《食品發(fā)酵工藝》中文課件PPT,食品發(fā)酵工藝,食品,發(fā)酵,工藝,中文,課件,PPT 第二節(jié)第二節(jié) 檸檬酸檸檬酸使用最廣的酸味劑。使用最廣的酸味劑。廣泛存在于植物果實(shí)中（廣泛存在于植物果實(shí)中（柑桔類及漿果類水果，大都柑桔類及漿果類水果，大都與蘋果酸共存）。與蘋果酸共存）。對(duì)人體有益，對(duì)人體有益，廣泛用于清涼飲料，水果罐頭、糖果等。廣泛用于清涼飲料，水果罐頭、糖果等。提取不能滿足需要。提取不能滿足需要。合成法不被人們所接受。合成法不被人們所接受。發(fā)酵法生產(chǎn)的有機(jī)酸接近自然產(chǎn)物。發(fā)酵法生產(chǎn)的有機(jī)酸接近自然產(chǎn)物。檸檬酸（檸檬酸（citric acidcitric acid）學(xué)名：學(xué)名：2-2-羥基羥基-丙烷三羧酸或丙烷三羧酸或 -羥基丙三酸羥基丙三酸 分子式分子式C C6 6H H8 8O O7 7 ，分子量分子量192.13192.13 商品檸檬酸有：商品檸檬酸有：AnhydousAnhydous citric acid 36.6 citric acid 36.6 結(jié)晶析出結(jié)晶析出 Monohydrate citric acid Monohydrate citric acid 36.6 36.6 結(jié)晶析出結(jié)晶析出 一、歷史一、歷史 1893 1893年前，主要從柑橘、菠蘿和檸檬等提取。年前，主要從柑橘、菠蘿和檸檬等提取。1893 1893年后發(fā)現(xiàn)微生物（青霉）可產(chǎn)生檸檬酸。年后發(fā)現(xiàn)微生物（青霉）可產(chǎn)生檸檬酸。1913 1913年，利用黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸年，利用黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸。1917 1917年，美國采用表面培養(yǎng)法生產(chǎn)檸檬酸年，美國采用表面培養(yǎng)法生產(chǎn)檸檬酸。19231923年，美國建立第一家固體發(fā)酵生產(chǎn)廠家。年，美國建立第一家固體發(fā)酵生產(chǎn)廠家。1951 1951年，美國率先用深層發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸年，美國率先用深層發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸。我國我國6060年代末開始淺盤發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。年代末開始淺盤發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。1968 1968年，上海酵母廠深層發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸投產(chǎn)。年，上海酵母廠深層發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸投產(chǎn)。二、檸檬酸生產(chǎn)菌二、檸檬酸生產(chǎn)菌 青霉（青霉（PenicilliumPenicillium）、）、毛霉（毛霉（MucorMucor）、）、曲霉曲霉（AspergillusAspergillus）等。等。國內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為：國內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為：黑曲霉（黑曲霉（Aspergillus nigerAspergillus niger）是生產(chǎn)檸檬酸的是生產(chǎn)檸檬酸的最佳菌種最佳菌種。因?yàn)椋阂驗(yàn)椋汉谇咕哂卸喾N較強(qiáng)的酶系，邊長菌、邊糖化、黑曲霉具有多種較強(qiáng)的酶系，邊長菌、邊糖化、邊發(fā)酵產(chǎn)酸。邊發(fā)酵產(chǎn)酸。三、檸檬酸發(fā)酵機(jī)制及代謝調(diào)控三、檸檬酸發(fā)酵機(jī)制及代謝調(diào)控 1.1.檸檬酸生物合成途徑檸檬酸生物合成途徑 EMP EMP 乙酰乙酰CoA CoA 葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸 檸檬酸檸檬酸 HMPHMP 草酰乙酸草酰乙酸 氧化脫羧氧化脫羧COCO2 2固定反應(yīng)固定反應(yīng)縮合縮合 TCATCA循環(huán)與檸檬酸的形成循環(huán)與檸檬酸的形成2.2.黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的代謝調(diào)控黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的代謝調(diào)控（1 1）磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶是是EMPEMP途徑第一個(gè)調(diào)節(jié)酶，也是途徑第一個(gè)調(diào)節(jié)酶，也是 決定決定EMPEMP途徑代謝流量最重要的關(guān)鍵酶。途徑代謝流量最重要的關(guān)鍵酶。檸檬酸檸檬酸 NHNH4 4+且：且：NHNH4 4+能有效解能有效解受受 抑制，受抑制，受 激活，激活，除前兩者的抑制。除前兩者的抑制。ATP AMPATP AMP 高葡萄糖高葡萄糖（2 2）-酮戊二酸脫氫酶受酮戊二酸脫氫酶受 的阻遏。的阻遏。NHNH4 4+（3 3）低低pHpH下，烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶受抑制。下，烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶受抑制。三三高三低高三低:高底物濃度：高底物濃度：激活磷酸果糖激酶激活磷酸果糖激酶 高銨離子濃度高銨離子濃度:阻遏阻遏-酮戊二酸脫氫酶酮戊二酸脫氫酶 高通氧強(qiáng)度：高通氧強(qiáng)度：存在一條側(cè)系呼吸鏈存在一條側(cè)系呼吸鏈,正常情況下，不產(chǎn)生正常情況下，不產(chǎn)生ATPATP。缺氧導(dǎo)致不可逆失活缺氧導(dǎo)致不可逆失活,NADPHNADPH2 2改走標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈，產(chǎn)生改走標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈，產(chǎn)生ATPATP。低磷酸鹽濃度：低磷酸鹽濃度：否則否則ATPATP多。多。低低MnMn2+2+濃度：濃度：降低菌體中糖代謝轉(zhuǎn)向合成蛋白質(zhì)、核酸的降低菌體中糖代謝轉(zhuǎn)向合成蛋白質(zhì)、核酸的能力，造成能力，造成NHNH4 4+濃度升高。濃度升高。低低pHpH值：值：有利于檸檬酸積累。有利于檸檬酸積累。四、檸檬酸的生產(chǎn)工藝四、檸檬酸的生產(chǎn)工藝 黑曲霉黑曲霉（Aspergillus nigerAspergillus niger）利用淀粉利用淀粉質(zhì)原料大量積累檸檬酸。質(zhì)原料大量積累檸檬酸。工藝工藝:固體或液體深層發(fā)酵固體或液體深層發(fā)酵原料原料:薯干粉、廢糖蜜、甘蔗渣等薯干粉、廢糖蜜、甘蔗渣等 檸檬酸發(fā)酵工藝檸檬酸發(fā)酵工藝1.1.原料預(yù)處理原料預(yù)處理 淀粉的液化、糖蜜的除雜淀粉的液化、糖蜜的除雜 我國采用薯干粉發(fā)酵工藝只用液化工我國采用薯干粉發(fā)酵工藝只用液化工藝，利用黑曲霉自身能產(chǎn)生糖化酶，完成藝，利用黑曲霉自身能產(chǎn)生糖化酶，完成后續(xù)的糖化工藝。后續(xù)的糖化工藝。液化法是我國檸檬酸工藝的特色方法。液化法是我國檸檬酸工藝的特色方法。深層發(fā)酵的幾種方法深層發(fā)酵的幾種方法利用薯干粉醪液利用薯干粉醪液利用糖蜜利用糖蜜利用淀粉水解糖利用淀粉水解糖2.2.培養(yǎng)基與發(fā)酵條件培養(yǎng)基與發(fā)酵條件 提供高濃度的葡萄糖和充足的氧，提供高濃度的葡萄糖和充足的氧，而磷、錳、鐵、鋅等無機(jī)鹽處于低水平。而磷、錳、鐵、鋅等無機(jī)鹽處于低水平。