《第四章 核酸化學(xué)》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《第四章 核酸化學(xué)（181頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、第四章第四章 核酸化學(xué)核酸化學(xué) 主要內(nèi)容：主要內(nèi)容： 主要介紹堿基、核苷、核苷酸和核酸的結(jié)構(gòu)、主要介紹堿基、核苷、核苷酸和核酸的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，核酸的分離、提純、鑒定等。性質(zhì)和功能，核酸的分離、提純、鑒定等。核蛋白核蛋白 磷酸磷酸 核苷核苷 堿基堿基 戊糖戊糖 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 核酸是由幾十個(gè)甚至幾千萬個(gè)核酸是由幾十個(gè)甚至幾千萬個(gè)核苷酸核苷酸聚聚合而成的合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)具有一定空間結(jié)構(gòu)的大分子化合物。的大分子化合物。 核酸核酸核苷酸核苷酸 一、核酸的概念和重要性一、核酸的概念和重要性 （一）核酸的概念（一）核酸的概念 核酸英文名核酸英文名nucleic acid（NA） 1868年瑞士年

2、瑞士F. Miescher（米歇爾）發(fā)現(xiàn)了核酸。（米歇爾）發(fā)現(xiàn)了核酸。（二）核酸的重要性（二）核酸的重要性 二、核酸的類別、分布和組成二、核酸的類別、分布和組成 （一）類別（一）類別 nucleic acid ribonucleic acid, RNA deoxyribonucleic acid, DNA （二）分布（二）分布 （三）組成（三）組成 1堿基（堿基（base）：又稱含氮堿）：又稱含氮堿 （1）嘧啶堿（）嘧啶堿（pyrimidine, Py） （2）嘌呤堿（）嘌呤堿（purine, Pu） 其它嘌呤（核酸的代謝產(chǎn)物）：其它嘌呤（核酸的代謝產(chǎn)物）：黃嘌呤、次黃嘌呤、尿酸等黃嘌呤、次黃

3、嘌呤、尿酸等 （3）修飾堿基（）修飾堿基（modified base）：）： 也稱稀有堿基（也稱稀有堿基（minor base） （4 4）堿基的性質(zhì)）堿基的性質(zhì) 一般的物理性質(zhì)一般的物理性質(zhì) 互變異構(gòu)現(xiàn)象互變異構(gòu)現(xiàn)象 CNNOOHHCNNOHHOuracil酮式 uracil烯醇式 堿基的紫外吸收堿基的紫外吸收 最大吸收峰在最大吸收峰在260nm附近附近 堿基的解離堿基的解離 2 2戊糖（戊糖（pentosepentose） （1 1）結(jié)構(gòu)）結(jié)構(gòu) OHOH2CHOHHOHOHHHOHOH2CHOHHHOHHHOHOH2CHOHHOCH3OHHH-D-核糖核糖-D-2-脫氧核糖脫氧核糖-D-2

4、-O-甲基核糖甲基核糖（2 2）性質(zhì)）性質(zhì) 氧化反應(yīng)氧化反應(yīng) OCHbaseHOHOHOH2PIO4-OCHbaseHOH2PCHOOHCCH3NH2H+OCNCHCHCH3baseHOH2CHHO+ H3PO4加成化合物H 堿水解堿水解 OHRNA-水解OHOH2CHHHbaseHOOPOHO2-核苷酸3-核苷酸 混合物 顏色反應(yīng)顏色反應(yīng) CH3OHHOD-核糖濃HCl 綠色（苔黑酚法）FeCl3D-2-脫氧核糖 藍(lán)色（二苯胺法）HNH+3磷酸（磷酸（phosphoric acid） H3PO4pKa1=2H+H2PO4-pKa2=7H+2-HPO4pKa3=12H+3-PO4三、核苷、核苷

5、酸三、核苷、核苷酸 （一）核苷（一）核苷（nucleosidenucleoside） 1 1核苷的結(jié)構(gòu)核苷的結(jié)構(gòu) 核苷：含核苷：含N N苷，苷，-苷苷 OHOH2CHHHbaseHOHOH核苷中戊糖與堿基的連接方式：核苷中戊糖與堿基的連接方式： OHOH2CHHHHOHOHNNNNNH291 腺嘌呤核苷（adenosine）胞嘧啶脫氧核苷（deoxycytidne）OHOH2CHHHHOHHN1NONH21OCH2HHOHHOHHNNONH2HOsyn-CytidineOCH2HHOHHOHHNNNH2HOanti-CytidineOOCH2HHOHHOHHHOsyn-AdenosineNNN

6、NNH2OCH2HHOHHOHHHOanti-AdenosineNNNNNH2核苷核苷 核糖核苷（核苷）：核糖核苷（核苷）：A、G、C、U 脫氧核糖核苷（脫氧核苷）：脫氧核糖核苷（脫氧核苷）：dA、dG、dC、dT 命名，簡(jiǎn)寫符號(hào)命名，簡(jiǎn)寫符號(hào) 天然核苷：一般為反式構(gòu)象天然核苷：一般為反式構(gòu)象 2修飾核苷（修飾核苷（modified nucleoside）： 也稱稀有核苷（也稱稀有核苷（minor nucleoside） 修飾核苷包括三種情況修飾核苷包括三種情況: （1）由）由修飾堿基修飾堿基和糖組成的核苷和糖組成的核苷 （2）由非修飾堿基和）由非修飾堿基和2-O-甲基核糖甲基核糖組成的核苷組

