《醫(yī)學(xué)流式細胞術(shù)及其應(yīng)用生化經(jīng)典》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《醫(yī)學(xué)流式細胞術(shù)及其應(yīng)用生化經(jīng)典（45頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,流,式細胞術(shù)及其應(yīng)用,第 一 部 分,流式細胞術(shù)的一般介紹,概念,流式細胞術(shù),（,Flow Cytometry,，,FCM,）,利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單,細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特,定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術(shù)。,流式細胞儀,（,Flow Cytometer),集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算,機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的,一種新型高科技儀器。,流式細胞儀,特點,單細胞懸液或生物顆粒,分析速度高,多參數(shù),精度高,當(dāng)代最先進的

2、細胞定量分析技術(shù),FACSCalibur,特點：,光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定,自動化程度高,操作簡便,使用壽命長,配備,1-2,根激光,細胞分選速度慢，,主要用于細胞分析,臨床型（臺式機）,BD LSR,FACS Vantage DiVa,科研型（大型機）,特點：,多數(shù)字化,適用用各類細胞分選,4,路分選,FACSAria,科研型,特點：,分辨率高,選配多種波長和類型激光器,可把感興趣細胞分選到特定培養(yǎng)孔或板上（,4,路和,24,孔板）,適用于高速分選和多色分析,流式細胞儀檢測范圍,細胞大小,細胞粒度,細胞表面面積,核漿比例,DNA,含量與細胞周期,RNA,含量,蛋白質(zhì)含量,細胞結(jié)構(gòu),特異性抗原,（細胞

3、表面,/,胞漿,/,核）,細胞內(nèi)細胞因子,細胞活性,酶活性,激素結(jié)合位點,細胞受體,細胞功能,臨床研究,淋巴細胞亞群測定、血小板分析、網(wǎng)織紅細胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、,HLA-B27,分析、,PNH,診斷、人類同種異體器官移植中應(yīng)用、細胞因子測定、,AIDS,診斷與治療和療效評價、,flow-FISH,法測定端粒長度,基礎(chǔ)研究,淋巴細胞功能、樹突狀細胞（,DC,）研究、造血干細胞研究、細胞周期分析、細胞凋亡分析、凋亡相關(guān)蛋白分析、細胞功能研究、多藥耐藥基因研究（,MDR,）、腫瘤相關(guān)基因表達研究、,RNA,測定、,DNA,測定、總蛋白測定、癌基因和抑癌基因表達產(chǎn)物測定、,血管內(nèi)皮細胞研

4、究,流式細胞儀的工作原理,光學(xué)系統(tǒng),激光光源,光收集系統(tǒng),液流系統(tǒng),流動室,液流驅(qū)動系統(tǒng),電子系統(tǒng),光電轉(zhuǎn)換,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),細胞分選系統(tǒng),激光光源,單波長、高強度、高穩(wěn)定性,多采用氬離子激光器或氦氖激光器,一般選配,2-4,根激光，,488nm,、,633nm,和,355nm,、,407nmUV,激光,最多檢測,13,個熒光參數(shù),Longpass Shortpass Bandpass,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,光收集系統(tǒng)：濾光片,光收集系統(tǒng)：光電倍增管（,PMT,）,FACSCalibur,光路圖,液流

5、系統(tǒng)：流動室、液流驅(qū)動系統(tǒng),液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱,細胞分選系統(tǒng),Fluorescence Activated Cell Sorting,488,nm,laser,+,-,Charged Plates,Single cells sorted,into test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,信號檢測,-,散色光,FSC,（小角散射,),光它反應(yīng)細胞的相對大小和截面積的大小,SSC(,90,度角散射光,),代表細胞的顆粒度和精細結(jié)構(gòu)的變化,全血細胞流式,FSC-SSC,圖,它反應(yīng)細胞的物理特性,根據(jù)前側(cè)向散射光，可以把不同類型的細胞

6、群加以區(qū)分,信號檢測,-,熒光信號,自發(fā)熒光,特異熒光,特異熒光,能量級,激發(fā),激發(fā)態(tài),發(fā)射,激光,能量損失,數(shù)據(jù)顯示類型,單參數(shù)直方圖,（,Histogram,）,X,軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數(shù)”表示，可以與光強度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系,Y,軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細胞的頻率,二維等高圖和密度圖,Pseudo 3D Plot,3D Plot,二維點圖,Dot Plot,便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計,不同的細胞群可以用不同的顏色標(biāo)記,主要表達方式,光譜交叉,Emission wavelength(nm),530 580 630 680 730 780,FITC,PE,PE

7、-,TR,PE-CY5,4 colors-simultaneous collection,兩色以上熒光分析存在 光譜交叉,熒光補償,方法,所有補償調(diào)為“,0”,調(diào)節(jié)電壓，用同型對照或陰性對照，使陰性群位于“左下角”,依單陽群體調(diào)節(jié)熒光補償,抗體使用原則,根據(jù)儀器型號和抗原表達強弱合理選擇熒光抗體,低表達抗原標(biāo)記高,S/N,（信噪比）熒光素，如,PE,、,APC,使用雙標(biāo)以上抗體必做熒光補償,樣品,培養(yǎng)細胞,新鮮組織,石蠟包埋,單細胞,懸液,標(biāo)記,熒光抗體,檢測,表型測定,細胞分選,流式細胞術(shù)操作流程,統(tǒng)計學(xué),分析,繼續(xù),培養(yǎng),第 二 部 分,流式細胞術(shù)在不同領(lǐng)域的應(yīng)用,細 胞 周 期 分 析,

8、樣品制備,1000,rpm 5,分鐘,收集,2X10,6,個細胞,PBS,漂洗,兩次,70%,酒精,4,度固定過夜,收集固定的細胞,PBS,漂洗,0.5 PBS,懸浮細胞,2.5l,10g/l,RNase A,37,度消化,1,小時,過,300,目細胞篩,50l 0.1mg/ml PI,（含,1%Triton),，,1000,rpm 5,分鐘,離心,兩次,混勻，室溫,靜止,5,分鐘,上機,建立獲取模式，獲取數(shù)據(jù),（,PI,單染分析細胞周期，同時看凋亡）,去甲斑蟊素對肝癌細胞周期的作用,數(shù)據(jù)分析,圈門去除細胞碎片，分析細胞凋亡,圈門去除粘連體，分析細胞周期,細胞凋亡分析,Annexin V-PE

9、/7-AAD,雙染色法,雙陰：活細胞,Annexin V-PE,單陽：早期凋亡細胞,雙陽：晚期凋亡細胞,7-AADd,單陽：壞死細胞,人外周血淋巴細胞亞群檢測,T,淋巴細胞,T,淋巴細胞檢測,淋巴細胞,CD4,+,T,（,Th,),淋巴細胞檢測,淋巴細胞,CD4+,CD8,+,Ts,淋巴細胞檢測,淋巴細胞,CD8+,B,淋巴細胞檢測,淋巴細胞,B,淋巴細胞,NK,細胞檢測,淋巴細胞,NK,細胞,結(jié)束語,流式細胞術(shù)是一種應(yīng)用范圍極廣、靈活性很強、技術(shù)含量較高、具有眾多開發(fā)潛能、富有挑戰(zhàn)性的技術(shù)，需要掌握很多交叉學(xué)科知識，我們的宗旨是將這項高新技術(shù)靈活運用于臨床、科研等領(lǐng)域，報告最科學(xué)、最真實的客觀數(shù)據(jù)，以服務(wù)于全社會。,