接種方式：二級(jí)種子，麩曲孢子接種方式：二級(jí)種子，麩曲孢子（1 1）碳源：高糖是檸檬酸發(fā)酵的一大特征。）碳源：高糖是檸檬酸發(fā)酵的一大特征。（2 2）氮源：偏好無機(jī)氮。添加銨鹽。）氮源：偏好無機(jī)氮。添加銨鹽。（3 3）溫度：）溫度：28 28 3030C C 初期溫度稍高，有利于菌體繁殖初期溫度稍高，有利于菌體繁殖 產(chǎn)酸期后溫度稍低，有利于產(chǎn)酸產(chǎn)酸期后溫度稍低，有利于產(chǎn)酸（4 4）pH:pH:低低 pHpH（2.0 2.0 3.03.0）條件下產(chǎn)生檸檬酸條件下產(chǎn)生檸檬酸 中性中性 pH pH 條件下形成草酸條件下形成草酸 菌體生長發(fā)育菌體生長發(fā)育pH 3.0 pH 3.0 7.0 7.0（5 5）溶解氧的控制：嚴(yán)格好氧微生物，提高發(fā)酵罐溶解氧的控制：嚴(yán)格好氧微生物，提高發(fā)酵罐 內(nèi)溶氧水平可提高檸檬酸產(chǎn)量。內(nèi)溶氧水平可提高檸檬酸產(chǎn)量。五、檸檬酸的提取五、檸檬酸的提取 國內(nèi)常用的方法：鈣鹽法國內(nèi)常用的方法：鈣鹽法 1.1.發(fā)酵醪預(yù)處理：發(fā)酵醪預(yù)處理：直接加熱直接加熱 作用：作用：（1 1）殺死微生物）殺死微生物（2 2）使蛋白質(zhì)變性凝固，粘度降低，利于過濾。）使蛋白質(zhì)變性凝固，粘度降低，利于過濾。（3 3）使菌體內(nèi)檸檬酸釋放出來，提高產(chǎn)率。）使菌體內(nèi)檸檬酸釋放出來，提高產(chǎn)率。2.2.過濾：過濾：板框壓濾機(jī)板框壓濾機(jī)3.3.中和中和：檸檬酸鈣鹽：檸檬酸鈣鹽 檸檬酸鈣沉淀檸檬酸鈣沉淀4.4.酸解：酸解：檸檬酸鈣檸檬酸鈣H H2 2SOSO4 4 檸檬酸檸檬酸CaSOCaSO4 45.5.濃縮：濃縮：減壓蒸發(fā)減壓蒸發(fā)6.6.結(jié)晶：結(jié)晶：介穩(wěn)區(qū)投晶種介穩(wěn)區(qū)投晶種7.7.干燥：干燥：熱空氣干燥法熱空氣干燥法 其它幾種提取方法其它幾種提取方法離子交換離子交換電滲析電滲析萃取法萃取法第三節(jié)第三節(jié)蘋果酸蘋果酸 一、概況：一、概況：又名羥基琥鉑酸，羥基丁二酸，幾又名羥基琥鉑酸，羥基丁二酸，幾乎一切果實(shí)中都含有，以仁果類中最多。乎一切果實(shí)中都含有，以仁果類中最多。酸味較檸檬酸強(qiáng)酸味較檸檬酸強(qiáng)1.21.2 1.31.3倍倍，呈味時(shí)間也長。呈味時(shí)間也長。DL-DL-蘋果酸：蘋果酸：白色或結(jié)晶狀粉末，國外采用化學(xué)法生產(chǎn)。白色或結(jié)晶狀粉末，國外采用化學(xué)法生產(chǎn)。L-L-蘋果酸：蘋果酸：無色結(jié)晶，存在于植物或其果實(shí)中，發(fā)酵法生產(chǎn)。無色結(jié)晶，存在于植物或其果實(shí)中，發(fā)酵法生產(chǎn)。二、歷史二、歷史2020世紀(jì)世紀(jì)2020年代，發(fā)現(xiàn)某些霉菌和酵母可積累年代，發(fā)現(xiàn)某些霉菌和酵母可積累L-L-蘋果酸。蘋果酸。6060年代，英美用化學(xué)合成法生產(chǎn)年代，英美用化學(xué)合成法生產(chǎn)L-L-蘋果酸，成本高。蘋果酸，成本高。19591959年，日本利用短乳桿菌（年，日本利用短乳桿菌（lactabacilluslactabacillus brevisbrevis）產(chǎn)生的富馬酸酶催化富馬酸轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生的富馬酸酶催化富馬酸轉(zhuǎn)化為L-L-蘋果酸成功。蘋果酸成功。6060年代以來，各國爭相研制一步法從淀粉等糖質(zhì)原料年代以來，各國爭相研制一步法從淀粉等糖質(zhì)原料 生產(chǎn)蘋果酸。生產(chǎn)蘋果酸。目前，世界上蘋果酸的主要產(chǎn)地是日本。目前，世界上蘋果酸的主要產(chǎn)地是日本。三、生產(chǎn)方法三、生產(chǎn)方法 1.1.從果汁中直接抽提法從果汁中直接抽提法：經(jīng)濟(jì)上不合理經(jīng)濟(jì)上不合理 2.2.化學(xué)合成法化學(xué)合成法：產(chǎn)物是產(chǎn)物是DL-DL-蘋果酸蘋果酸 3.3.發(fā)酵法發(fā)酵法：（1 1）一步法）一步法 糖類糖類 蘋果酸蘋果酸 （2 2）二步法）二步法 根霉根霉 酵母菌、細(xì)菌酵母菌、細(xì)菌 糖類糖類 富馬酸富馬酸 蘋果酸蘋果酸 4.4.酶轉(zhuǎn)化法酶轉(zhuǎn)化法:固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞 富馬酸鹽（化學(xué)合成）富馬酸鹽（化學(xué)合成）蘋果酸鹽蘋果酸鹽曲霉曲霉富馬酸酶富馬酸酶四、蘋果酸合成途徑四、蘋果酸合成途徑 EMPEMP 固定固定COCO2 2 淀粉淀粉 葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸 草酰乙酸草酰乙酸 蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶 蘋果酸蘋果酸 證據(jù)證據(jù)（1 1）發(fā)酵依賴于）發(fā)酵依賴于CaCOCaCO3 3或其它碳酸鹽。或其它碳酸鹽。（2 2）蘋果酸對(duì)糖的最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)）蘋果酸對(duì)糖的最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)128128，說明部，說明部分碳源是外源性的（不是從葡萄糖來的）。分碳源是外源性的（不是從葡萄糖來的）。CaCOCaCO3 3的的雙重作用雙重作用:（1 1）提供外源的羧基碳源）提供外源的羧基碳源（2 2）調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)pHpH 五、蘋果酸的提取五、蘋果酸的提取 反應(yīng)液中有殘余的富馬酸鹽和多量的蘋果酸鹽。反應(yīng)液中有殘余的富馬酸鹽和多量的蘋果酸鹽。提取原理：利用富馬酸難溶于水的性質(zhì)，在反應(yīng)提取原理：利用富馬酸難溶于水的性質(zhì)，在反應(yīng) 液中加酸使富馬酸沉淀析出。液中加酸使富馬酸沉淀析出。H H2 2SOSO4 4 過濾過濾 CaCOCaCO3 3流程：發(fā)酵液流程：發(fā)酵液 富馬酸富馬酸 濾液濾液 蘋果酸鈣蘋果酸鈣 過濾過濾 離子交換離子交換 濃縮濃縮 結(jié)晶結(jié)晶 干燥干燥 蘋果酸蘋果酸 H H2 2SOSO4 4 第四節(jié)第四節(jié) 黃原膠黃原膠 一、多糖一、多糖 1.1.概況：概況：多糖是由多個(gè)單糖或其衍生物聚合而成多糖是由多個(gè)單糖或其衍生物聚合而成的大分子化合物。的大分子化合物。高等植物高等植物 傳統(tǒng)使用的多糖來自傳統(tǒng)使用的多糖來自 藻類藻類2.2.多糖的分類多糖的分類 植物多糖植物多糖（1 1）根據(jù)多糖的來源不同）根據(jù)多糖的來源不同 動(dòng)物多糖動(dòng)物多糖 微生物多糖微生物多糖 （2 2）根據(jù)多糖在微生物體內(nèi)的分泌部位）根據(jù)多糖在微生物體內(nèi)的分泌部位 胞內(nèi)多糖胞內(nèi)多糖 細(xì)胞壁多糖細(xì)胞壁多糖 胞外多糖胞外多糖二、黃單胞菌多糖二、黃單胞菌多糖 又稱黃原膠，漢生膠，是微生物多糖又稱黃原膠，漢生膠，是微生物多糖中產(chǎn)量最大的一種。中產(chǎn)量最大的一種。最早由美國依利諾斯州的皮奧里爾實(shí)最早由美國依利諾斯州的皮奧里爾實(shí)驗(yàn)室于驗(yàn)室于19621962年發(fā)現(xiàn)，年發(fā)現(xiàn)，19641964年實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生年實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，在美國的生產(chǎn)規(guī)模僅次于抗生素和溶產(chǎn)，在美國的生產(chǎn)規(guī)模僅次于抗生素和溶劑，列第三位。劑，列第三位。1.1.