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1、蛋白質(zhì)概述蛋白質(zhì)概述一、蛋白質(zhì)的化學組成與分類一、蛋白質(zhì)的化學組成與分類二、蛋白質(zhì)的形狀、大小和分子量二、蛋白質(zhì)的形狀、大小和分子量三、三、蛋白質(zhì)功能的多樣性蛋白質(zhì)功能的多樣性蛋白質(zhì)的化學組成與分類蛋白質(zhì)的化學組成與分類1.1.元素組成：元素組成：蛋白質(zhì)是一類含氮有機化合物蛋白質(zhì)是一類含氮有機化合物，除含，除含有碳、氫、氧外，還有有碳、氫、氧外，還有氮氮和少量的硫。某些蛋白質(zhì)還和少量的硫。某些蛋白質(zhì)還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、鉬、鋅和銅含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、鉬、鋅和銅等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為： 碳碳 5050-55%

2、-55% 氫氫 6.5-7.36.5-7.3 氧氧 19-2419-24 氮氮 16%16% 硫硫 0-30-3 其他其他 微微 量量蛋白質(zhì)的含氮量蛋白質(zhì)的含氮量大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%16%，這是這是蛋白質(zhì)元素組成的一個特點，也是蛋白質(zhì)元素組成的一個特點，也是凱氏凱氏（KjedahlKjedahl）定氮法）定氮法測定蛋白質(zhì)含量的計測定蛋白質(zhì)含量的計算基礎。算基礎。所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質(zhì)的大概含量：樣品中蛋白質(zhì)含量樣品中蛋白質(zhì)含量= =蛋白氮蛋白氮 6.256.256.256.25為為蛋白質(zhì)系數(shù)蛋白質(zhì)系數(shù)，即，即1 1克氮所代表的蛋克氮所

3、代表的蛋白質(zhì)量（克數(shù)）白質(zhì)量（克數(shù)）蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類n一、按化學組成分一、按化學組成分n1、單純蛋白單純蛋白：只含蛋白成分：只含蛋白成分n2、綴合蛋白綴合蛋白：蛋白：蛋白+輔基輔基單純蛋白單純蛋白n單純蛋白只含由單純蛋白只含由 - -氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。n1 1，清蛋白和球蛋白：，清蛋白和球蛋白：albumin and globulin廣泛存廣泛存在于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，在于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。易溶于稀酸中。n2 2，谷蛋白，谷蛋白( (glutelin) )和醇溶谷蛋白和醇溶谷蛋

4、白( (prolamin) )：植：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于于70708080乙醇中。乙醇中。n3 3，精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在與細胞核中。，精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在與細胞核中。n4 4，硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織，硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。n由單純蛋白與其它非蛋白成分結合而成。由單純蛋白與其它非蛋白成分結合而成。n1 1、色蛋白：由簡單蛋白與色素物質(zhì)結合而成。、色蛋白：由簡單蛋白與色

5、素物質(zhì)結合而成。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細胞色素等。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細胞色素等。n2 2、糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質(zhì)組成。如、糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質(zhì)組成。如細胞膜中的糖蛋白等。細胞膜中的糖蛋白等。n3 3、脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結合而成。、脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結合而成。 如如血清血清 - -， - -脂蛋白等。脂蛋白等。n4 4、核蛋白：由簡單蛋白與核酸結合而成。如、核蛋白：由簡單蛋白與核酸結合而成。如細胞核中的核糖核蛋白等。細胞核中的核糖核蛋白等。綴合蛋白綴合蛋白n按形狀和溶解度可將蛋白質(zhì)分為：按形狀和溶解度可將蛋白質(zhì)分為：n1、纖維蛋白纖維蛋白n2、球狀蛋白球狀蛋白n3、

