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1、,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),#,甾體激素類藥物的分析,甾體激素類藥物的分析,第1頁,概 述,激素,（,Hormone，,荷爾蒙）-是人體內(nèi)各種,內(nèi)分泌腺,所分泌一個(gè)生物活性物質(zhì)。激素作用于特定稱為靶器官組織、細(xì)胞上而發(fā)揮作用。假如激素分泌出現(xiàn)平衡失調(diào)，可使人體發(fā)生病變，如甲亢、糖尿病等。,甾體激素類藥物的分析,第2頁,甾體激素類藥品均含有,環(huán)戊烷駢多氫菲,母核，基礎(chǔ)骨架為：,第一節(jié) 基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)和分類,甾體激素類藥物的分析,第3頁,一、腎上腺皮質(zhì)激素,甾體激素類藥物的分析,第4頁,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：,A,環(huán)3位為羰基、4，5位間為雙鍵，形成共軛體系

2、，標(biāo)識(shí)為：,4,-3-,酮基,（又稱,、,不飽和酮,結(jié)構(gòu)），或?qū)懗?,4,-C,3,=O；,C,環(huán)11位上有羰基或羥基；,D,環(huán)17位上有,-,醇酮基,側(cè)鏈（），而且多數(shù)還具,-,羥基,。,甾體激素類藥物的分析,第5頁,二、雄性激素及蛋白同化激素,（1）臨床常見雄性激素為,睪丸素,（睪酮）衍生物，如丙酸睪丸素、苯乙酸睪丸素。,（2）常見蛋白固化激素有苯丙酸諾龍（苯丙酸去甲睪酮）、康力龍、康復(fù)龍等。,甾體激素類藥物的分析,第6頁,（1）結(jié)構(gòu)特征（,兩種激素之共同點(diǎn),）：,A,環(huán)3位,4,-3-,酮基,（又稱,、,不飽和酮,結(jié)構(gòu)）；,D,環(huán)17位上無側(cè)鏈，多為羥基。,（2）,兩種激素,結(jié)構(gòu)之不一樣

3、點(diǎn)：,蛋白同化激素10位上大多無角甲基，有4位有鹵素。,甾體激素類藥物的分析,第7頁,（三）孕激素,又稱黃體素或孕酮，臨床上主要為黃體酮、己酸孕酮、安宮黃體酮和甲地孕酮等。,A,環(huán),4,-3-,酮基,（,、,不飽和酮,結(jié)構(gòu)）；,D,環(huán)17位上有,甲基酮,，有些含有羥基；,甾體激素類藥物的分析,第8頁,（四）雌激素,臨床上常見,雌二醇,及其各種酯和炔雌醇及其衍生物，以及活性雌酮、雌三醇等。,A,環(huán)為苯環(huán)，3位上有酚羥基,，10位無角甲基；,D,環(huán)17位上有羥基或羰基，有還有乙炔基。,甾體激素類藥物的分析,第9頁,腎上腺皮質(zhì)激素,雄性激素與,蛋白同化激素,雌激素,孕激素,C,3,C,3,O,4,-

4、3=O,或,1，4,-3O,C,3,O,4,-3=O,C,3,OH,A,環(huán)為苯環(huán),C,3,O,4,-3=O,C,10,C,13,有兩個(gè)角甲基,有兩個(gè),有一個(gè)（C13）,C,13,有一個(gè),有兩個(gè)角甲基,C,17,醇酮基,OH,或其酯,OH,或有,C=CH,甲酮基,甾體激素類藥物的分析,第10頁,第二節(jié) 判別試驗(yàn),（一）與強(qiáng)酸呈色反應(yīng)（甾核）,許多甾體激素可與硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸等呈色，主要與,硫酸,等呈色，機(jī)理可能是酮基質(zhì)子化反應(yīng)。,方法：取樣品少許 觀察顏色、熒光,再觀察,H,2,SO,4,加水稀釋后,一、化學(xué)判別法,甾體激素類藥物的分析,第11頁,（二）官能團(tuán)反應(yīng),1,、,C,17,醇酮