黃原膠的結(jié)構(gòu)特征黃原膠的結(jié)構(gòu)特征2.2.1975 1975年闡明，由年闡明，由5 5分子糖為一單元，分子糖為一單元，并由相同的單元聚合而成的高分子多糖物并由相同的單元聚合而成的高分子多糖物質(zhì)，即質(zhì)，即“五糖重復(fù)單元五糖重復(fù)單元”聚合而成。聚合而成。3.3.D-D-葡萄糖：葡萄糖：D-D-甘露糖：甘露糖：D-D-葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸4.4.2 2 ：2 2 ：1 12.2.黃原膠的性質(zhì)黃原膠的性質(zhì)（1 1）典型的流變特性）典型的流變特性（2 2）低濃度時(shí)的高粘性）低濃度時(shí)的高粘性（3 3）耐熱、耐酸堿性）耐熱、耐酸堿性（4 4）相容性及溶解性）相容性及溶解性（5 5）分散性及保水性）分散性及保水性3.3.黃原膠的用途黃原膠的用途（1 1）能源開發(fā)）能源開發(fā)（2 2）食品工業(yè)）食品工業(yè)（3 3）其它工業(yè)）其它工業(yè)三、黃原膠的生產(chǎn)三、黃原膠的生產(chǎn) 1.1.菌種菌種 引起甘藍(lán)黑腐病的病原細(xì)菌引起甘藍(lán)黑腐病的病原細(xì)菌野油菜野油菜黃單胞菌（黃單胞菌（Xanthomonas campestrisXanthomonas campestris）。）。桿狀，桿狀，G G，產(chǎn)莢膜。產(chǎn)莢膜。平板：黃色粘稠菌落，液體培養(yǎng)形成粘稠狀膠狀物。平板：黃色粘稠菌落，液體培養(yǎng)形成粘稠狀膠狀物。2.2.培養(yǎng)基培養(yǎng)基（1 1）碳源：葡萄糖）碳源：葡萄糖(國外國外),),淀粉淀粉(國內(nèi)國內(nèi))。（2 2）氮源：易利用有機(jī)氮（魚粉和豆粉），）氮源：易利用有機(jī)氮（魚粉和豆粉），不易利用無機(jī)氮。不易利用無機(jī)氮。（3 3）無機(jī)鹽：）無機(jī)鹽：K K2 2HPOHPO4 4、MgSOMgSO4 4.7H.7H2 2O O、輕質(zhì)輕質(zhì) CaCOCaCO3 3對(duì)發(fā)酵有明顯的促進(jìn)作用。對(duì)發(fā)酵有明顯的促進(jìn)作用。3.3.培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 溫度：溫度：2525 2828 pH:6.5pH:6.5 7.07.0 周期：周期：7272 9696h h 高粘度發(fā)酵液影響供氧，解決方法：高粘度發(fā)酵液影響供氧，解決方法：提高攪拌轉(zhuǎn)速提高攪拌轉(zhuǎn)速a.a.改進(jìn)發(fā)酵設(shè)備，提高供氧能力改進(jìn)發(fā)酵設(shè)備，提高供氧能力 提高通氣速率提高通氣速率b.b.限制細(xì)胞濃度，控制氧的需求量限制細(xì)胞濃度，控制氧的需求量補(bǔ)料分批補(bǔ)料分批 培養(yǎng)（后期流加糖）。培養(yǎng)（后期流加糖）。四、黃原膠的提取四、黃原膠的提取 主要方法：沉淀法主要方法：沉淀法 1.1.有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法發(fā)酵液乙醇發(fā)酵液乙醇 黃原膠沉淀（工業(yè)級(jí)黃原膠）黃原膠沉淀（工業(yè)級(jí)黃原膠）離心除菌體，多次用酒精沉淀、洗滌，得食品離心除菌體，多次用酒精沉淀、洗滌，得食品級(jí)黃原膠。級(jí)黃原膠。2.2.鈣鹽工業(yè)酒精沉淀法鈣鹽工業(yè)酒精沉淀法 酸性乙醇酸性乙醇黃原膠黃原膠CaClCaCl2 2 黃原膠鈣沉淀黃原膠鈣沉淀 黃原膠黃原膠CaCa2+2+特點(diǎn)：特點(diǎn)：有機(jī)溶劑用量減少一半，但在成品中帶入了鈣離子。有機(jī)溶劑用量減少一半，但在成品中帶入了鈣離子。五、工藝流程五、工藝流程斜面種子斜面種子 一級(jí)種子一級(jí)種子 二級(jí)種子二級(jí)種子 罐發(fā)酵罐發(fā)酵 提取提取 離心離心 烘干烘干 磨碎磨碎 過篩過篩 產(chǎn)品產(chǎn)品 第一章第一章 菌種選育菌種選育 第一節(jié)第一節(jié) 工業(yè)常用微生物及要求工業(yè)常用微生物及要求一、常見微生物一、常見微生物 （一）細(xì)菌（一）細(xì)菌（bacteriabacteria）醋桿菌屬（醋桿菌屬（AcetobacterAcetobacter）乳桿菌屬（乳桿菌屬（LactobacillusLactobacillus）芽孢桿菌屬（芽孢桿菌屬（BacillusBacillus）短桿菌屬（短桿菌屬（BrevibacteriumBrevibacterium）棒桿菌屬（棒桿菌屬（CorynebacteriumCorynebacterium）（二）放線菌（二）放線菌（actinomycesactinomyces）最大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于產(chǎn)生多種抗生素最大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于產(chǎn)生多種抗生素（antibioticantibiotic）鏈霉菌（鏈霉菌（StreptomycesStreptomyces）小單孢菌屬（小單孢菌屬（MicromonosporaMicromonospora）（三）霉菌（三）霉菌（mouldmould）1.1.曲霉屬（曲霉屬（AspergillusAspergillus）黑曲霉（黑曲霉（A.nigerA.niger）米曲霉（米曲霉（A.oryzaeA.oryzae）黃曲霉（黃曲霉（A.flavusA.flavus）2.2.青霉屬（青霉屬（PenicillumPenicillum）桔青霉（桔青霉（P.citrinumP.citrinum）產(chǎn)生產(chǎn)生5 5磷酸二酯酶，降解核糖核酸為四個(gè)單核苷酸。磷酸二酯酶，降解核糖核酸為四個(gè)單核苷酸。3.3.根霉屬（根霉屬（RhizopusRhizopus ）米根霉（米根霉（R.oryzaeR.oryzae）華根霉（華根霉（R.chinensisR.chinensis）4.4.紅曲霉屬（紅曲霉屬（MonascusMonascus）（四）酵母（四）酵母（yeastyeast）1.1.酵母屬（酵母屬（SaccharomycesSaccharomyces）啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）2.2.假絲酵母屬（假絲酵母屬（CandidaCandida）產(chǎn)朊假絲酵母（產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilisCandida utilis）3.3.畢赤酵母屬（畢赤酵母屬（PichiaPichia）（五）其它微生物（五）其它微生物1.1.擔(dān)子菌（擔(dān)子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）即菇類）即菇類（mushroommushroom）2.2.藻類（藻類（algaalga）幾幾種種菌菌落落 （六）噬菌體（六）噬菌體（phagephage）危害以細(xì)菌和放線菌為生危害以細(xì)菌和放線菌為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。特點(diǎn)：特點(diǎn)：1.1.體積比細(xì)菌小得多，可以通體積比細(xì)菌小得多，可以通 過細(xì)菌濾器。過細(xì)菌濾器。2.2.沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋 白質(zhì)構(gòu)成。白質(zhì)構(gòu)成。3.3.營專性活物寄生，即只能在營專性活物寄生，即只能在 特異性寄主細(xì)胞中增殖。特異性寄主細(xì)胞中增殖。烈性噬菌體烈性噬菌體 引起寄主細(xì)胞迅速裂解。引起寄主細(xì)胞迅速裂解。受感染的細(xì)菌稱敏感性細(xì)菌。受感染的細(xì)菌稱敏感性細(xì)菌。溫和噬菌體溫和噬菌體 隨寄主細(xì)胞的繁殖而繁殖。隨寄主細(xì)胞的繁殖而繁殖。含溫和噬菌體的細(xì)菌稱溶原性細(xì)菌。含溫和噬菌體的細(xì)菌稱溶原性細(xì)菌。吸附吸附吸附吸附注入核酸注入核酸注入核酸注入核酸合成核酸和蛋白質(zhì)合成核酸和蛋白質(zhì)合成核酸和蛋白質(zhì)合成核酸和蛋白質(zhì)釋放釋放釋放釋放裝配裝配裝配裝配 二、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求二、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求1.1.