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1、,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,第二章 色譜法的基本原理,Principles of Chromatography,本章基本要求,理解混合物中各組分在色譜柱內(nèi)分離的原因；,了解色譜流出曲線和術(shù)語(yǔ)；,理解柱效率的物理意義及計(jì)算方法；,理解速率理論方程對(duì)實(shí)際分離的指導(dǎo)意義；,掌握分離度的計(jì)算方法及影響分離度的色譜參數(shù)。,2.1,概 述,2.1.1,色譜法發(fā)展史,色譜法是俄國(guó)植物學(xué)家Tswett（茨維特）于1903年首先提出的。他把植物色素的石油醚抽提液倒入一根裝有固體碳酸鈣顆粒（固定相）的豎直玻璃管（色譜柱）中，并再?gòu)墓艿纳喜考尤爰兊氖兔?/p>

2、（流動(dòng)相），任其自由流下。這時(shí)植物色素的抽提液沿玻璃管流動(dòng)，在管內(nèi)形成具有不同顏色的色帶，每個(gè)色帶代表不同的組分。,-“色譜”（色層）因而得名,胡蘿卜素（橙色）,植物色素,葉綠素（綠色）,葉黃素（黃色）,石油醚,CaCO,3,固定相,1941年，Martin、Syuge發(fā)明了液液色譜。,1952年，James、,Martin,發(fā)明了氣相色譜。,20世紀(jì)60年代，出現(xiàn)了高效液相色譜。,色譜法：,借助在兩相間分配系數(shù)的差異，而使混合物中各組分獲得分離的技術(shù)稱為色譜分離技術(shù)。,固定相：,填充柱內(nèi)的填料（固體或液體）。,流動(dòng)相：,攜帶樣品流過固定相(氣體、液體和超臨界流體)。,色譜柱：,裝有固定相的柱

3、。,色譜分離過程：,當(dāng)流動(dòng)相中攜帶混合物經(jīng)過固定相時(shí)，與固定相發(fā)生作用，由于各組分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)（溶解度、極性、蒸汽壓和吸附能力等）不同，這種相互作用產(chǎn)生強(qiáng)弱的差異。在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相,滯留時(shí)間,長(zhǎng)短不同，按先后不同的次序從固定相中流出。,幾個(gè)基本術(shù)語(yǔ)：,氣相色譜,-用氣體作流動(dòng)相,液相色譜,-用液體作流動(dòng)相,由于固定相可分為固體吸附劑和涂在固體擔(dān)體上或毛細(xì)管內(nèi)壁上的液體固定相，故可將色譜法分為下述四類：,氣固色譜,氣體 固體,流動(dòng)相 固定相,液體 液體,1、按兩相所處的狀態(tài)分類,液-固 色譜,氣-液 色譜,液液色譜,2.1.2 色譜法分類,柱色譜,：固定相裝在柱管內(nèi)。它又可分

4、為填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜。固定相裝在色譜柱（玻璃管或毛細(xì)管）內(nèi)。,紙色譜,：用濾紙作固定相或載體，把試樣液體滴在濾紙上，用溶劑將它展開，根據(jù)其在紙上有色斑點(diǎn)的位置與大小，進(jìn)行鑒定與定量測(cè)定。,薄層色譜,：將固定相研磨成粉末，再涂敷成薄膜。樣品的分離形式類似紙色譜。,2、按固定相形狀分類,吸附色譜,（L-S，G-S）：利用吸附劑對(duì)不同組分物理吸附性能的差異進(jìn)行分離。,分配色譜,（L-L，G-L）：利用不同組分在兩相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離。,在液-液分配色譜中，根據(jù)流動(dòng)相和固定相相對(duì)極性不同，又分為正相分配色譜和反向分配色譜。,離子交換色譜,（L-S）：利用組分離子與離子交換劑的交換能力不同進(jìn)

5、行分離。,空間排阻色譜,（凝膠色譜法，L-S）：用多孔物質(zhì)對(duì)不同大小分子的阻礙作用進(jìn)行分離。,固定相是一種分子篩或凝膠，利用各組分的分子體積大小不同而進(jìn)行分離的方法。,親和色譜,：利用不同組分與固定相的高專屬性親合力進(jìn)行分離的技術(shù)，常用于蛋白質(zhì)的分離。,3、按分離過程的物理化學(xué)原理分類,色譜法的分類大致如下：,根據(jù)以上所述，將色譜法的分類總結(jié)于下表中：,2.2 色譜分離原理,2.2.1 分配系數(shù)和分配比,分配系數(shù)：,分配比,k,（又稱容量因子）,定義：在一定的溫度、壓力下，組分在氣液兩相間達(dá)平衡 時(shí)，分配在液相中的重量與分配在氣相中的重量之比。即,s,：固定相,m,：流動(dòng)相,k,隨柱溫、柱壓、

