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1、第第三三章章核核酸酸化化學(xué)學(xué)l核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。l核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。子。核酸概述核酸概述一、核酸的研究發(fā)現(xiàn)史一、核酸的研究發(fā)現(xiàn)史l18681868年，年，F(xiàn). MiescherF. Miescher從細(xì)胞核中分離得從細(xì)胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為核酸的到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)。物質(zhì)。1944年，Avery的轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)orand可分離可分離l1952195

2、2年，年， HexsheyHexshey、Chase TChase T2 2噬菌噬菌體（搗碎器實(shí)驗(yàn)）體（搗碎器實(shí)驗(yàn)）l19531953年，年，WatsonWatson、Crick DNACrick DNA雙螺雙螺旋模型旋模型l核酶（核酶（RibozymeRibozyme） 98 98核中（染色體中）核中（染色體中） 真核真核 線粒體（線粒體（mDNAmDNA） 核外核外 葉綠體（葉綠體（ctDNActDNA）DNA DNA 擬核擬核 原核原核 核外：質(zhì)粒（核外：質(zhì)粒（plasmidplasmid） 病毒：病毒：DNADNA病毒病毒核酸的種類和分布核酸的種類和分布 核酸分為兩大類：核酸分為兩大類

3、： 脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleic Acid （DNADNA） 核糖核酸核糖核酸 Ribonucleic AcidRibonucleic Acid（RNARNA）RNARNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中主要存在于細(xì)胞質(zhì)中 l tRNAl rRNAl mRNAl 其它其它l RNA病毒：病毒：SARS三、分子生物學(xué)的中心法則核酸核酸核苷酸核苷酸核苷核苷磷酸磷酸堿基堿基戊糖戊糖元素組成：元素組成： C H O N P C H O N P 核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖（核糖或脫氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和

4、核苷酸。每個(gè)核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。 組成核酸的戊糖有兩種。組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為所含的糖為 -D-2-脫氧核糖；脫氧核糖；RNA所含的糖則為所含的糖則為-D-核糖。核糖。OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脫氧核糖NNNHNNH2l腺嘌呤腺嘌呤AdenineNHNNHNONH2l鳥嘌呤鳥嘌呤guanine尿嘧啶尿嘧啶uracilNHNHOONNHNH2O胞嘧啶胞嘧啶cytosineNHNHOO胸腺嘧啶胸腺嘧啶thymine 核

5、酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物?；姆N類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。核苷核苷 戊糖戊糖+ +堿基堿基 糖與堿基之間的糖與堿基之間的C-NC-N鍵，稱為鍵，稱為C-NC-N糖苷鍵糖苷鍵(OH)(OH)胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鳥嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2次黃苷（肌苷）次黃苷（肌苷）I黃嘌呤核苷黃嘌呤核苷 X二氫尿嘧啶核苷二氫尿嘧啶核苷 D取代核苷

6、的表示方式7-甲基鳥苷 m5GOHAdenosine Guanosine Cytidine Uridine核苷酸核苷酸 核苷核苷+ +磷酸磷酸 戊糖戊糖+ +堿基堿基+ +磷酸磷酸HHHHHHH H Hl1. 1. 繼續(xù)磷酸化繼續(xù)磷酸化O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷 (ATP)AMPADPATPl cAMPl cGMP4. 4. 輔酶輔酶 NADNAD、NADPNADP、FMNFMNIMP GMPl多聚核苷酸是通過一個(gè)核苷酸的多聚核苷酸是通過一個(gè)核苷酸的C C3 3-OH -OH 與另一分子核苷與另一分子核苷酸的酸的5-5-磷酸基形成磷酸

7、基形成3,5-3,5-磷酸二酯鍵相連而成的鏈磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。狀聚合物。5533l 5-5-磷酸端（常用磷酸端（常用5-P5-P表示）；表示）；3-3-羥基端（常用羥基端（常用3-OH3-OH表表示）示）l 多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個(gè)多聚核苷酸鏈時(shí)，必須多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個(gè)多聚核苷酸鏈時(shí)，必須注明它的方向是注明它的方向是5353或是或是3535。DNA RNA5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGUT53OH U53OH OH OH OH OH 一級結(jié)構(gòu)一