原料廉價(jià)，生長迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。原料廉價(jià)，生長迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。2.2.易控制培養(yǎng)條件，發(fā)酵周期較短。易控制培養(yǎng)條件，發(fā)酵周期較短。3.3.抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)?？闺s菌和噬菌體的能力強(qiáng)。4.4.不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)和不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)和 毒素。毒素。第二節(jié)第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育工業(yè)微生物菌種的選育一、自然選育一、自然選育（一）從自然界分離獲得菌種（一）從自然界分離獲得菌種采樣采樣增殖培養(yǎng)增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)（富集培養(yǎng) enrichmentenrichment）提供有利于所需菌株生長而不利于提供有利于所需菌株生長而不利于其它菌型生長的條件，即其它菌型生長的條件，即讓目的微生物讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。方法：方法：（1 1）控制培養(yǎng)基成分）控制培養(yǎng)基成分（2 2）控制培養(yǎng)條件）控制培養(yǎng)條件（3 3）抑制不需要的菌類）抑制不需要的菌類3.3.純種分離純種分離（1 1）劃線法：簡單、快捷。）劃線法：簡單、快捷。（2 2）稀釋法：菌落單一均勻，適合分）稀釋法：菌落單一均勻，適合分 離具有蔓延性的微生物。離具有蔓延性的微生物。固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法接種針先以火焰滅菌法滅菌接種針先以火焰滅菌法滅菌 步驟一輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻 步驟二以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。步驟三更換一個(gè)新的無菌營養(yǎng)平板更換一個(gè)新的無菌營養(yǎng)平板 步驟四將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營養(yǎng)平板將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)上。此為第一菌區(qū) 。步驟五重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。步驟六由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。區(qū)，如右上圖。步驟七重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。步驟八重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營養(yǎng)平板，如右上圖。的營養(yǎng)平板，如右上圖。步驟九 在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、操簽，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及作者姓名、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。培養(yǎng)基名稱。步驟十步驟十固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法需要使用的儀器需要使用的儀器震蕩機(jī)震蕩機(jī) 吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液吸取充分均勻后的菌液吸取充分均勻后的菌液 取含有取含有 9mL9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。無菌水之試管，將試管口過火滅菌。將菌液置入，此時(shí)試管須做記號(hào)為第一次稀釋。將菌液置入，此時(shí)試管須做記號(hào)為第一次稀釋。將將試試管管于于震震蕩蕩機(jī)機(jī)上上，使使菌菌液液混混合合均均勻勻 取出試管中的第一次十倍稀釋菌液取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL1mL，加入另一個(gè)新的含加入另一個(gè)新的含9mL9mL無菌水的試管中。無菌水的試管中。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。從最后稀釋菌液中吸取從最后稀釋菌液中吸取 0.1mL0.1mL菌液，菌液，置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。將三角玻璃棒浸于酒精中將三角玻璃棒浸于酒精中 將三角玻璃棒在火焰上燃燒將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。數(shù)推算出菌液濃度。4.4.生產(chǎn)性能的測定生產(chǎn)性能的測定 一般采用兩步法：一般采用兩步法：初篩：以量為主初篩：以量為主 復(fù)篩：以質(zhì)為主復(fù)篩：以質(zhì)為主（二）從自發(fā)突變體中獲得菌株（二）從自發(fā)突變體中獲得菌株 自自然然狀狀態(tài)態(tài)下下，堿堿基基對(duì)對(duì)發(fā)發(fā)生生自自然然突突變變的的機(jī)機(jī)率為率為1010-8-81010-9-9，自然突變有兩種情況，自然突變有兩種情況：一一種種是是我我們們生生產(chǎn)產(chǎn)上上所所不不希希望望看看到到的的，表表現(xiàn)現(xiàn)為為菌菌株株的的衰衰退退和和生生產(chǎn)產(chǎn)質(zhì)質(zhì)量量的的下下降降，這這種種突突變稱為負(fù)突變。變稱為負(fù)突變。另另一一種種是是我我們們生生產(chǎn)產(chǎn)上上希希望望看看到到的的，對(duì)對(duì)生生產(chǎn)有利，這種突變稱為正突變。產(chǎn)有利，這種突變稱為正突變。二、誘變育種二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種。因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑。稱為誘變劑。誘變劑誘變劑物理：紫外線，快中子物理：紫外線，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍 誘變育種的主要環(huán)節(jié)誘變育種的主要環(huán)節(jié)（1 1）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液 誘變誘變（2 2）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，選出性能優(yōu)良的正變異株選出性能優(yōu)良的正變異株篩選篩選 （一）誘變育種的程序（一）誘變育種的程序選擇出發(fā)菌株選擇出發(fā)菌株 制備菌懸液制備菌懸液 前培養(yǎng)前培養(yǎng) 物理誘變物理誘變誘變誘變 變異菌株的分離和篩選變異菌株的分離和篩選 化學(xué)誘變化學(xué)誘變（二）突變株的篩選（二）突變株的篩選1.1.隨機(jī)篩選：傳統(tǒng)方法隨機(jī)篩選：傳統(tǒng)方法（1 1）搖瓶篩選法）搖瓶篩選法（2 2）瓊脂塊篩選法）瓊脂塊篩選法2.2.理化性篩選理化性篩選方法一：降低終產(chǎn)物濃度方法一：降低終產(chǎn)物濃度a.a.篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型nAaBbCcDdEnb.b.篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株 使終產(chǎn)物排出細(xì)胞，以降低細(xì)胞內(nèi)終使終產(chǎn)物排出細(xì)胞，以降低細(xì)胞內(nèi)終產(chǎn)物濃度。產(chǎn)物濃度。如：用谷氨酸棒桿菌（如：用谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium Corynebacterium glutamicumglutamicum）的生物素營養(yǎng)缺陷型）的生物素營養(yǎng)缺陷型（biotin deficiencybiotin deficiency）進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵。）進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵。生物素：生物素：B B族維生素的一種，又稱維族維生素的一種，又稱維生素生素H H或輔酶或輔酶R R。是合成脂肪酸所必需的。是合成脂肪酸所必需的。脂肪酸的生物合成：脂肪酸的生物合成：利用乙酰利用乙酰CoACoA（直接原料是丙二酸單（直接原料是丙二酸單酰酰CoACoA）在乙酰）在乙酰CoACoA羧化酶（輔基為生物羧化酶（輔基為生物素）催化下合成。素）催化下合成。脂肪酸甘油磷酸脂肪酸甘油磷酸 磷脂蛋白質(zhì)磷脂蛋白質(zhì) 生物膜生物膜 因此，脂肪酸是組成細(xì)胞膜類脂的必要成分。因此，脂肪酸是組成細(xì)胞膜類脂的必要成分。生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透過細(xì)胞膜分泌至體外。谷氨酸透過細(xì)胞膜分泌至體外。使胞內(nèi)代謝產(chǎn)物迅速排出的方法使胞內(nèi)代謝產(chǎn)物迅速排出的方法 1.用生理學(xué)手段用生理學(xué)手段 直接抑制膜合成或使膜受缺損直接抑制膜合成或使膜受缺損 如如:Glu發(fā)酵中，控制生物素發(fā)酵中，控制生物素亞適量亞適量可大量分泌可大量分泌Glu；當(dāng)培養(yǎng)液中生物素含量較高時(shí)采用當(dāng)培養(yǎng)液中生物素含量較高時(shí)采用適量添加青霉適量添加青霉素素的方法；的方法；2.利用膜缺損突變株利用膜缺損突變株 油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型如如:用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，限制地添加油酸，用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，限制地添加油酸，合成有缺損的膜。合成有缺損的膜。應(yīng)用甘油缺陷型菌株，即便在生物素或油酸過量的應(yīng)用甘油缺陷型菌株，即便在生物素或油酸過量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸。情況下，也可以獲得大量谷氨酸?？刂萍?xì)胞膜的滲透性控制細(xì)胞膜的滲透性1.1.通過生理學(xué)手段控制細(xì)胞膜滲透性通過生理學(xué)手段控制細(xì)胞膜滲透性2.2.通過細(xì)胞膜缺損突變控制細(xì)胞膜滲透性通過細(xì)胞膜缺損突變控制細(xì)胞膜滲透性生物素生物素谷氨酸谷氨酸細(xì)胞膜滲透性細(xì)胞膜滲透性青霉素青霉素谷氨酸谷氨酸油酸缺陷型油酸缺陷型油酸油酸方法二：篩選抗反饋突變株方法二：篩選抗反饋突變株抗反饋控制突變株抗反饋控制突變株是指對(duì)反饋抑制不敏是指對(duì)反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐?，或兩者兼有之的菌株。感或?qū)ψ瓒粲锌剐?，或兩者兼有之的菌株?？狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮目狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮慕K產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株似物抗性突變株中獲得。中獲得。營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選誘變誘變淘汰野生型菌株：淘汰野生型菌株：抗菌素法、菌絲過濾法抗菌素法、菌絲過濾法檢出缺陷型：檢出缺陷型：影印法影印法夾層法夾層法逐個(gè)檢出法逐個(gè)檢出法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法確定生長譜確定生長譜 第三節(jié)第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的改良生產(chǎn)菌種的改良 一、原生質(zhì)體融合（一、原生質(zhì)體融合（protoplast fusionprotoplast fusion）1.1.標(biāo)記菌株的篩選標(biāo)記菌株的篩選 2.2.原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 3.3.原生質(zhì)體的融合與再生原生質(zhì)體的融合與再生 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）脫水劑）脫水劑 助融劑助融劑 CaCa2+2+提高融合頻率提高融合頻率 4.4.融合子的選擇融合子的選擇二、二、DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù) （DNA recombination technologyDNA recombination technology）1.1.目標(biāo)目標(biāo)DNADNA片斷的獲得片斷的獲得2.2.與載體與載體DNADNA分子的連接分子的連接3.3.重組重組DNADNA分子引入宿主細(xì)胞分子引入宿主細(xì)胞4.4.從中選出所需重組從中選出所需重組DNADNA分子的宿主細(xì)胞分子的宿主細(xì)胞 第四節(jié)第四節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯與保藏菌種的衰退、復(fù)壯與保藏一、菌種的衰退一、菌種的衰退 衰退原因衰退原因1.1.菌種保藏不當(dāng)菌種保藏不當(dāng)2.2.菌種生長條件沒有得到滿足菌種生長條件沒有得到滿足二、二、菌種的復(fù)壯菌種的復(fù)壯 1.1.純種分離純種分離 2.2.通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯 3.3.淘汰已衰退的個(gè)體淘汰已衰退的個(gè)體三、菌種保藏三、菌種保藏 1.1.原理原理 低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)物質(zhì)低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)物質(zhì) 2.2.方法方法 （1 1）斜面保藏法）斜面保藏法 （2 2）干燥保藏法）干燥保藏法 （3 3）懸液保藏法）懸液保藏法 （4 4）冷凍干燥保藏法）冷凍干燥保藏法 （5 5）液氮保藏法）液氮保藏法 （6 6）低溫保藏法）低溫保藏法 第五節(jié)第五節(jié) 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)一、微生物的培養(yǎng)方法一、微生物的培養(yǎng)方法 1.1.表面培養(yǎng)表面培養(yǎng) 2.2.固體培養(yǎng)固體培養(yǎng) 3.3.液體深層培養(yǎng)液體深層培養(yǎng)二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念 指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。為種子。菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的：菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的：為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。代謝旺盛的種子。