6、膜蛋白膜蛋白n按肽鏈構成分按肽鏈構成分n1、單體蛋白單體蛋白 n2、寡聚蛋白或多聚蛋白寡聚蛋白或多聚蛋白蛋白質(zhì)分子量的變化范圍很蛋白質(zhì)分子量的變化范圍很大，從大約大，從大約60006000到到10000001000000道道爾頓（爾頓（DaDa）或更大。）或更大。某些蛋白質(zhì)是由兩個或更多某些蛋白質(zhì)是由兩個或更多個蛋白質(zhì)亞基個蛋白質(zhì)亞基( (多肽鏈多肽鏈) )通過非通過非共價結合而成的，稱共價結合而成的，稱寡聚蛋白寡聚蛋白質(zhì)質(zhì)。有些寡聚蛋白質(zhì)的分子量。有些寡聚蛋白質(zhì)的分子量可高達數(shù)百萬甚至數(shù)千萬?？筛哌_數(shù)百萬甚至數(shù)千萬。（TMVTMV：4x104x107 7）1 D = 1.66033 1 D

7、= 1.66033 1010-27-27 Kg Kgn對于對于只含有多肽鏈的只含有多肽鏈的簡單蛋白質(zhì)：簡單蛋白質(zhì)：n氨基酸殘基的數(shù)目氨基酸殘基的數(shù)目= =蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的分子量 / 110/ 110 （氨基酸殘基平均分子量（氨基酸殘基平均分子量 110110）John Dalton三、蛋白質(zhì)功能的多樣性三、蛋白質(zhì)功能的多樣性n 催化催化n 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)n 受體受體n 轉運轉運n 貯存貯存n 運動運動n 結構成分結構成分 n 防御防御n 異常功能異常功能 催化代謝反應。這是蛋催化代謝反應。這是蛋白質(zhì)的一個最重要的生白質(zhì)的一個最重要的生物學功能物學功能 調(diào)節(jié)蛋白參與基因表調(diào)節(jié)蛋白參與基因表達的調(diào)

8、控。它們激活或達的調(diào)控。它們激活或抑制遺傳信息轉錄為抑制遺傳信息轉錄為RNA激素參與代謝調(diào)節(jié)激素參與代謝調(diào)節(jié)催化催化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)受體受體轉運轉運貯存貯存運動運動結構成分結構成分 防御防御異常功能異常功能調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結構基因乳糖結構基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性（有活性）基基 因因 關關 閉閉啟啟動動子子OR催化催化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)受體受體轉運轉運貯存貯存運動運動結構成分結構成分 防御防御異常功能異常功能n受體蛋白起接受和傳遞受體蛋白起接受和傳遞信息的作用。信息的作用。催化催化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)受體受體轉運轉運貯存貯存運動運動結構成分結構成分 防御防御異常功能

9、異常功能 某些蛋白質(zhì)具有轉運功能，某些蛋白質(zhì)具有轉運功能，攜帶各種小分子、離子等攜帶各種小分子、離子等從一處到另一處。從一處到另一處。n有些蛋白質(zhì)有貯藏氨基酸的作用，用有些蛋白質(zhì)有貯藏氨基酸的作用，用作有機體生長發(fā)育的氮源。作有機體生長發(fā)育的氮源。n如蛋類中的卵清蛋白為鳥類胚胎發(fā)育如蛋類中的卵清蛋白為鳥類胚胎發(fā)育提供氮素提供氮素n小麥種子中的醇溶蛋白為種子發(fā)芽提小麥種子中的醇溶蛋白為種子發(fā)芽提供氮素。供氮素。催化催化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)受體受體轉運轉運貯存貯存運動運動結構成分結構成分 防御防御異常功能異常功能催化催化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)受體受體轉運轉運貯存貯存運動運動結構成分結構成分 防御防御異常功能異常功能人和動物

10、的運動，靠肌肉的收人和動物的運動，靠肌肉的收縮來實現(xiàn)，參與肌肉收縮的主縮來實現(xiàn)，參與肌肉收縮的主要成分是要成分是肌球和肌動蛋白肌球和肌動蛋白，沒，沒有肌球蛋白和肌動蛋白，就沒有肌球蛋白和肌動蛋白，就沒有人和動物的運動。有人和動物的運動。 構建和維持生物體的結構，這類蛋構建和維持生物體的結構，這類蛋白稱為結構蛋白。白稱為結構蛋白。n細胞的片層結構，如細胞膜、線粒細胞的片層結構，如細胞膜、線粒體膜、葉綠體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等都是體膜、葉綠體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等都是由不溶性蛋白與脂類組成的。由不溶性蛋白與脂類組成的。n在高等動物里，膠原蛋白參與結締在高等動物里，膠原蛋白參與結締組織和骨骼的形成，作為身體的支組織