6、相體積變化，由組分及固定液的熱力學(xué)性質(zhì)決定,：相比,進(jìn)樣,AB空氣,B,A,A+B,流動(dòng)相,B,B,A,流動(dòng)相,固定相,檢測(cè)和紀(jì)錄,2.2.2 分離原理,例：氣相色譜法載氣（即流動(dòng)相，是一種不與待測(cè)物作用、用來載送試樣的惰性氣體，如氮?dú)獾龋┹d著待分離的試樣通過色譜柱中的固定相，使試樣在兩相中發(fā)生反復(fù)多次的分配，最后使各組分分離，然后分別檢測(cè)，記錄各自的響應(yīng)信號(hào)。,2.3 色譜流出曲線,色譜流出曲線（色譜圖）即色譜柱流出物通過檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間。,峰高,色譜峰,保留時(shí)間（分）,響應(yīng)值,1、有關(guān)術(shù)語(yǔ),基線：柱中僅有流動(dòng)相通過時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊

7、號(hào)的記錄值，即圖中O-,t,線。穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。,峰高：色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，,h,標(biāo)準(zhǔn)偏差,峰面積,A,半峰寬,Y,1/2,=2.354,峰底寬,Y,=4,、,Y,1/2,、,Y,：區(qū)域?qū)挾?死時(shí)間,t,m,:,不被固定相吸附或溶解的組分進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度最大值所需的時(shí)間。對(duì)于氣相色譜，常把空氣(TCD)和甲烷(FID)從進(jìn)樣到出峰的時(shí)間稱為,t,m,。如圖中O-A。這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，其流速與流動(dòng)相的流速接近。測(cè)定流動(dòng)相平均線速度,時(shí)可用柱長(zhǎng),L,與死時(shí)間,t,m,的比值計(jì)算。,2、保留值,保留時(shí)間,t,R,試樣從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)色譜峰極

8、大值所需要時(shí)間。如圖中,O-B,。它相應(yīng)于樣品到達(dá)檢測(cè)器所需的時(shí)間。,t,R,=,t,R,+,t,m,調(diào)整保留時(shí)間,t,R,扣除死時(shí)間后的組份保留時(shí)間，,即,t,R,=,t,R,t,m,組分在色譜柱中的保留時(shí)間,t,R,包含了組分隨流動(dòng)相通過柱子所需的時(shí)間和組分在固定相中滯留的時(shí)間；,t,R,實(shí)際上是組分在固定相中滯留的時(shí)間。單位(s)或(cm)。,死體積,V,m,不能被固定相滯留的（惰性）組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值時(shí)所消耗的流動(dòng)相的體積。死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速,F,0,（,L,min）計(jì)算：,V,m,=,t,m,F,0,保留體積,V,R,從進(jìn)樣開始到柱后被測(cè)組份出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所通,

9、過的流動(dòng)相體積。如下：,V,R,=,t,R,F,0,調(diào)整保留體積,V,R,某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調(diào)整保留體積,V,R,=,t,R,F,0,或,V,R,=,V,R,-,V,m,相對(duì)保留值,2,1,某組份2與組份1的調(diào)整保留值之比，是一個(gè)無因次量。,2,1,的大小與兩組分的,選擇性,有關(guān)。,2,1,越大，選擇性越好，越容易分離。,2,1,只與,柱溫,及,固定相,的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無關(guān)。因此是色譜法中，特別是氣相色譜法中廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。,從色譜流出曲線上，可以得到許多重要信息：,根據(jù)色譜峰個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少個(gè)數(shù)。,根據(jù)色譜峰的保留值

10、（或位置），可以進(jìn)行定性分析。,根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析。,色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)。,色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)。,在自然科學(xué)上，科學(xué)理論：,假設(shè),理論模型(數(shù)學(xué)表達(dá)式),實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,修改模型,完善,1.塔板理論假設(shè),在每塊塔板上氣液平衡是瞬間建立的。,載氣以脈沖式(塞子式)進(jìn)入色譜柱進(jìn)行沖洗，每次恰好為一個(gè)塔板體積。,所有組分開始都加在第零號(hào)塔板上，且不考慮沿色譜柱方向的縱向擴(kuò)散。,在所有塔板上同一組分的分配系數(shù)是常數(shù)，和組分的量無關(guān)。,柱分成幾段，,n,為理論塔板數(shù)，每段高為,H,，柱長(zhǎng)為,L,，,n,=,L

11、,/,H,。,2.4 塔板理論,假定：,K,=1,V,s,/,V,m,=1,k,=1,n,=5 進(jìn)樣量,w,=1,w=1g,1V,2V,3V,4V,分布有一最大，兩邊逐漸減小,最大及整個(gè)分布曲線向后推移,流出曲線方程,（塔板理論方程）,在此檢測(cè)得到位移隨時(shí)間變化曲線,這一理論得到結(jié)果：,1分布有一最大，兩邊逐漸減?。?2最大及整個(gè)分布曲線向后推移；,3流出曲線方程(也稱塔板理論方程)，即,數(shù)學(xué)表達(dá)式：,C,：不同流出體積時(shí)的組分濃度,m,：進(jìn)樣量,V,R,：保留體積,N,：塔板數(shù),V,：流出體積,S,V(t,x),被測(cè)物流出色譜柱時(shí)流動(dòng)相中被測(cè)物濃度隨體積(或時(shí)間)的變化曲線：,在氣相色譜柱內(nèi)