q接種量的需要接種量的需要q菌種的馴化菌種的馴化q縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平 （一）種子制備的工藝流程（一）種子制備的工藝流程 搖瓶搖瓶保藏菌種保藏菌種 試管斜面活化試管斜面活化 茄瓶斜面茄瓶斜面 種子罐種子罐 固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基生理代謝生理代謝菌種篩選菌種篩選種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)（二）（二）斜面菌種的培養(yǎng)斜面菌種的培養(yǎng) 1.1.不宜多次移種。不宜多次移種。2.2.活化斜面中加活化斜面中加0.1%0.1%葡萄糖。葡萄糖。培養(yǎng)基特點(diǎn)：原料較精細(xì)。培養(yǎng)基特點(diǎn)：原料較精細(xì)。（三）一級(jí)種子培養(yǎng)（搖瓶）（三）一級(jí)種子培養(yǎng)（搖瓶）培養(yǎng)基特點(diǎn)培養(yǎng)基特點(diǎn)：使用的原料基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。使用的原料基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。（四）二級(jí)種子培養(yǎng)（種子罐）（四）二級(jí)種子培養(yǎng)（種子罐）培養(yǎng)基的特點(diǎn)培養(yǎng)基的特點(diǎn)：和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，水解糖代替，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。（五）種子罐級(jí)數(shù)（五）種子罐級(jí)數(shù)制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。谷氨酸：一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（二級(jí)發(fā)酵）谷氨酸：一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（二級(jí)發(fā)酵）搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)一級(jí)種子（小罐）一級(jí)種子（小罐）發(fā)酵發(fā)酵青霉素：二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（三級(jí)發(fā)酵）青霉素：二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（三級(jí)發(fā)酵）搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)一級(jí)種子（小罐）一級(jí)種子（小罐）二級(jí)種子（中罐）二級(jí)種子（中罐）發(fā)酵發(fā)酵發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù)發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù)q級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種 量的影響。量的影響。q級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管 理困難，一般理困難，一般2-42-4級(jí)。級(jí)。（六）種齡與接種量（六）種齡與接種量 1.1.種齡種齡 種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級(jí)種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對(duì)數(shù)生長期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)原則：對(duì)數(shù)生長期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì) 較大。較大。2.2.接種量接種量 移入種子的體積移入種子的體積接種量接種量 接種后培養(yǎng)液的體積接種后培養(yǎng)液的體積 一般：一般：細(xì)菌細(xì)菌 1 1 霉菌霉菌 7 7 1515雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。大量地接入培養(yǎng)成熟菌種的優(yōu)點(diǎn)：大量地接入培養(yǎng)成熟菌種的優(yōu)點(diǎn)：1.1.可以縮短生長過程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵可以縮短生長過程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵 周期，提高了設(shè)備利用率。周期，提高了設(shè)備利用率。2.2.節(jié)約了發(fā)酵培養(yǎng)的動(dòng)力消耗。節(jié)約了發(fā)酵培養(yǎng)的動(dòng)力消耗。3.3.并有利于減少染菌機(jī)會(huì)。并有利于減少染菌機(jī)會(huì)。工業(yè)發(fā)酵的目的工業(yè)發(fā)酵的目的：大量積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物大量積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。代謝的人工控制代謝的人工控制：人為地打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝人為地打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行。著人們希望的方向進(jìn)行。人工控制代謝的手段人工控制代謝的手段：改變微生物遺傳特性改變微生物遺傳特性(遺傳學(xué)方法）；遺傳學(xué)方法）；控制發(fā)酵條件（生物化學(xué)方法）；控制發(fā)酵條件（生物化學(xué)方法）；改變細(xì)胞膜透性；改變細(xì)胞膜透性； 第三章第三章 培養(yǎng)基滅菌與空氣凈化培養(yǎng)基滅菌與空氣凈化 第一節(jié)第一節(jié) 培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌 一、滅菌的原理和方法一、滅菌的原理和方法 消毒消毒（disinfectiondisinfection）與滅菌與滅菌（sterilizationsterilization）的區(qū)別？的區(qū)別？消毒是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、消毒是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病原微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞器具內(nèi)外的病原微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。而不能殺死細(xì)菌芽孢。例如，巴氏消毒法，是將例如，巴氏消毒法，是將物料加熱至物料加熱至6060維持維持3030minmin，以殺死不耐高溫的微以殺死不耐高溫的微生物營養(yǎng)細(xì)胞。生物營養(yǎng)細(xì)胞。滅菌是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中滅菌是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。所有微生物，包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。消毒不一定能達(dá)到滅菌要求，而滅菌則可達(dá)消毒不一定能達(dá)到滅菌要求，而滅菌則可達(dá)到消毒的目的。到消毒的目的。