11、和骨骼的形成，作為身體的支架。架。 n動物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構動物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構成的。成的。催化催化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)受體受體轉運轉運貯存貯存運動運動結構成分結構成分 防御防御異常功能異常功能n有些蛋白質(zhì)具有主動的防護功能，抵有些蛋白質(zhì)具有主動的防護功能，抵抗外界不利因素對生物體的干擾。抗外界不利因素對生物體的干擾。n如脊椎動物體內(nèi)的免疫球蛋白（抗如脊椎動物體內(nèi)的免疫球蛋白（抗體），能中和外來有害物質(zhì)（抗原）。體），能中和外來有害物質(zhì)（抗原）。n抗凍蛋白：南極水域中某些魚類血液抗凍蛋白：南極水域中某些魚類血液中含有，保護血液不被凍凝。中含有，保護血液不被凍凝。n蛇毒和蜂毒的溶血蛋白和神

12、經(jīng)毒蛋白蛇毒和蜂毒的溶血蛋白和神經(jīng)毒蛋白以及一些植物毒蛋白（蓖麻蛋白）等以及一些植物毒蛋白（蓖麻蛋白）等少量可引起高等動物產(chǎn)生強烈毒性反少量可引起高等動物產(chǎn)生強烈毒性反應。應。催化催化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)受體受體轉運轉運貯存貯存運動運動結構成分結構成分 防御防御異常功能異常功能n應樂果甜蛋白有著極高的甜度，應樂果甜蛋白有著極高的甜度，作甜味劑。作甜味劑。n某些海洋生物如貝類，分泌一某些海洋生物如貝類，分泌一類膠質(zhì)蛋白，能將貝殼牢固地類膠質(zhì)蛋白，能將貝殼牢固地粘在巖石或其他硬表面上粘在巖石或其他硬表面上催化催化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)受體受體轉運轉運貯存貯存運動運動結構成分結構成分 防御防御異常功能異常功能綜上所述綜上所述

13、：蛋白質(zhì)存在于所有的生物細蛋白質(zhì)存在于所有的生物細胞中，是構成生物體最基本的結構物質(zhì)和胞中，是構成生物體最基本的結構物質(zhì)和功能物質(zhì)。功能物質(zhì)。 蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎，它參蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎，它參與了幾乎所有的生命活動過程。與了幾乎所有的生命活動過程。一、蛋白質(zhì)的一級結構一、蛋白質(zhì)的一級結構二、蛋白質(zhì)的二級結構和纖維狀蛋白二、蛋白質(zhì)的二級結構和纖維狀蛋白三、蛋白質(zhì)的三級結構三、蛋白質(zhì)的三級結構四、蛋白質(zhì)的四級結構四、蛋白質(zhì)的四級結構 蛋白質(zhì)的結構蛋白質(zhì)的結構n蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽( (polypeptide) )鏈以特殊方式結合而成鏈以特殊方式結合而成的

14、生物大分子。的生物大分子。n蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在將分子量在60006000道爾頓以上的多肽稱為道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的一級結構蛋白質(zhì)的一級結構1. 定義定義 1969年，國際年，國際純化學與應用化學委員會純化學與應用化學委員會（IUPAC） 規(guī)定：規(guī)定：蛋白蛋白質(zhì)的一級結構指蛋白質(zhì)多質(zhì)的一級結構指蛋白質(zhì)多肽連中肽連中AA的排列順序，包的排列順序，包括二硫鍵的位置。括二硫鍵的位置。其中最其中最重要的是多肽鏈的氨基重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎。物功能的基礎。胰島素（胰島素（in

