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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,*,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,雙向電泳的技術(shù)流程和樣品制備,史須,北京大學(xué)人類疾病基因研究中心,基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué),基因組學(xué)：,蛋白質(zhì)組學(xué)：可視為分子生物學(xué)的大規(guī)模篩選技術(shù)，目的在于歸類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的整體分布，鑒定并分析感興趣的個別蛋白，最終闡明它們的關(guān)系與功能。,上述兩種學(xué)科的研究內(nèi)容在互補(bǔ)的水平上研究了細(xì)胞的分子架構(gòu)，又都在各自的水平上提供了增強(qiáng)對方效應(yīng)的信息，因此二者存在有很強(qiáng)的且?guī)в邢到y(tǒng)性相互關(guān)系,。,Applications of,proteomics,Protein identification/characteriza

2、tion,Protein-protein interaction,Post-,translational,modifications,Subcellular,location,Elucidation of pathway,Target validation and toxicology,Drug discovery,蛋白質(zhì)組分析的首要要求,將來自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測和分析。,2-,DE,技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。,生物學(xué)問題的提出,實驗?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計,實驗組和對照組樣品的制備,蛋白樣品的,IEF,和,PAGE,電泳分

3、離,圖像掃描和初步分析,感興趣蛋白點(diǎn)的切取,胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化,質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析,質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對,新,蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn),其它實驗的進(jìn)一步驗證,蛋白信息的初步獲得,蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線,蛋白質(zhì)樣品的制備,雙向電泳,圖像分析,轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白,凝膠中的蛋白,溶液中的蛋白,混合肽,蛋白質(zhì)質(zhì)量,N,端測序,肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù),肽,指紋圖,數(shù)據(jù)搜索,新的或已知蛋白,蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定,雙向電泳分析中的樣品制備,制備原則,：,應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。,防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。,防止在樣品制備過

4、程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。,完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。,盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。,可溶性樣品,固體組織樣品,細(xì)胞,不同樣品的基本處理方法,樣品的分級處理,通過采用亞細(xì)胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡單有效的處理是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。,樣品的溶解,是2-,DE,成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。,溶解的目標(biāo)：,1、,樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使

5、2-,DE,中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會下降）；,2、,溶解方法必須允許可能干擾2-,DE,分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；,3、,溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。,增加樣品溶解性的手段,變性劑：,通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。,表面活性劑：,經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑,SDS、,非離子去污劑,Triton X-100,和,NP-40、,兩性離子去污劑,CHAPS、OBG,等。其中,CHAP

6、S,和,SB3-10,最好。,還原劑：,在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的,DTT,或,-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（,TBP）,進(jìn)行還原。,起載體作用的兩性電解質(zhì)：,即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于,PI,點(diǎn)時會發(fā)生沉淀。,Carrier,ampholytes,的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2（,w/v)。,濃度過高會使,IEF,的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇不同

7、,pH,范圍的,IPG,膠條時，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的,pH,值與之相符合。,樣品液的準(zhǔn)備,標(biāo)準(zhǔn)液：,Reagent,Amount,8M urea,47,ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O,50,mM,DTT or,2mM TBP,385,mg or 500ul of 200mM TBP stock,4%CHAPS,2g,0.2%,carrier,ampholytes,See next table,0.0002%,bromophenol,blue,100,ul,of 0.1%stock,ddH,2,O,To 50ml,IPG pH Range,Bio-,

8、Lyte Ampholyte,(stock),range,Bio-,Lyte Ampholyte,(stock),Conc.(w/v),Sample Solution Volume,Per 5ml,Sample Solution Volume,Per 50ml,3-10,3/10,40%,25,l,250,l,4-7,4/6,40%,12.5,l,125,l,5/7,40%,12.5,l,125,l,3-6,3/5,40%,25,l,250,l,4/6,40%,12.,l,125,l,5-8,5/8,40%,25,l,250,l,7-10,7/9,40%,12.5,l,125,l,8/10,2