防腐（防腐（antisepsisantisepsis）防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止食品等腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。發(fā)生霉腐的措施。（1 1）低溫）低溫 （4 4）高滲）高滲 （2 2）缺氧）缺氧 （5 5）高酸度）高酸度 （3 3）干燥）干燥 （6 6）防腐劑）防腐劑 除菌的方法除菌的方法 培養(yǎng)基的加熱滅菌培養(yǎng)基的加熱滅菌空氣的過濾除菌空氣的過濾除菌紫外線或電離輻射紫外線或電離輻射化學(xué)藥物滅菌化學(xué)藥物滅菌 1.1.化學(xué)試劑滅菌法化學(xué)試劑滅菌法 甲醛、乙醇或新潔爾滅、高錳酸鉀等甲醛、乙醇或新潔爾滅、高錳酸鉀等 適用范圍：環(huán)境、皮膚及器械的表面消毒適用范圍：環(huán)境、皮膚及器械的表面消毒2.2.射線滅菌射線滅菌法法3.3.干熱滅菌法干熱滅菌法 電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)適用范圍：無菌室、接種箱適用范圍：無菌室、接種箱常用烘箱，滅菌條件：常用烘箱，滅菌條件：160160下保溫下保溫1 1h h 適用范圍：金屬或玻璃器皿適用范圍：金屬或玻璃器皿4.4.濕熱滅菌法濕熱滅菌法 利用飽和蒸汽滅菌，條件：利用飽和蒸汽滅菌，條件：121121，3030min min 適用范圍：生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基滅菌適用范圍：生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基滅菌5.5.過濾除菌法過濾除菌法 利用過濾方法阻留微生物利用過濾方法阻留微生物 適用范圍：制備無菌空氣適用范圍：制備無菌空氣 6.6.火焰滅菌法火焰滅菌法 火焰火焰 適用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口適用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口 二、培養(yǎng)基的濕熱滅菌二、培養(yǎng)基的濕熱滅菌 濕熱濕熱滅菌原理滅菌原理滅菌條件滅菌條件滅菌不利方面滅菌不利方面蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力，而且在冷蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力，而且在冷凝時(shí)會(huì)放出大量的冷凝熱，很容易使凝時(shí)會(huì)放出大量的冷凝熱，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺死各種微生物。蛋白質(zhì)凝固而殺死各種微生物。121，30min。同時(shí)會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，甚同時(shí)會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，甚至產(chǎn)生不利于菌體生長的物質(zhì)。至產(chǎn)生不利于菌體生長的物質(zhì)。將配制好的培養(yǎng)基將配制好的培養(yǎng)基同時(shí)放在同時(shí)放在發(fā)酵罐發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起進(jìn)行加熱滅菌的過程，也稱用設(shè)備一起進(jìn)行加熱滅菌的過程，也稱實(shí)罐滅菌。實(shí)罐滅菌。（一）間歇滅菌（一）間歇滅菌（常用）（常用）24016012080時(shí)間（min)050100150溫度升溫冷卻保溫培養(yǎng)基間歇滅菌過程培養(yǎng)基間歇滅菌過程中的溫度變化情況中的溫度變化情況過程包括：過程包括：升溫、保溫和冷卻升溫、保溫和冷卻三階段。三階段。各階段對(duì)滅菌的各階段對(duì)滅菌的貢獻(xiàn)：貢獻(xiàn)：20%20%、75%75%、5%5%。發(fā)酵罐發(fā)酵罐蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽冷卻水冷卻水無菌無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基配料罐配料罐泵泵加熱塔加熱塔維持罐維持罐冷卻管冷卻管（二）連續(xù)滅菌（又稱連消）（二）連續(xù)滅菌（又稱連消）將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外通過連續(xù)滅菌裝置進(jìn)行將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外通過連續(xù)滅菌裝置進(jìn)行加熱、保溫和冷卻而進(jìn)行滅菌。加熱、保溫和冷卻而進(jìn)行滅菌。連續(xù)滅菌的基本設(shè)備有哪些連續(xù)滅菌的基本設(shè)備有哪些？問題問題連續(xù)滅菌的流程與設(shè)備連續(xù)滅菌的流程與設(shè)備（1 1）配料預(yù)熱罐，）配料預(yù)熱罐，將配制好的料液預(yù)熱到將配制好的料液預(yù)熱到6060 70 70 C，以免連續(xù)滅菌時(shí)由于料液與蒸汽溫度相差以免連續(xù)滅菌時(shí)由于料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲；過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲；（2 2）連消塔，）連消塔，用高溫蒸汽使料液用高溫蒸汽使料液溫度很快升高到溫度很快升高到滅菌溫度（滅菌溫度（126126 132132C）；（3 3）維持罐，維持罐，使料液在滅菌溫度下保持使料液在滅菌溫度下保持5 5 7 7minmin。因?yàn)椋阂驗(yàn)椋哼B消塔加熱的時(shí)間很短，光靠這段時(shí)間連消塔加熱的時(shí)間很短，光靠這段時(shí)間的滅菌是不夠的的滅菌是不夠的；（4 4）冷卻管，）冷卻管，使料液使料液冷卻到冷卻到4040 5050C后（冷水后（冷水噴淋）噴淋），輸送到預(yù)先滅菌過的罐內(nèi)。，輸送到預(yù)先滅菌過的罐內(nèi)。連續(xù)滅菌過程中溫度的變化連續(xù)滅菌過程中溫度的變化(虛線虛線)優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn)缺缺 點(diǎn)點(diǎn)連連續(xù)續(xù)滅滅菌菌1.1.高溫短時(shí)滅菌，培養(yǎng)基高溫短時(shí)滅菌，培養(yǎng)基 營養(yǎng)成分損失少。營養(yǎng)成分損失少。2.2.發(fā)酵罐占用時(shí)間縮短，發(fā)酵罐占用時(shí)間縮短，利用率高。利用率高。1.1.設(shè)備復(fù)雜，操作麻煩設(shè)備復(fù)雜，操作麻煩,染菌機(jī)會(huì)多。染菌機(jī)會(huì)多。2.2.不適合含大量固體物不適合含大量固體物 料的滅菌。料的滅菌。間間歇歇滅滅菌菌1.1.設(shè)備要求低，不需另外設(shè)備要求低，不需另外 加熱、冷卻裝置。加熱、冷卻裝置。2.2.操作要求低，適合小批操作要求低，適合小批 量生產(chǎn)規(guī)模量生產(chǎn)規(guī)模3.3.適合含大量固體物料的適合含大量固體物料的 滅菌滅菌1.1.培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)損培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)損 失大，滅菌后培養(yǎng)基失大，滅菌后培養(yǎng)基 質(zhì)量下降質(zhì)量下降2.2.發(fā)酵罐的利用率較低發(fā)酵罐的利用率較低3.3.不適合大規(guī)模生產(chǎn)的不適合大規(guī)模生產(chǎn)的 滅菌滅菌（三）間歇滅菌與連續(xù)滅菌的比較（三）間歇滅菌與連續(xù)滅菌的比較 第二節(jié)第二節(jié) 空氣凈化（除菌）空氣凈化（除菌）發(fā)酵對(duì)空氣無菌程度的要求發(fā)酵對(duì)空氣無菌程度的要求 一般要求一般要求10001000次使用周期中只允許有次使用周期中只允許有一個(gè)菌通過，即經(jīng)過濾后空氣的無菌程度一個(gè)菌通過，即經(jīng)過濾后空氣的無菌程度為為N=10N=10-3-3?？諝庵形⑸锟諝庵形⑸?