15、sulin insulin ）的一級結構：）的一級結構：胰島素的分子量為胰島素的分子量為57345734道爾頓，由道爾頓，由5151個氨基酸組個氨基酸組成。成。含含A A、B B兩條鏈，（兩條鏈，（A A鏈：鏈：2121肽肽 ，B B鏈：鏈：3030肽）。肽）。 A A鏈和鏈和B B鏈之間由兩個鏈間二硫鍵（鏈之間由兩個鏈間二硫鍵（A7-B7,A20-A7-B7,A20-B19)B19)連接，連接，A A鏈本身第鏈本身第6 6位和第位和第1111位的位的2 2個個CysCys殘基之殘基之間形成一個鏈內(nèi)二硫鍵。間形成一個鏈內(nèi)二硫鍵。胰島素是動物胰臟胰島素是動物胰臟細胞分泌的一種分子量較小的激素蛋白

16、，主細胞分泌的一種分子量較小的激素蛋白，主要功能是降低體內(nèi)血糖含量。要功能是降低體內(nèi)血糖含量。 肽（肽（peptidepeptide）n一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基之間一個氨基酸的氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物肽鍵，所形成的化合物稱為肽。稱為肽。由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。為氨基酸殘基。 肽鍵肽鍵（peptide bondpeptide bond）： 0.127nm0.127n

17、m鍵長鍵長=0.132nm=0.132nm 0.148nm0.148nm肽平面：構成肽鍵的四肽平面：構成肽鍵的四個原子（個原子（C C、O O、N N、H H）和與之相連的兩個和與之相連的兩個碳碳原子都處在同一個平面原子都處在同一個平面內(nèi)，此剛性結構的平面內(nèi)，此剛性結構的平面稱肽平面或酰氨平面。稱肽平面或酰氨平面。肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。羰基具有明顯的共軛作用。肽鍵中的肽鍵中的C-NC-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉。轉。肽鍵肽鍵n肽鍵中的肽鍵中的C-NC-N鍵具有部分鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由

18、旋雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉。轉。n在大多數(shù)情況下，以反在大多數(shù)情況下，以反式結構存在式結構存在。CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽鍵n在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為列順序稱為氨基酸順序氨基酸順序n通常在多肽鏈的一端含有一個游離的 - -氨基，稱為氨氨基，稱為氨基端或基端或N-N-端；端；在另一端含有一個游離的 - -羧基，稱為羧基，稱為羧基端或羧基端或C-C-端。端。n氨基酸的順序是從N-

19、N-端的氨基酸殘基開始，以端的氨基酸殘基開始，以C-C-端氨端氨基酸殘基為終點基酸殘基為終點的排列順序。如上述五肽可表示為：n Ser-Val-Tyr-Asp-Gln二、肽鏈中二、肽鏈中AAAA的排列順序和命名的排列順序和命名 從肽鏈的從肽鏈的N-N-末端開始，殘基用末端開始，殘基用酰酰稱呼。稱呼。 例如：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸例如：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸, , 簡寫：簡寫：Ser-Gly-Tyr - Ala - LeuSer-Gly-Tyr - Ala - Leu， 書寫時，通常把書寫時，通常把NHNH2 2末端末端AAAA殘基放在左邊，殘基放在左邊，COOHCOOH末端末端

20、AAAA殘基放在右邊。殘基放在右邊。 共價主鏈共價主鏈：肽鏈的骨干是由：肽鏈的骨干是由-N -C -C -序列重復排序列重復排列而成，稱為共價主鏈。列而成，稱為共價主鏈。肽的命名肽的命名四肽的結構四肽的結構三、肽的重要理化性質(zhì)三、肽的重要理化性質(zhì)1.每種肽也有其晶體，晶體的熔點都很高。每種肽也有其晶體，晶體的熔點都很高。2.在在pH0-14范圍內(nèi)，肽的酸堿性質(zhì)主要來自游離范圍內(nèi)，肽的酸堿性質(zhì)主要來自游離末端末端 -NH2和游離末端和游離末端 -COOH以及側鏈上可以及側鏈上可解離的基團解離的基團。3.每一種肽都有其相應的等電點，計算方法與每一種肽都有其相應的等電點，計算方法與AA一致且復雜。一

