì)胞內(nèi)溶酶體和線粒體的熒光標(biāo)記》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《實(shí)驗(yàn)八 細(xì)胞內(nèi)溶酶體和線粒體的熒光標(biāo)記（10頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,*,細(xì)胞內(nèi)溶酶體,和線粒體的熒光活體染色,實(shí)驗(yàn)原理,Mito-Tracker Green,是一種線粒體,(mitochondria),綠色熒光探針，可以用于活細(xì)胞線粒體特異性熒光染色。,Mito-TrackerGreen,為采用,MolecularProbes,公司的,carbocyanine,進(jìn)行了熒光標(biāo)記的一種,Mito-Tracker,，分子量為,671.88,，可以用作線粒體特異性的熒光探針。和,rhodamine123,或,JC-1,相比，,Mito-Tracker Green,對(duì)于線粒體的染色不

2、依賴于線粒體膜電位。,實(shí)驗(yàn)原理,Lyso-Tracker Red,是一種溶酶體,(lysosome),紅色熒光探針，可以用于,活細(xì)胞,溶酶體特異性熒光染色。,Lyso-Tracker Red,為采用,Molecular Probes,公司的,DND 99,進(jìn)行了熒光標(biāo)記的帶有,弱堿性,的熒光探針，可以選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于,溶酶體的特異性熒光,標(biāo)記。中性紅,(NeutralRed),和吖啶橙,(Acridine Orange),也都可以對(duì)溶酶體進(jìn)行熒光染色，但中性紅和吖啶橙的染色缺乏特異性。,1.,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握熒光顯微鏡工作的原理,了解細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)的分布,了解熒光染料

3、的使用方法,Lyso-Tracker Red,工作液的配制：,a.,取少量,Lyso-Tracker Red,按照,1:13333-1:20000,的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?(,例如含鈣鎂離子的,HBSS),中，使,最終濃度為,50-75nM,。例如取,1,l Lyso-Tracker Red,加入到,20ml,或,13.33ml,細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?(,例如含鈣鎂離子的,HBSS),中。,2.,溶酶體的熒光標(biāo)記：,a.,去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入步驟,1,配制好的并,28,預(yù)溫育的,Lyso-Tracker Red,染色工作液，與細(xì)胞,28,共孵育,30,分鐘,。,b.,去除,Lys

4、o-Tracker Red,染色工作液，加入,500,微升預(yù)溫的新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液或,PBS,漂洗。,c.,取出蓋玻片，在載玻片上滴一滴,PBS,，將蓋玻片反扣在載玻片上，熒光觀察,d.,用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。此時(shí)可觀察到溶酶體呈明亮的強(qiáng)熒光染色。如果染色效果欠佳，可以提高,Lyso-Tracker Red,染色工作液中,Lyso-Tracker Red,的濃度或在推薦的時(shí)間范圍內(nèi)適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間。,使用說(shuō)明：,1.Mito-Tracker Green,儲(chǔ)存液的配制：,用無(wú)水,DMSO(anhydrous dimethylsulfoxide),配制,Mito-Tracker G

5、reen,至終濃度為,1mM,。配制后可以,-20,或更低溫度避光保,存。,2.Mito-Tracker Green,工作液的配制：,a.,取少量,1mM Mito-Tracker Green,儲(chǔ)存液按照,1:5000-1:50000,的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?(,例如含鈣鎂離子的,HBSS),中，使最終濃度為,20-200nM,。例如取,1,l Mito-Tracker Green,加入到,50ml,或,5ml,細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?(,例如含鈣鎂離子的,HBSS),中?；靹蚝蠹礊?Mito-Tracker Green,工作液。,HBSS with Ca2+&Mg2+(C0219

6、),可以向碧云天訂購(gòu),。,b.Mito-Tracker Green,工作液使用前需,28,預(yù)溫育。,注：工作液中,Mito-Tracker Green,的濃度可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。為降低背景，在染色效果可以接受的范圍內(nèi)，建議盡量使用較低濃度的,Mito-Tracker Green,。,3.,線粒體的熒光標(biāo)記：,a.,去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入步驟,2,配制好的并,28,預(yù)溫育的,Mito-Tracker Green,染色工作液，與細(xì)胞,28,共孵育,15-45,分,鐘。,b.,去除,Mito-Tracker Green,染色工作液，加入,500,微升,28,預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液或,PBS,

7、漂洗。,c.,取出蓋玻片，在載玻片上滴一滴,PBS,，將蓋玻片反扣在載玻片上，熒光觀察,。,d.,用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。此時(shí)可觀察到線粒體呈明亮的強(qiáng)熒光染色。如果染色效果欠佳，可以提高,Mito-Tracker Green,染色工作液中,Mito-Tracker Green,的濃度或在推薦的時(shí)間范圍內(nèi)適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間。,1,打開(kāi)可將光和激發(fā)光光源（預(yù)熱,10,分鐘）,2,遮光板遮住激發(fā)光,3,選擇“,1”,，在可見(jiàn)光下，聚焦，觀察清晰圖像，再調(diào)到高倍鏡下，微調(diào)至清晰,4,關(guān)掉可見(jiàn)光光源，打開(kāi)遮光板，讓激發(fā)光透過(guò),5,選擇“,G”,觀察紅色熒光,6,選擇“,B”,觀察綠色熒光,