包括細(xì)菌、酵母、霉菌和包括細(xì)菌、酵母、霉菌和病毒病毒)含量一般為含量一般為10103 3 10104 4個(gè)米個(gè)米3 3。一般。一般附著在空氣中的灰塵上或霧滴上。附著在空氣中的灰塵上或霧滴上?；覊m粒子的平均大小約灰塵粒子的平均大小約0.60.6mm左右，空氣左右，空氣除菌主要去除空氣中的微粒除菌主要去除空氣中的微粒(0.6(0.61 1mm）。）。一、空氣除菌的方法一、空氣除菌的方法 （一）（一）輻射殺菌輻射殺菌（二）（二）熱殺菌熱殺菌（三）（三）靜電除菌靜電除菌（四）（四）過濾除菌過濾除菌 二、空氣過濾除菌的原理與介質(zhì)二、空氣過濾除菌的原理與介質(zhì) 1.1.過濾除菌的種類過濾除菌的種類絕對(duì)過濾：絕對(duì)過濾：過濾介質(zhì)的濾孔小于細(xì)胞和孢子。過濾介質(zhì)的濾孔小于細(xì)胞和孢子。如聚乙烯醇縮甲醛樹脂（如聚乙烯醇縮甲醛樹脂（PVFPVF）制成的制成的0.3 0.3 m m的的微孔微孔濾濾膜。膜。深層介質(zhì)過濾：深層介質(zhì)過濾：介質(zhì)的孔隙一般大于微生物細(xì)胞。介質(zhì)的孔隙一般大于微生物細(xì)胞。如用棉花、玻璃纖維和顆粒活性炭填充的過濾器。如用棉花、玻璃纖維和顆?；钚蕴刻畛涞倪^濾器。2.2.深層介質(zhì)過濾的原理深層介質(zhì)過濾的原理 微粒隨氣流通過濾層時(shí)，由于濾層纖維的層微粒隨氣流通過濾層時(shí)，由于濾層纖維的層層阻礙，使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運(yùn)動(dòng)速度和方向?qū)幼璧K，使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運(yùn)動(dòng)速度和方向的繞流運(yùn)動(dòng)，引起微粒與濾層纖維間產(chǎn)生的繞流運(yùn)動(dòng)，引起微粒與濾層纖維間產(chǎn)生慣性沖慣性沖擊、攔截、布朗擴(kuò)散、重力沉降、靜電引力擊、攔截、布朗擴(kuò)散、重力沉降、靜電引力等作等作用把微粒滯留在纖維表面上，實(shí)現(xiàn)過濾的目的。用把微粒滯留在纖維表面上，實(shí)現(xiàn)過濾的目的。3.3.空氣過濾除菌介質(zhì)空氣過濾除菌介質(zhì) （）纖維狀或顆粒狀過濾介質(zhì)（）纖維狀或顆粒狀過濾介質(zhì)棉花：常用，有彈性，纖維長度適中。棉花：常用，有彈性，纖維長度適中。玻璃纖維：纖維直徑小，不易折斷，過濾效果好。玻璃纖維：纖維直徑小，不易折斷，過濾效果好?；钚蕴浚阂筚|(zhì)地堅(jiān)硬，顆粒均勻?；钚蕴浚阂筚|(zhì)地堅(jiān)硬，顆粒均勻。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：體積大，裝填費(fèi)時(shí)費(fèi)力，松緊度不易掌體積大，裝填費(fèi)時(shí)費(fèi)力，松緊度不易掌握，空氣壓降大。握，空氣壓降大。（）紙類過濾介質(zhì)（）紙類過濾介質(zhì)超細(xì)玻璃纖維紙超細(xì)玻璃纖維紙 3 3 6 6張疊在一起使用，過濾效率高，壓降小。張疊在一起使用，過濾效率高，壓降小。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：強(qiáng)度不大（特別是受潮后）。強(qiáng)度不大（特別是受潮后）。發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大致過程大致過程 空氣空氣 空壓機(jī)空壓機(jī) 貯氣罐貯氣罐 冷卻冷卻 除油水除油水 加熱加熱 空氣預(yù)處理空氣預(yù)處理 總過濾器總過濾器 分過濾器分過濾器 無菌空氣無菌空氣 空氣過濾空氣過濾三、空氣的預(yù)處理三、空氣的預(yù)處理 目的目的:提高壓縮前空氣的潔凈度提高壓縮前空氣的潔凈度去除壓縮后空氣中的油和水去除壓縮后空氣中的油和水1.1.提高壓縮前空氣的潔凈度提高壓縮前空氣的潔凈度（1 1）提高空氣吸氣口的位置）提高空氣吸氣口的位置（2 2）在空氣入口處設(shè)置粗過濾器）在空氣入口處設(shè)置粗過濾器 捕集較大的灰塵顆粒，并保護(hù)空壓機(jī)。捕集較大的灰塵顆粒，并保護(hù)空壓機(jī)。高空取氣管高空取氣管 為遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。為遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。每升高每升高1010米，空氣中雜菌米，空氣中雜菌降低一個(gè)數(shù)量級(jí)。因此從降低一個(gè)數(shù)量級(jí)。因此從高空取氣要比從低空取氣高空取氣要比從低空取氣有利得多。有利得多。高效前置過濾除菌流程 高效前置過濾器高效前置過濾器壓縮機(jī)壓縮機(jī)貯罐貯罐冷卻器冷卻器 絲網(wǎng)分離器絲網(wǎng)分離器加熱器加熱器過濾器過濾器 2.2.空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻（1 1）空氣壓縮：克服輸送過程中過濾介質(zhì)的阻力）空氣壓縮：克服輸送過程中過濾介質(zhì)的阻力并維持一定的氣流速度。并維持一定的氣流速度。（2 2）壓縮后空氣溫度顯著上升，需冷卻。）壓縮后空氣溫度顯著上升，需冷卻。因?yàn)橐驗(yàn)閴嚎s后的高溫空氣能引起過濾介質(zhì)的炭化或燃燒壓縮后的高溫空氣能引起過濾介質(zhì)的炭化或燃燒增大發(fā)酵罐的降溫負(fù)荷增大發(fā)酵罐的降溫負(fù)荷增加培養(yǎng)液水分的蒸發(fā)增加培養(yǎng)液水分的蒸發(fā) 一般用列管式冷卻器進(jìn)行冷卻。一般用列管式冷卻器進(jìn)行冷卻?？諝赓A罐空氣貯罐消除壓縮機(jī)排出空消除壓縮機(jī)排出空氣量的脈沖，維持氣量的脈沖，維持穩(wěn)定的空氣壓力。穩(wěn)定的空氣壓力。利用重力沉降作用利用重力沉降作用除去部分油霧。除去部分油霧。緊接空壓機(jī)安裝。緊接空壓機(jī)安裝。有些裝有冷卻管有些裝有冷卻管。3.3.壓縮空氣的除油除水壓縮空氣的除油除水 冷卻降溫后的空氣濕度增大，會(huì)使過濾介冷卻降溫后的空氣濕度增大，會(huì)使過濾介質(zhì)受潮失效。質(zhì)受潮失效。兩類設(shè)備兩類設(shè)備旋風(fēng)分離器旋風(fēng)分離器利用離心力進(jìn)行沉降，對(duì)于利用離心力進(jìn)行沉降，對(duì)于1010 m m以上的微粒分離效率較高。以上的微粒分離效率較高。絲網(wǎng)分離器絲網(wǎng)分離器利用慣性進(jìn)行攔截，分離效利用慣性進(jìn)行攔截，分離效率較高，能除去率較高，能除去2 25 5 m m的細(xì)小顆粒。的細(xì)小顆粒。旋風(fēng)分離器旋風(fēng)分離器采用慣性攔截采用慣性攔截等機(jī)理，有效去除空氣等機(jī)理，有效去除空氣中的水、油霧、塵埃，中的水、油霧、塵埃，不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命長。用壽命長。4.4.空氣的加熱空氣的加熱 將除油水的空氣加熱（溫差在將除油水的空氣加熱（溫差在10101515C 左右），降低相對(duì)濕度（達(dá)左右），降低相對(duì)濕度（達(dá)50%50%60%60%）后）后，輸入過濾器。輸入過濾器。用列管換熱器。用列管換熱器。空氣過濾除菌設(shè)備流程空氣過濾除菌設(shè)備流程空壓機(jī)空壓機(jī)儲(chǔ)罐儲(chǔ)罐二級(jí)冷卻二級(jí)冷卻加熱器加熱器空氣過濾空氣過濾粗過濾粗過濾四、空氣過濾器四、空氣過濾器過濾除菌的關(guān)鍵設(shè)備過濾除菌的關(guān)鍵設(shè)備180180M M3 3發(fā)酵罐車間發(fā)酵罐車間大型空氣壓縮機(jī)大型空氣壓縮機(jī)發(fā)酵車間的空氣過濾器發(fā)酵車間的空氣過濾器空氣凈化的流程空氣凈化的流程吸氣口吸入的空氣先經(jīng)過壓縮前的過濾吸氣口吸入的空氣先經(jīng)過壓縮前的過濾進(jìn)入空氣壓縮機(jī)（進(jìn)入空氣壓縮機(jī)（120120 150150C）冷卻（冷卻（2020 2525C），），除去油、水，再加熱至除去油、水，再加熱至30 30 3535C。最后通過總過濾器和分過濾器，獲得潔凈度、最后通過總過濾器和分過濾器，獲得潔凈度、壓力、溫度和流量都符合要求的無菌空氣壓力、溫度和流量都符合要求的無菌空氣。