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1、實驗二、植物總實驗二、植物總RNARNA的提取的提取一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康模?1.了解真核生物基因組RNA提取的一般原理。2.掌握Trizol提取RNA的方法和步驟。3.了解RNA純度的檢測。 二、一般原理二、一般原理 Trizol 試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總單相的快速抽提總RNA的試劑，在勻漿和的試劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細胞、降解蛋白質(zhì)和裂解過程中，能在破碎細胞、降解蛋白質(zhì)和其它成分其它成分,使蛋白質(zhì)與核酸分離使蛋白質(zhì)與核酸分離,失活失活RNA酶酶,同時能保持同時能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、的完整性。在氯仿抽提、離心分離

2、后，離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀管后用異丙醇沉淀RNA。 TrizolTrizol試劑配制試劑配制 苯酚飽和液（苯酚飽和液（38%38%）-380-380ml/L ml/L 硫氰酸胍鹽（硫氰酸胍鹽（0.80.8M-118.16gM-118.16g） 硫氰酸銨（硫氰酸銨（0.40.4M M）- 76.12g - 76.12g 醋酸鈉醋酸鈉pH 5pH 5（0.1M0.1M）- 33.4ml - 33.4ml 甘油甘油 50 50ml ml 加水至加水至1 1L L 。 三、材料三、材料 植物組織植物組織四、設(shè)備四、設(shè)備 移液器，冷凍高速離心機，低移液

3、器，冷凍高速離心機，低溫冰箱，臺式高速離心機，液氮罐，溫冰箱，臺式高速離心機，液氮罐，陶瓷研缽，陶瓷研缽，1.5ml離心管。離心管。 五、試劑五、試劑 1、無RNA酶的無菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180 2小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。 2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。 3、氯仿:異戊醇 24 : 1 （v/v) 、氯仿。4、異丙醇、無水乙醇、70乙醇。 5、Trizol試劑。六、操作步驟六、操作步驟1、取植物嫩葉，液氮研磨，每取植物嫩葉，液氮研磨，每1.5m

4、l tube分裝分裝0.1克樣品；克樣品；.每管每管加入加入0.5ml Trizol液，迅速混勻，液，迅速混勻，注意樣品總體積不能超過所用注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的體積的10%。 、室溫下靜置、室溫下靜置5分鐘分鐘以利于核酸蛋白質(zhì)復(fù)以利于核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體的解離合體的解離 、加入、加入0.5ml的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管搖蕩離心管15秒，室溫靜置秒，室溫靜置3分鐘分鐘 、 10000r/min離心離心5分鐘分鐘、取上清液（水相）轉(zhuǎn)入一新的離心管，加、取上清液（水相）轉(zhuǎn)入一新的離心管，加入等體積異丙醇，室溫放置入等體積異丙醇，室溫放置3分鐘

5、，分鐘，10000r/min離心離心5分鐘。分鐘。 、棄去上清液，加入至少、棄去上清液，加入至少1ml的的70%乙醇，渦乙醇，渦旋混勻，旋混勻，4下下10000r/min離心離心5分鐘。分鐘。、小心棄去上清液，然后室溫或真空干、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低低RNA的溶解度。然后將的溶解度。然后將RNA溶于溶于20微升微升TE或或DEPC處理過的水中，必要時可處理過的水中，必要時可55-60水溶水溶 10分鐘。分鐘。RNA可進行可進行mRNA分離，或貯存于分離，或貯存于70%乙乙醇并保存于醇并保存于-70七、檢測七

6、、檢測1、DNA的紫外分光光度計檢測的紫外分光光度計檢測OD260/OD2801.81OD260=40 g/mL DNA2 2、甲醛變性瓊脂糖電泳檢測、甲醛變性瓊脂糖電泳檢測八、注意事項八、注意事項（1）Trizol、DEPC等有毒，與皮膚接觸會引起傷害。操作過程帶手套，在通風(fēng)條件下操作。（2）避免帶入RNase進入樣品帶手套，別用手碰任何與樣品接觸的物品。使用新的已滅活RNase的塑料器皿與用具。 （3）愛護儀器設(shè)備,安全操作作業(yè)：作業(yè)：1、RNA酶的變性或失活劑有那些？其中酶的變性或失活劑有那些？其中在總在總RNA的抽提中主要可用哪幾種？的抽提中主要可用哪幾種？2、怎樣從總、怎樣從總RNA中進行中進行mRNA的分離和的分離和純化。純化。補充：檢測方法.此外分光光度計檢測值時，相當(dāng)于含g/mL DNA.時，DNA較純小于.時，蛋白含量較高，大于.則含有或有斷裂.瓊脂糖電泳檢測