21、致且復雜。 B2+B B+ +B BB B- -B B2-2-K K 1 1K K 2 2K K 3 3K K 4 4pI=pKpI=pK2 2+ pK+ pK3 3/2/24. 肽的化學反應：也能發(fā)生茚三酮反應、肽的化學反應：也能發(fā)生茚三酮反應、 Sanger反應、反應、DNS反應和反應和Edman反應；反應；還可發(fā)生雙縮脲反應。還可發(fā)生雙縮脲反應。雙縮脲反應含有兩個以上肽鍵的多肽，具含有兩個以上肽鍵的多肽，具有與雙縮脲相似的結構特點，有與雙縮脲相似的結構特點，也能發(fā)生雙縮脲反應，生成也能發(fā)生雙縮脲反應，生成紫紫紅色或藍紫色絡合物紅色或藍紫色絡合物。這是多。這是多肽定量測定的重要反應。肽定量

22、測定的重要反應。紅紫色絡合物紅紫色絡合物(鹼性溶液鹼性溶液)Cu2+雙縮脲是兩分子的尿素經(jīng)加熱失雙縮脲是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子去一分子NHNH3 3而得到的產(chǎn)物而得到的產(chǎn)物肽和蛋白質(zhì)所特有而氨基酸所沒有的顏色反應肽和蛋白質(zhì)所特有而氨基酸所沒有的顏色反應四、四、 天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽n在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。白質(zhì)的亞單位。n但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽常稱為活

23、性肽（active peptideactive peptide）。）。n如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。胱甘肽；蛇毒多肽等。NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鵝膏覃堿的化學結構與真核生物的與真核生物的RNARNA聚合酶聚合酶 和和牢固結合牢固結合CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGlyNH2SS牛催產(chǎn)素CysTyrGlnAsnCysProSSPheArgGlyNH2牛加

24、壓素 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-腦啡肽 Leu-腦啡肽 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短桿菌肽短桿菌肽S(S(環(huán)十肽環(huán)十肽) ) 由細菌分泌的多肽，有時也都含有由細菌分泌的多肽，有時也都含有D-D-氨基酸和氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鳥氨酸（一些非蛋白氨基酸。如鳥氨酸（OrnOrnithine, ithine, 縮寫為縮寫為 OrnOrn）。）。 能抗革蘭氏陽性菌，對陰性細菌如綠膿桿菌、能抗革蘭氏陽性菌，

25、對陰性細菌如綠膿桿菌、變性菌也有效。臨床上用于治療和預防化膿性病變性菌也有效。臨床上用于治療和預防化膿性病癥。癥。 n CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCHCH2 2CHCH2 2CHNHCHNH2 2COOHCOOHCH2CH2SHSH 谷胱甘肽谷胱甘肽存在與動、植物及存在與動、植物及微生物中：微生物中： 1. 1.參與體內(nèi)氧化還原反應參與體內(nèi)氧化還原反應 2. 2.作為輔酶參與氧化還原反應作為輔酶參與氧化還原反應 保護巰基酶或含保護巰基酶或含CysCys的蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)中 SH SH的還原性的還原性, ,防止氧化物積累防止氧化物積累2GSH2GSHGS-SGGS-SG 2.

26、2.蛋白質(zhì)一級結構的測定蛋白質(zhì)一級結構的測定n蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎。自從研究的基礎。自從19531953年年F.SangerF.Sanger測定測定了胰島素的一級結構以來，現(xiàn)在已經(jīng)有了胰島素的一級結構以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級結構被測定。上千種不同蛋白質(zhì)的一級結構被測定。 測定蛋白質(zhì)氨基酸順序的重要意義測定蛋白質(zhì)氨基酸順序的重要意義：n測定蛋白質(zhì)中的測定蛋白質(zhì)中的AAAA順序，是走向闡明其生物功順序，是走向闡明其生物功能基礎中的很重要步驟。順序可以給出更多的能基礎中的很重要步驟。順序可以給出更多的信息。信息。n為了了解多肽鏈