12、，理論塔板數(shù)一般達(dá)10,3,10,6,。塔板數(shù)越多，其流出曲線越接近于正態(tài)分布。根據(jù)塔板理論可以導(dǎo)出,N,與色譜峰半寬度或峰底寬度的關(guān)系：,理論塔板高度,H,：,色譜峰,W,越小，,N,越大，,H,越小，柱效能越高。因此，,N,和,H,是描述,柱效能,的指,標(biāo)。,在實(shí)際工作中，計(jì)算出來,的,N,和,H,值時(shí),有時(shí)并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因?yàn)橛?t,R,計(jì)算時(shí)，沒有扣除死時(shí)間,t,m,，應(yīng)予扣除。,所以用,t,R,代替,t,R,計(jì)算出來的,N,值稱為有效理論塔板數(shù),N,eff。,為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)色譜柱效能，宜采用有效塔板數(shù),N,eff,和有效塔板高度,H,eff,。有效塔板數(shù),N,eff,

13、和有效塔板高度,H,eff,消除了死體積,影響，較真實(shí)的反映了色譜柱的好壞。,有效塔板高度：,根據(jù),t,R,=,t,R,-,t,m,，,k,=,t,R,/,t,m，,t,R,=,t,m,(1+,k,)，可得,塔板理論的,成功與局限,成功,導(dǎo)出流出曲線數(shù)學(xué)表達(dá)式(模型)；,解釋了流出曲線形狀、濃度極大點(diǎn)；,提出了評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)(,N,)及其計(jì)算公式。,局限,僅考慮了熱力學(xué)因素，沒有考慮動(dòng)力學(xué)因素；,不能說明影響柱效的原因及譜帶擴(kuò)張的原理；,不能說明流速對(duì)柱效的影響，實(shí)驗(yàn)測(cè)得流速不同時(shí),N,和,H,不同。,速率理論,2.5 速率理論,1956年荷蘭化學(xué)家Van Deemter等在研究氣-液色譜時(shí)，

14、討論擴(kuò)散傳質(zhì)等與色譜過程物料平衡和質(zhì)量平衡的關(guān)系，考察溶質(zhì)通過色譜體系總濃度的變化。他提出了色譜過程動(dòng)力學(xué)理論,速率理論,。隨后Giddings吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程，認(rèn)為把色譜過程看作分子,無規(guī)則運(yùn)動(dòng)的隨機(jī)過程,，從而在動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。,該理論模型對(duì)氣相、液相色譜都適用。,Van Deemter方程的數(shù)學(xué)簡(jiǎn)化式為:,式中：,u,為流動(dòng)相的線速度；,A,，,B,，,C,為常數(shù),A,渦,流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù),B,縱向分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù),C,傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù),（,C,C,s,C,m,)。其中,C,s,：固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)；,C,m,：流

15、動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。,A=2d,P,填充不規(guī)則因子,d,P,填充物顆粒的平均直徑。,影響,A,的因素：,填充物顆粒大小,d,P,和填充均勻性,(取決于填充物顆粒的大小分布和裝柱情況）有關(guān),與載氣性質(zhì)、線速和組分無關(guān)。,減小渦流擴(kuò)散提高柱效的有效途徑：,使用適當(dāng)?shù)牧６惹翌w粒均勻的擔(dān)體，并盡量填充均勻。,A,B,渦流擴(kuò)散項(xiàng),A,分子擴(kuò)散項(xiàng),B/u,B=2,D,g,固定相填充在柱內(nèi)后使氣體擴(kuò)散路徑變彎曲的因素.,D,g,組分在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（,cm,2,/s）,。,填充柱,=0.5-0.7 毛細(xì)管柱,=1.0,分子量大的組分D,g,小，D,g,反比于載氣密度（分子量）,的平方根,故采用分子量較大的

16、載氣可使B項(xiàng)降低。,保留時(shí)間長(zhǎng),分子擴(kuò)散,項(xiàng)對(duì)色譜峰變寬的影響顯著.,C,g,u,-氣相傳質(zhì)阻力項(xiàng)；,C,g,-氣相傳質(zhì)阻力系數(shù);,C,l,u,-液相傳質(zhì)阻力項(xiàng)；,C,l,-液相傳質(zhì)阻力系數(shù),傳質(zhì)阻力項(xiàng),Cu,C u =C,g,u+C,l,u(C,g,+C,l,)u,氣相傳質(zhì)過程：,氣相傳質(zhì)阻力項(xiàng)與填充物粒度的平方成正比，與組分在載氣流中的擴(kuò)散系數(shù)成反比，因此采用粒度小的填充物和分子量小的氣體作載氣可提高柱效。,液相傳質(zhì)過程：,減小液膜厚度，增大組分在液相中的擴(kuò)散系數(shù)，均可提高柱效。,速率理論的要點(diǎn),被分離組分分子在色譜柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣-液兩相間分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展、柱效下降的主要原因。,通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。,速率理論為色譜分離和操作條件的選擇提供了理論指導(dǎo)，闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。,各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響。因此，選擇最佳條件，才能使柱