8、級結(jié)構(gòu) DNADNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于生物界物種的多樣性即寓于DNADNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中?；牟煌帕薪M合之中。 2. 基因與基因組基因與基因組基因（基因（genegene）：一段有功能的：一段有功能的DNADNA片段，生物細(xì)胞中片段，生物細(xì)胞中DNADNA分子的最小功能單位（交換單位）。分子的最小功能單位（交換單位）。 蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)（mRNA mRNA 蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)）產(chǎn)物產(chǎn)物 tRNA tRNA RNA RNA rRNA rRNA 調(diào)節(jié)功能：調(diào)節(jié)基因

9、調(diào)節(jié)功能：調(diào)節(jié)基因無產(chǎn)物無產(chǎn)物 作用未知作用未知結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因基因組（基因組（genomegenome）：某生物體（完整單倍體）所含全部遺：某生物體（完整單倍體）所含全部遺傳物質(zhì)的總和。傳物質(zhì)的總和。包括：核基因組（擬核包括：核基因組（擬核/ /核核DNADNA）及核外（質(zhì)粒）及核外（質(zhì)粒/ /質(zhì)體質(zhì)體DNADNA） bp bp（堿基對（堿基對） 103 104 105 106 107 108 109 1010 1011 1012人人兩棲兩棲類類魚類魚類藻類藻類酵母酵母細(xì)菌細(xì)菌E.ColE.Coli i病毒病毒質(zhì)粒質(zhì)粒各種細(xì)胞、病毒和細(xì)菌質(zhì)粒中基因組的大小各種細(xì)胞、病毒和細(xì)菌質(zhì)粒中基因組的大

10、小3. 原核生物基因組特點(diǎn)原核生物基因組特點(diǎn)l 重復(fù)序列少，多位編碼區(qū)重復(fù)序列少，多位編碼區(qū)l 多為操縱子形式組織多為操縱子形式組織l 有重疊基因存在有重疊基因存在4. 真核生物基因組特點(diǎn)真核生物基因組特點(diǎn)l 以染色體存在以染色體存在l 重復(fù)序列多重復(fù)序列多 基因組計(jì)劃基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃（人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project， HGP ）酵母基因組計(jì)劃酵母基因組計(jì)劃 （YGP）大腸桿菌（大腸桿菌（E.Coli）二、二、DNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu) DNA的雙螺旋模型的雙螺旋模型l19531953年，年，J. WatsonJ. Watson和和F. F. Crick Cr

11、ick 在前人研究工作在前人研究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNADNA結(jié)晶結(jié)晶的的X-X-衍射圖譜和分子模衍射圖譜和分子模型，提出了著名的型，提出了著名的DNADNA雙雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對模螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對模型的生物學(xué)意義作出了型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測?？茖W(xué)的解釋和預(yù)測。l在在DNADNA分子中，嘌呤堿基分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。數(shù)相等。DNA雙螺旋模型要點(diǎn)雙螺旋模型要點(diǎn)B型結(jié)構(gòu)型結(jié)構(gòu) 兩條鏈反向平行，右手螺旋兩條鏈反向平行，右手螺旋 堿基在內(nèi)（堿基在內(nèi)（AT，GC）堿）堿基平面垂直于螺旋軸基平面垂直于螺旋軸 戊糖在外，雙螺旋每轉(zhuǎn)一周戊