27、折疊成三維構象所受到的限制，為了了解多肽鏈折疊成三維構象所受到的限制，順序測定是必須的。順序測定是必須的。nAAAA順序的改變可以導致異常的功能和疾病，所順序的改變可以導致異常的功能和疾病，所以順序測定是以順序測定是分子病理學分子病理學的一個重要部分。的一個重要部分。n蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)中的AAAA順序很能指明它的進化史。順序很能指明它的進化史。 a a、樣品必需純（、樣品必需純（97%97%以上）；以上）；b b、知道蛋白質(zhì)的分子量；、知道蛋白質(zhì)的分子量；可以預測可以預測AAAA數(shù)數(shù)目，工作量大小。目，工作量大小。c c、知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；、知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；（1 1）測定蛋白

28、質(zhì)一級結構的要求）測定蛋白質(zhì)一級結構的要求 (2) 測定步驟測定步驟A.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目和種類。測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目和種類。 通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)質(zhì)分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。目。B.多肽鏈的拆分。多肽鏈的拆分。 由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進行拆分。B.多肽鏈的拆分。多肽鏈的拆分。 幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡寡聚蛋白質(zhì)，聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用二聚體；

29、可用8mol/L8mol/L尿素尿素或或6mol/L6mol/L鹽酸胍鹽酸胍處理，處理，即可分開多肽鏈即可分開多肽鏈( (亞基亞基).).尿素和鹽酸胍與蛋白質(zhì)的尿素和鹽酸胍與蛋白質(zhì)的可能作用方式可能作用方式：a.a.與肽鏈競爭氫鍵與肽鏈競爭氫鍵b.b.增加非極性側鏈在增加非極性側鏈在 水中的溶解度水中的溶解度（NHNH）脲或胍脲或胍C. 幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳稍?mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L鹽酸胍存在下，鹽酸胍存在下，用過量的用過量的 - -巰基乙醇巰基乙醇( (還原法還原法) )處理，使處理，使二硫鍵還原為巰基，然

30、后用烷基化試劑二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑（ICHICH2 2COOHCOOH）保護生成的巰基，以防止保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。它重新被氧化。SH-CHSH-CH2 2-CH-CH2 2-OH-OHn可以通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之可以通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用間的非共價力；應用過甲酸氧化法過甲酸氧化法拆分拆分多肽鏈間的二硫鍵。多肽鏈間的二硫鍵。s ss sHcoooHHcoooHSOSO3 3H HSOSO3 3H HS SS SS SS SS SS S胰島素胰島素HO-CHHO-CH2 2-CH-CH2 2-SH-SHSHSHSHSHSHSHSHSH

31、SHSHSHSHSCHSCH2 2C00HC00H SCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HICHICH2 2COOHCOOH還原還原保護保護 D.D.分析多肽鏈的分析多肽鏈的N-N-末端和末端和C-C-末端末端。n多肽鏈端基氨基酸分為兩類：多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-N-端氨基端氨基酸酸(amino-terminal)(amino-terminal)和和C-C-端氨基酸。端氨基酸。n在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-N-端氨

32、基酸分析法。端氨基酸分析法。nN-N-端氨基酸分析：端氨基酸分析：SangerSanger反應、反應、EdmanEdman反應、反應、與丹磺酰氯反應、氨肽酶法。與丹磺酰氯反應、氨肽酶法。nC-C-端氨基酸分析：端氨基酸分析：n又稱又稱SangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯與肽鏈二硝基氟苯與肽鏈N-N-端的游離氨基作端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（用，生成二硝基苯衍生物（DNP-DNP-蛋白質(zhì)）。蛋白質(zhì)）。n在酸性條件下水解，得到黃色在酸性條件下水解，得到黃色DNP-DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的乙醚抽提分離。不同的DNP-DNP-

33、氨基酸可以用色譜法進行鑒定。氨基酸可以用色譜法進行鑒定。O2NFNO2+ H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸n丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）與）與N-N-端氨基酸的游離氨基作用，得到端氨基酸的游離氨基作用，得到DNS-DNS-蛋白質(zhì)，水解得蛋白質(zhì)，水解得DNSDNS氨基酸。氨基酸。n此法的優(yōu)點是此法的優(yōu)點是DNS-DNS-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，不需提取可氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，不需提取可直接檢測，檢測靈敏度高。直接檢測，檢測靈敏度高。N (CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCR

34、OSO2N (CH3)2+水解N (CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸（3） PITC法（法（ Edman 法法）n氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-N-端逐個的向里水解。端逐個的向里水解。n根根據(jù)據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質(zhì)的基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-N-末端殘基順序。末端殘基順序。n最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮最

35、常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為氨酸殘基為N-N-末端的肽鍵速度最大。末端的肽鍵速度最大。n此法是多肽鏈此法是多肽鏈C-C-端氨基酸分析法端氨基酸分析法。多肽與肼在無水。多肽與肼在無水條件下加熱，條件下加熱，C-C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)合成不溶于水的物質(zhì)而與而與C-C-端氨基酸分離。端氨基酸分離。H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+

36、NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸 肽鏈肽鏈 C C末端氨基酸可用硼氫化鋰還末端氨基酸可用硼氫化鋰還原成相應的氨基醇，再用層析法加以原成相應的氨基醇，再用層析法加以鑒定。鑒定。SangerSanger早期就是采用這個方法早期就是采用這個方法鑒定胰島素鑒定胰島素A A、B B鏈的鏈的C C末端氨基酸末端氨基酸n羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-C-端逐個的水解端逐個的水解AAAA。根據(jù)不同的反應時間測。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的而知道蛋白質(zhì)的C-C-末端殘基順序。末端

37、殘基順序。n目前常用的羧肽酶有四種：目前常用的羧肽酶有四種：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B來自胰臟；來自胰臟；C C來自柑桔葉；來自柑桔葉；Y Y來自面包酵母。來自面包酵母。n羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸殘基；末端氨基酸殘基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys為為C-C-末末端殘基的肽鍵。端殘基的肽鍵。E.E.多肽鏈斷裂成多個肽段，多肽鏈斷裂成多個肽段，可采用兩種或多可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并

38、將其分離開來?；蚨嗵纂亩位螂乃槠?，并將其分離開來。多肽鏈斷裂法：多肽鏈斷裂法：酶解法和化學法酶解法和化學法 酶解法酶解法: :n胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶等白酶等nTrypsin ：R R1 1=Lys=Lys和和ArgArg時（專一性較強，時（專一性較強，水解速度快）。水解速度快）。R R2 2=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點水解位點胰蛋白酶胰蛋白酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R1R2R2n或胰凝乳蛋白酶或胰凝

39、乳蛋白酶（ChymotrypsinChymotrypsin）：）：R R1 1=Phe, Trp,Tyr=Phe, Trp,Tyr時水解快時水解快; R; R1 1= = LeuLeu，MetMet和和HisHis水水解稍慢。解稍慢。nR R2 2=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈水解位點水解位點糜蛋白酶糜蛋白酶nPepsinPepsin：R R1 1和和R R2 2Phe, Trp, Tyr; Phe, Trp, Tyr; LeuLeu以及其它疏水以及其它疏水性氨基酸水解速度性氨基酸水解速度較快較快。nR R1 1=P

40、ro =Pro 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈水解位點水解位點胃蛋白酶胃蛋白酶nthermolysinthermolysin：R R2 2=Phe, Trp, Tyr; =Phe, Trp, Tyr; LeuLeu，Ile, MetIle, Met以及其它疏水性強的以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。氨基酸水解速度較快。nR R2 2=Pro=Pro或或Gly Gly 水解受抑。水解受抑。nR R1 1或或R R3 3=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈水解位點水

41、解位點嗜熱菌蛋白酶嗜熱菌蛋白酶n谷氨酸蛋白酶：谷氨酸蛋白酶： R R1 1=Glu=Glu、Asp(Asp(磷酸磷酸緩沖液緩沖液); R); R1 1=Glu (=Glu (磷酸緩沖液或醋磷酸緩沖液或醋酸緩沖液酸緩沖液) )n精氨酸蛋白酶：精氨酸蛋白酶： R R1 1=Arg=ArgNHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈水解位點水解位點谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶（R1=Arg,GlyAlaLeuGluAspR1=Arg,GlyAlaLeuGluAsp）和彈性蛋白酶和彈性蛋白酶(R1=AlaValGlySer)(R1=A