5、基反應(yīng),皮質(zhì)激素,C,17,-,-,醇酮基含有還原性,，,能與許多氧化劑，如氨制,AgNO3、,斐林試劑、四氮唑鹽反應(yīng)。其中以,四氮唑鹽,顯色反應(yīng)最為常見，不但可用作層析法顯色劑，還可用于含量測(cè)定。,甾體激素類藥物的分析,第12頁,1、與堿性酒石酸銅試液反應(yīng),銅（）在堿性條件下可被還原物質(zhì)還原為紅色氧化亞銅沉淀。如：中國藥典判別氫化可松,2,Cu +4OH,2+,-,+,Cu,2,O +H,2,O,橙紅色,甾體激素類藥物的分析,第13頁,2、與氨制硝酸銀試液反應(yīng),銀（）在堿性條件下可被還原物質(zhì)還原為黑色金屬銀沉淀。如：中國藥典判別醋酸去氧皮質(zhì)酮,2,Ag +2OH,+,-,NH,3,+2,Ag

6、 +CH,3,COOH,黑色,甾體激素類藥物的分析,第14頁,3、與堿性四氮唑鹽顯色反應(yīng),氯化三苯四氮唑（或藍(lán)四氮唑）在堿性條件下可被還原物質(zhì)還原為紅色單甲鐕（或藍(lán)色雙甲鐕）。,H,2,O,+,OH,+,-,+,+,CH,3,COOH,紅色,甾體激素類藥物的分析,第15頁,2,、酮基呈色反應(yīng),機(jī)理：分子中,C,3,=O,和,C,20,=O,能與普通羰基試劑如：2，4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼等顯色。主要是,C,3,=O,與異煙肼,縮合,生成異煙腙而呈黃色。,甾體激素類藥物的分析,第16頁,鹽酸酸性條件下：,4,-3O,：即刻反應(yīng),1，4,-3O,：13,min,C20,O,：長時(shí)間,甾體激

7、素類藥物的分析,第17頁,3,、甲酮基或活性亞甲基反應(yīng),含,H,3,C-C=O（,甲酮基,）和,活性亞甲基,激素類藥品與亞硝基鐵氰化鈉、芳香醛、間二硝基苯反應(yīng)呈色。,（1）甲酮基呈色反應(yīng)：,如黃體酮 藍(lán)紫色，其它甾體呈淡橙色或不顯色。（專屬反應(yīng)）,亞硝基鐵氰化鈉,甾體激素類藥物的分析,第18頁,（2）亞甲基反應(yīng)：,如硫酸普拉睪酮,紫紅色,乙醇,間二硝基苯,氫氧化鈉,甾體激素類藥物的分析,第19頁,4,、酚羥基呈色反應(yīng),：,A,環(huán)為苯環(huán)雌激素+重氮苯磺酸鹽 紅色偶氮染料。,比如：,+,H,+,苯甲酸雌二醇,+,甾體激素類藥物的分析,第20頁,5、炔基沉淀反應(yīng),含炔基甾體激素，如炔雌醇、炔諾酮，遇

8、硝酸銀試液，即生成白色炔雌醇銀鹽沉淀及白色炔諾酮銀沉淀。,6、鹵素反應(yīng),（,有機(jī)氟呈色反應(yīng)）,一些含有氟甾體激素藥品（如醋酸氟輕松、醋酸地塞米松等），以氧瓶燃燒后生成無機(jī)氟化物，再與茜素氟藍(lán)及硝酸亞鈰起呈色反應(yīng)。,甾體激素類藥物的分析,第21頁,7、酯反應(yīng),一些甾體激素類藥品含有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯結(jié)構(gòu)，可先行水解，依據(jù)水解產(chǎn)物來判別。本類藥品,C17,或,C21,位上羥基酯，可發(fā)生水解反應(yīng)，生成對(duì)應(yīng)酸與醇，如為醋酸酯，水解后生成醋酸可與乙醇反應(yīng)，生成有香氣醋酸乙酯。,戊酸或己酸酯類水解后可生成有特臭戊酸或己酸，進(jìn)行判別。,甾體激素類藥物的分析,第22頁,（一）縮氨基脲生成,如苯丙酸諾龍（甾