12、糖在外，雙螺旋每轉(zhuǎn)一周 為為10堿基對（堿基對（bp）A型結(jié)構(gòu)型結(jié)構(gòu) 堿基平面傾斜堿基平面傾斜20，螺旋變粗，螺旋變粗變短，螺距變短，螺距23nm。Z型結(jié)構(gòu)型結(jié)構(gòu) 左手螺旋，只有小溝左手螺旋，只有小溝2.0 nm小小溝溝大大溝溝雙螺旋雙螺旋DNADNA的結(jié)構(gòu)參數(shù)的結(jié)構(gòu)參數(shù)類型旋轉(zhuǎn)方向螺旋直徑（nm）螺距（nm）每轉(zhuǎn)堿基對數(shù)目堿基對間垂直距離（nm）堿基對與水平面傾角ADNABDNAZDNA右右左2.02.31.82.83.44.51110120.2550.340.272007雙螺旋穩(wěn)定的力雙螺旋穩(wěn)定的力 氫鍵氫鍵 堿基堆積力（疏水相互作用及范德華力）堿基堆積力（疏水相互作用及范德華力） 離子鍵

13、等離子鍵等 則則DNA變性劑（熱、變性劑（熱、pH、脲、脲/酰胺、有機(jī)溶劑）酰胺、有機(jī)溶劑）lDNA雙螺旋的進(jìn)一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)，負(fù)超螺旋 原核 雙鏈環(huán)狀DNA（dcDNA） 病毒 單鏈環(huán)狀DNA（scDNA） 單鏈線性DNA（ssDNA） 真核真核 雙鏈線性雙鏈線性DNA（dsDNA）第四節(jié)第四節(jié) RNARNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能一、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1. 堿基組成堿基組成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有堿稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解基較多，穩(wěn)定性較差，易水解2. 多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋3. 分子較小分子較小4. 分類分類l mRNA（

14、hnRNA 核不均一核不均一RNA）l tRNA l rRNA （snRNA/asRNA）l 少數(shù)少數(shù)RNA病毒病毒二、二、tRNA占占RNA總量的總量的15一種氨基酸對應(yīng)最少一種一種氨基酸對應(yīng)最少一種RNAl分子量分子量25000左右，大約由左右，大約由7090個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)為為4S左右。左右。l分子中含有較多的修飾成分。分子中含有較多的修飾成分。l3-末端都具有末端都具有CpCpAOH的結(jié)的結(jié)構(gòu)。構(gòu)。tRNA的三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu)占占RNARNA總量的總量的8080原核生物真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA 30s70s 50s16s5s 、23s 40s80

15、s 50s 18s5s、5.8s、28s四、四、mRNA和和hnRNA占細(xì)胞總占細(xì)胞總RNA的的35l真核細(xì)胞真核細(xì)胞mRNAmRNA的的3-3-末端有一段長達(dá)末端有一段長達(dá)200200個(gè)核苷酸左右個(gè)核苷酸左右的聚腺苷酸的聚腺苷酸(polyA)(polyA)，稱為，稱為 “ “尾結(jié)構(gòu)尾結(jié)構(gòu)” ” ，5 -5 -末端末端有一個(gè)甲基化的鳥苷酸，稱為有一個(gè)甲基化的鳥苷酸，稱為” ” 帽結(jié)構(gòu)帽結(jié)構(gòu)“ “ 。五、五、snRNA （small nucleic RNA 核小核小RNA） scRNA （small cytoplasmic RNA） asRNA （antisense RNA）第五節(jié)第五節(jié) 核酸的

16、性質(zhì)核酸的性質(zhì)一、一般的理化性質(zhì)一、一般的理化性質(zhì)l 兩性解離兩性解離 / 一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷），微一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷），微 溶于水，不溶于有機(jī)溶劑溶于水，不溶于有機(jī)溶劑l線性大分子（粘度高。抗剪切力差）線性大分子（粘度高?？辜羟辛Σ睿﹍可用電泳或離子交換（色譜）進(jìn)行分離可用電泳或離子交換（色譜）進(jìn)行分離l室溫條件下，室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，在堿中變性，但不水解，RNA水解水解l加熱條件下，加熱條件下，D核糖濃鹽酸苔黑酚核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色綠色 D2脫氧核糖酸二苯胺脫氧核糖酸二苯胺 藍(lán)紫色藍(lán)紫色二、核酸的紫外吸收特性二、核酸的紫外吸收特性l在核酸分