42、laValGlySer) 化學法：化學法：可獲得較大的肽段可獲得較大的肽段溴化氰溴化氰(Cyanogen bromide)(Cyanogen bromide)水解法，它能選擇性地水解法，它能選擇性地切割由切割由甲硫氨酸的羧基甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。所形成的肽鍵。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高絲氨酸內(nèi)酯 羥胺（羥胺（NHNH2 2OHOH）：）：專一性斷裂專一性斷裂-Asn-Asn- -Gly-Gl

43、y-之間之間的肽鍵。也能部分裂解的肽鍵。也能部分裂解-Asn-Asn- -Leu-Leu-之間的肽之間的肽鍵以及鍵以及-Asn-Asn- -Ala-Ala-之間的肽鍵。之間的肽鍵。F.F.分離肽段測定每個肽段的氨基酸順序。分離肽段測定每個肽段的氨基酸順序。 測測定定每每條條多多肽肽鏈鏈的的氨氨基基酸酸組組成成EdmanEdman反應反應2 2、氨肽酶法或羧肽酶法、氨肽酶法或羧肽酶法3 3、質(zhì)譜法（、質(zhì)譜法（MSMS） 靈敏度高、所需樣品少、測定速度快靈敏度高、所需樣品少、測定速度快核糖體核糖體蛋白質(zhì)鏈蛋白質(zhì)鏈4.4.根據(jù)核苷酸序列的推定法根據(jù)核苷酸序列的推定法G.G.確定肽段在多肽鏈中的次序確

44、定肽段在多肽鏈中的次序。 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序?；犴樞颉.H.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。采用胃蛋白酶水解：采用胃蛋白酶水解：切點多，二硫鍵穩(wěn)切點多，二硫鍵穩(wěn)定定n一般采用胃蛋白酶處理含有二硫鍵的多肽鏈一般采用胃蛋白酶處理含有二硫鍵的多肽鏈( (切點多；酸性環(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換切點多；酸性環(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換) )。n將所得的肽段利用將所得的肽段利用BrownBrown及及HartlayHartlay的對角線的對角線電泳技術電泳技術進

45、行分離。進行分離。+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向BrownBrown和和HartlayHartlay對角線電泳圖解對角線電泳圖解pH6.5pH6.5圖中黃色斑點是圖中黃色斑點是含有二硫鍵的肽段含有二硫鍵的肽段S SS SHCOOOHHCOOOHSOSO3 3H HSOSO3 3H H+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay對角線電泳圖解對角線電泳圖解pH6.5pH6.5圖中圖中a a、b b兩個斑點是兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段產(chǎn)生的肽段 同源蛋白質(zhì)：同源蛋白質(zhì)：來自來自不同不同生

46、物體、生物體、 執(zhí)行同一執(zhí)行同一 /相似功能的蛋白相似功能的蛋白質(zhì)質(zhì) 同種蛋白質(zhì)：同種蛋白質(zhì)：來自來自相同相同生物體、生物體、 執(zhí)行同一功能的蛋白質(zhì)執(zhí)行同一功能的蛋白質(zhì)1 1、同源蛋白質(zhì)、同源蛋白質(zhì) 一百多個一百多個AA殘基殘基 MW約約12.5103 2 8個不變殘基個不變殘基 細胞色素細胞色素C的的AA序列差異可用于核對各物序列差異可用于核對各物種間的分類學關系以及繪制系統(tǒng)樹種間的分類學關系以及繪制系統(tǒng)樹/進化樹。進化樹。invariant residues (yellow) conservative substitutions (blue)nonconservative or variable residues (unshaded)Conservation and variation of cytochrome c sequences1、氧合血紅蛋白、氧合血紅蛋白（三）血液凝固與（三）血液凝固與AA序列的局部斷裂序列的局部斷裂（一）肽的人工合成（一）肽的人工合成 保護（保護（氨基、羧基、側鏈活性基團氨基、羧基、側鏈活性基團） 活化（活化（氨基、羧基氨基、羧基） 縮合劑縮合劑 （二）胰島素的人工合成（二）胰島素的人工合成（三）固相肽合成（三）固相肽合成