9、酮）+縮氨脲,苯丙酸諾龍縮氨脲,-,H,2,O,（二）酯水解,如丙酸睪丸素 睪丸素,醇制,KOH,H,2,O,水解,二、制備衍生物測(cè)定熔點(diǎn),利用甾醇、甾酮類藥品與一些試劑反應(yīng)生成酯、肟、縮氨脲，或用醇制堿液水解甾體酯類生成對(duì)應(yīng)母體，然后測(cè)定它們?nèi)埸c(diǎn)進(jìn)行判別。,甾體激素類藥物的分析,第23頁,三、紫外分光光度法,一些甾體激素藥品分子中存在,和 共軛系統(tǒng)，在紫外光區(qū)有特征吸收。,甾體激素類藥物的分析,第24頁,四、紅外吸收光譜,普通是將供試品所繪制,IR,光譜與藥典附錄中收載標(biāo)準(zhǔn),IR,圖譜進(jìn)行對(duì)照比較（多采取,KBr,壓片法），完全一致者即為同一藥品。,五、薄層色譜,主要用于甾體激素判別、純度檢

10、驗(yàn)及含量測(cè)定前分離和制劑穩(wěn)定性研究，含有簡便、快速、靈敏、分離度高等優(yōu)點(diǎn)。,甾體激素類藥物的分析,第25頁,六、高效液相色譜法,在一定色譜條件下，比較甾體激素樣品與其對(duì)照品峰保留時(shí)間進(jìn)行判別。普通都要求在含量測(cè)定項(xiàng)下高效液相色譜圖中，供試品峰保留時(shí)間進(jìn)行應(yīng)與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致。,甾體激素類藥物的分析,第26頁,第三節(jié) 特殊雜質(zhì)檢驗(yàn),甾體激素類藥品多由其它甾體化合物或結(jié)構(gòu)類似其它甾體激素經(jīng)結(jié)構(gòu)改造而來，所以可能帶來原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物以及試劑和溶劑等雜質(zhì)。有些雜質(zhì)與該甾體激素藥品結(jié)構(gòu)類似，也含有一定藥理作用而又互不相同，所以在甾體激素類藥品質(zhì)量控制中，,“,其它甾體,”,程度檢驗(yàn)顯得

11、很主要。,甾體激素類藥物的分析,第27頁,一、其它甾體檢驗(yàn),我國藥典和一些國家近版藥典，,采取,TLC,法或,HPLC,法,檢驗(yàn)甾體激素類藥品中“其它甾體”。因?yàn)樵摲ê泻啽?、快速、靈敏、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，而廣泛用于甾體激素藥品判別、檢驗(yàn)結(jié)構(gòu)相同雜質(zhì)等質(zhì)量控制方法。,采取高低濃度對(duì)比法進(jìn)行，即供試液與對(duì)照液均為同一物，但僅濃度有所不一樣。詳見,P251252。,結(jié)果判斷：中國藥典正文中對(duì)供試品要求了雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目和每個(gè)雜質(zhì)斑點(diǎn)不得超出限量。,甾體激素類藥物的分析,第28頁,二、硒檢驗(yàn),本類中一些藥品在后工序用二氧化硒脫氫，,故應(yīng)檢驗(yàn)硒。,三、殘留溶劑檢驗(yàn)（甲醇和丙酮檢驗(yàn)）,此為地塞米松磷酸鈉殘留

12、溶劑檢驗(yàn)，中國藥典采取,GC,法檢驗(yàn)。,四、游離磷酸鹽檢驗(yàn),本法系利用在酸性溶液中磷酸鹽中磷酸鹽與鉬酸銨作用生成磷鉬酸銨，再經(jīng)過還原形成磷鉬酸藍(lán)（鉬藍(lán)）在740,nm,處有最大吸收。,甾體激素類藥物的分析,第29頁,第四節(jié) 含量測(cè)定,常見方法有容量法、比色法、紫外分光光度法、熒光法、氣相色譜法、高效液相色譜等。其中,紫外分光光度法,、,四氮唑鹽比色法,、異煙肼法、鐵-酚試劑比色法及,HPLC,法在藥典中都有收載。,甾體激素類藥物的分析,第30頁,一、高效液相色譜法,各國藥典采取反相高效液相法測(cè)定，方法普通為內(nèi)標(biāo)法。填充劑為十八烷基硅烷化鍵合硅膠；流動(dòng)相多為甲醇-水、乙腈-水-異丙醇、甲醇-四氫