17、子中，由于嘌呤堿在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，一般在光譜，一般在260nm260nm左右有左右有最大吸收峰，可以作為核酸最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的及其組份定性和定量測定的依據(jù)。依據(jù)。l以以A A260260/A/A280280進(jìn)行定性、定量進(jìn)行定性、定量lDNADNA和和RNARNA溶液中加入溴化乙溶液中加入溴化乙錠（錠（EBEB），在紫外下發(fā)出熒），在紫外下發(fā)出熒光光1. 1. 變性變性l穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破

18、壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)( (堿基順序堿基順序) )保持不變。保持不變。l變性表征變性表征 生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）收增加（增色效應(yīng)）l變性因素變性因素 pHpH（11.311.3或或5.05.0） 變性劑（脲、甲酰胺、甲醛）變性劑（脲、甲酰胺、甲醛） 低離子強(qiáng)度低離子強(qiáng)度 加熱加熱lDNADNA的變性過程的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時(shí)的溫度稱熔解此，通常將紫外吸

19、收的增加量達(dá)最大量一半時(shí)的溫度稱熔解溫度，用溫度，用T Tm m表示。表示。l一般一般DNADNA的的T Tm m值在值在70-8570-85 C C之間。之間。DNADNA的的T Tm m值與分子中的值與分子中的G G和和C C的的含量有關(guān)。含量有關(guān)。lG G和和C C的含量高，的含量高，T Tm m值高。因而測定值高。因而測定TmTm值，可反映值，可反映DNADNA分子中分子中G, G, C C含量，可通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（含量，可通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44G+C)%=(Tm-69.3)X2.442. 熱變性和熱變性和Tm3. 核酸的復(fù)性核酸的復(fù)性l變性核酸

20、的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性復(fù)性。lDNADNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。l將熱變性的將熱變性的DNADNA驟然冷卻至低溫時(shí)，驟然冷卻至低溫時(shí)，DNADNA不可能復(fù)性。不可能復(fù)性。變性的變性的DNADNA緩慢冷卻時(shí)可復(fù)性，因此又稱為緩慢冷卻時(shí)可復(fù)性，因此又稱為“退火退火”。 退火溫度退火溫度T Tm m2525l復(fù)性影響因素復(fù)性影響因素 片段濃度片段濃度/ /片段大小

21、片段大小/ /片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/ / 溶液離子強(qiáng)度溶液離子強(qiáng)度 4.4.分子雜交分子雜交lDNADNA單鏈與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源單鏈與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNADNA單鏈單鏈或或RNARNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為分子稱為雜交雜交DNADNA分子分子。l核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。重要意義。lSouthern Southern 雜交（雜交（Southern boltingSouthern bolting）lNorthern N

22、orthern 雜交（雜交（Northern boltingNorthern bolting）lWestern Western 雜交雜交 （Western boltingWestern bolting）四、核酸的序列測定四、核酸的序列測定1. 雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法（Sanger酶法）酶法）2. Gilbert化學(xué)降解法化學(xué)降解法l核酸是遺傳物質(zhì)載體的證明和研究歷史核酸是遺傳物質(zhì)載體的證明和研究歷史l核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)：戊糖、堿基（核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)：戊糖、堿基（A A、T T、G G、C C、U U），），核苷、核苷酸及其衍生物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（原子編號）核苷、核苷酸及其衍生物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（原子編號）lDNADNA的結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)（核酸序列及其表示、基因的結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)（核酸序列及其表示、基因及基因組、序列測定）、二級結(jié)構(gòu)（及基因組、序列測定）、二級結(jié)構(gòu)（ WatsonWatson CrickCrick雙螺旋模型、雙螺旋模型、Z ZDNADNA）、結(jié)構(gòu)維持的化學(xué)鍵）、結(jié)構(gòu)維持的化學(xué)鍵lRNARNA結(jié)構(gòu)與功能：堿基組成特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)與功能：堿基組成特點(diǎn)、RNARNA的種類結(jié)構(gòu)及的種類結(jié)構(gòu)及功能功能l核酸的性質(zhì)：酸堿性、變性與復(fù)性、分子雜交核酸的性質(zhì)：酸堿性、變性與復(fù)性、分子雜交