9、0%,25,l,250,l,Suggested Bio-,lyte ampholyte,composition for IPG use,Reagent,Amount,7M urea,4.1,ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H,2,O,2,M,Thiourea,760mg,2mM TBP,50ul of 200mM TBP stock,4%CHAPS,200,mg,0.2%,carrier,ampholytes,See table,0.0002%,bromophenol,blue,10,ul,of 0.1%stock,ddH,2,O,To 5ml,Mult

10、iple,chaotropic,agent solution preparation,Reagent,Amount,5M urea,2.9,ml of 8.5 stock or 1.5g urea in 3ml H,2,O,2,M,Thiourea,760mg,2mM TBP,50ul of 200mM TBP stock,2%CHAPS,100,mg,2%SB3-10,100mg,0.2%,carrier,ampholytes,See table,40,mM,Tris,24.2mg,0.0002%,bromophenol,blue,10,ul,of 0.1%stock,ddH,2,O,To

11、5ml,Multiple surfactant solution preparation,樣品中核酸的去除,對電泳的影響：,增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。,解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)（,SCA）,同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過超速離心來去除復(fù)合物。,亞蛋白質(zhì)組樣品的制備,用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。,順序抽提法：,根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力

12、的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。,第一步：用,Tris,堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；,第二步：把未溶解的,pellet,用標(biāo)準(zhǔn),IEF,樣品液溶解提取高疏水性蛋白；,第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（,W/W）。,特殊樣品的制備,低豐度蛋白的分離：,盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時的低豐度蛋白的量，但同時增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離。現(xiàn)常用預(yù)分級窄,pH,膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用,pH,梯度小于2個,pH,單位的,IPG,膠進(jìn)行,窄,pH,范圍的分離。,強(qiáng)堿

13、性蛋白質(zhì)（如核糖體）的處理：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊,pH,梯度的,IPG,膠條（如,pH312、4-12,或10-12）進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性,IPG,膠（如,pH10-12）,的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性,IPG,膠（如,pH3-12、4-12）,等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。,極端分子量的蛋白質(zhì)：,小于8,kD,和大于200,kD,的蛋白在常規(guī),IPG-2D,上不易看到，這可能是在,Tris,/,glycine,緩沖液中，樣品和游離的,dodelcyl,sulfate ions,持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛

14、狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。,一維固,相,pH,梯度等電聚焦,（,IEF with IPG）：,IPG,膠的材料是,Immobilines,，,為擁有,CH2=CH-CO-NH-R,結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中,R,包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在,pH310,不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的,IPG,試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成,pH,梯度。通過這種方式生成的,

15、IPG,不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的,IEF,分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。,IPG,膠條的重泡脹,泡脹的實質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入,IPG,內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的,IEF。,不同的加樣方法和加樣量會導(dǎo)致最終結(jié)果的差異：,Protean IEF cell、,IPGphor,等集成設(shè)備的使用：,20,mmol,/L DTT,墊片的使用：,溫度的選擇：,蛋白載樣量,影響,IPG,膠條對蛋白載樣量的因素包括：,待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。,電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。,待研究蛋白的豐度：,樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了

16、解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實驗才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。,IPG,膠條的,pH,范圍：,IPG,膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量,IPG Strip length,Analytical Load,(silver staining),Preparative Load,(,Coom,staining),7cm,10100,g/125,l,200500,ug,/125,l,11,cm,50200,g/185,l,2501000,ug,/185,l,17,cm,100300,g/300,l,13,mg/300,l,IPG IEF,中,pH,梯度的選擇,常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗確定。,預(yù)分步收集,細(xì)胞漿,細(xì)胞核,細(xì)胞膜,核糖體及其他特定細(xì)胞成份,細(xì)胞分泌成份,pH4-12,pH3-10,pH4-7,pH5-8,pH7-10,pH6-11,pH3-6,pH3-4,pH4-5,pH5-6,pH6-7,pH7-8,pH8-9,pH9-10,pH10-11,pH11-12,第一步,第二步,第三步,用窄,pH,范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白,陣列那些亞細(xì)胞定位位置