13、呋喃-水等混合溶劑；檢測(cè)器均為紫外光檢測(cè)器，檢測(cè)波長為240,nm,或254,nm。,為了提升分離效率、取得滿意峰形，有時(shí)在流動(dòng)相中加入醋酸緩沖液或磷酸緩沖液調(diào)整流動(dòng)相,pH,值。,甾體激素類藥物的分析,第31頁,二、紫外分光光度法,本類藥品分子結(jié)構(gòu)中有共軛體系,4,-3-酮、,1，4,-3-酮、苯環(huán)、酚羥基等結(jié)構(gòu)。,如皮質(zhì)激素、雄性激素、孕激素及口服避孕藥中有分子中,、,不飽和酮結(jié)構(gòu)，在紫外光區(qū),240,nm,附近,有最大吸收；含有苯酚結(jié)構(gòu)雌激素在,280,nm,附近,有最大吸收，均可用紫外分光光度法測(cè)定含量。,甾體激素類藥物的分析,第32頁,1,、方法原理,甾體激素,C,3,上酮基,及一些

14、其它位置上酮基都能在,酸性,條件下與,羰基試劑,如異煙肼、2，4-二硝基苯肼及氨基脲等起,縮合反應(yīng),，可作為含量測(cè)定依據(jù)。異煙肼是當(dāng)前廣泛采取一個(gè)，異煙肼（,INH）,試劑可與一些甾酮在酸性條件下形成,黃色,異煙腙，在一定波優(yōu)點(diǎn)含有最大吸收。,（一）異煙肼比色法,三、比色法,甾體激素類藥物的分析,第33頁,一些含有,4,-3-酮和,C,20,酮基甾體激素可形成,雙腙,，如黃體酮、可松、氫化可松等。,（,二）測(cè)定方法,分別制備供試品、對(duì)照品溶液，再分別與異煙肼溶液反應(yīng)，在,420nm,波優(yōu)點(diǎn)罰別測(cè)定吸收度并計(jì)算結(jié)果。,甾體激素類藥物的分析,第34頁,反應(yīng)原理,皮質(zhì)激素,C,17,-,-醇酮基,含

15、有,還原性,，在強(qiáng)堿性溶液中能將四氮唑鹽定量地還原為,有色甲鐕,。生成顏色隨所用試劑和條件不一樣而定，多為藍(lán)色或紅色。,（二）四氮唑比色法,甾體激素類藥物的分析,第35頁,（一）方法原理,雌激素含量測(cè)定，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用,Kober,反應(yīng),。該法是雌激素在硫酸作用下，經(jīng)過質(zhì)子化、分子重排、脫氫等作用形成共軛多烯而顯色。,（三）,Kober,反應(yīng)比色法,甾體激素類藥物的分析,第36頁,反應(yīng)分為以下兩步:,被硫酸氧化而形成,黃色,產(chǎn)物；,加水或稀硫酸稀釋后繼續(xù)氧化最終形成,紅色產(chǎn)物,。,（二）測(cè)定方法：炔雌醇片,甾體激素類藥物的分析,第37頁,本類藥品,藥代學(xué)研究,、,生物利用度研究,及,違禁藥品監(jiān)測(cè)

16、,等均需測(cè)定生物樣品中甾體激素藥品。,生物樣品中本類藥品分析要求方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，,因本類藥品給藥劑量小，血藥濃度很低（,ng,級(jí)或更低）。體內(nèi)有內(nèi)源性甾體激素，故測(cè)定方法多采取,GC、HPLC,法測(cè)定，尤其是采取,GC-MS、HPLC-MS,法。使用,MS,作為檢測(cè)器，分析方法專屬性和靈敏度更高。,采取,GC-MS,法對(duì)諾龍等19種蛋白同化激素人體代謝進(jìn)行了研究。,書本,P261,有蛋白同化激素(,GC-MS,)及孕激素（,HPLC,）測(cè)定舉例。,四、生物樣品中甾體激素分析,甾體激素類藥物的分析,第38頁,幾個(gè)測(cè)定方法特點(diǎn)及其應(yīng)用,甾體激素類藥物的分析,第39頁,方法名稱,測(cè)定基團(tuán),主要試劑,甾體類別,高效液相色譜法,4,-3=O,或芳香,A,環(huán),C,18,柱,甲醇（乙腈）水,各類甾體激素,紫外分光光度法,4,-3=O,或,1，4,-3O,A,環(huán)為芳香環(huán),溶劑（無水乙醇、乙醇、甲醇）,腎上腺皮質(zhì)激素,雄性激素,雌性激素,口服避孕藥,四氮唑比色法,C,17,醇酮基,三苯,四氮唑鹽,四氮唑鹽,氫氧化四甲基銨,腎上腺皮質(zhì)激素,異煙肼比色法,4,-3=O,或,1，4,-3O,異煙肼,鹽