7、成的核苷 （3）由堿基與糖）由堿基與糖連接方式特殊連接方式特殊的核苷的核苷 NNNNNHCH3dRN6-Methyl-dA（1）HNNHO5,6-dihydrouridineORHHH(D or hU)（2）OCH2HHOHHOCH3HHO2-O-甲基腺苷Ade(Am)NNCH3NH25-Methyl-dCOdR（3）OCH2HHOHHOHHHO (pseudouridine)HNNHOO51假尿嘧啶核苷()NNNNORW(Y)核苷NRH3CCH3(Wyosine)HNNNCORQ 核苷(Queuosine)RH2N 還有一些核苷，它們的堿基不是嘌呤環(huán)，但可還有一些核苷，它們的堿基不是嘌呤環(huán)，

8、但可把它們看作是鳥苷的衍生物，如把它們看作是鳥苷的衍生物，如Y核苷、核苷、Q核苷。核苷。 修飾核苷的簡(jiǎn)寫符號(hào)修飾核苷的簡(jiǎn)寫符號(hào) 少數(shù)修飾核苷用單字符號(hào)如少數(shù)修飾核苷用單字符號(hào)如D、I；但大多數(shù)修飾；但大多數(shù)修飾核苷是將堿基取代基、取代位置和取代數(shù)目寫在核苷單字核苷是將堿基取代基、取代位置和取代數(shù)目寫在核苷單字符號(hào)的左邊，用小寫英文字母代表取代基。符號(hào)的左邊，用小寫英文字母代表取代基。 m N22取代位置核苷取代基的數(shù)目取代基取代基用下列小寫英文字母表示取代基用下列小寫英文字母表示 :甲基甲基m 乙?；阴；鵤c 氨基氨基n 甲硫基甲硫基ms 羥基羥基o或或h 硫基硫基s 異戊烯基異戊烯基i 羧

9、基羧基c 例：例：HNNORSHNNOROCH2OHs4 Uom5 U或hm5 U注意：注意：例例: 2-O-甲基腺苷甲基腺苷 Am 含修飾核糖的核苷即含修飾核糖的核苷即2-O-甲基核苷的表示方法，甲基核苷的表示方法，在核苷符號(hào)的右下方注上一個(gè)小寫在核苷符號(hào)的右下方注上一個(gè)小寫m。3核苷的性質(zhì)核苷的性質(zhì) （1）物理性質(zhì)）物理性質(zhì) （2）互變異構(gòu)現(xiàn)象）互變異構(gòu)現(xiàn)象 （3）紫外吸收：）紫外吸收：OD260 （4）兩性解離）兩性解離 AdeACytCGuaGpKa 4.13.634.44.13.31.6（二）核苷酸（二）核苷酸（nucleotide, Nt） 1核苷酸的結(jié)構(gòu)核苷酸的結(jié)構(gòu) （1）（核糖

10、）核苷酸（）（核糖）核苷酸（ribonucleotide）：）： 2，3，5一核糖核苷酸一核糖核苷酸(2 -AMP)(3 -AMP)(5 -AMP)3，5一脫氧核糖核苷酸一脫氧核糖核苷酸Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP)Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP)（2）脫氧（核糖）核苷酸（）脫氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）：）：2 2核苷酸的性質(zhì)核苷酸的性質(zhì) （1）一般物理性質(zhì)）一般物理性質(zhì) （2）互變異構(gòu)現(xiàn)象）互變異構(gòu)現(xiàn)象 （3）紫外吸收）紫外吸收 4 4種單核苷酸吸收光譜的標(biāo)準(zhǔn)比值

11、種單核苷酸吸收光譜的標(biāo)準(zhǔn)比值 250/260 280/260 290/2602.07.02.07.02.07.05-CMP0.460.842.100.991.550.305-AMP0.850.800.220.150.030.0035-UMP0.740.730.380.400.030.035-GMP1.221.150.680.680.400.28光密度光密度 比值比值pH核苷酸核苷酸 A260：樣品在：樣品在260nm處的吸收值處的吸收值 E260：所測(cè)核苷酸的摩爾消光系數(shù)：所測(cè)核苷酸的摩爾消光系數(shù) C： 核苷酸樣品的濃度（核苷酸樣品的濃度（mg/ml） 核苷酸核苷酸(mg) = Mr N VA

12、260E260核核苷苷酸酸A260E260MrC100胞嘧啶核苷酸的解離胞嘧啶核苷酸的解離 OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHOCMPpKa2=4.5-OCH2HHOHHOHHONNONH2POOOCMPpKa3=6.4-pI =CMPpKa1+pKa22=0.8+4.52= 2.65OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHOCMPpKa1=0.80H+-OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHHOCMP+H+（4）核苷酸的兩性解離和等電點(diǎn)）核苷酸的兩性解離和等電點(diǎn) 4種核苷酸的解離曲線種核苷酸的解離曲線 可在可在pH2.05.0之間分離各種核苷酸之間分離各種核苷酸 p

13、H3.5時(shí)各核苷酸所帶電荷時(shí)各核苷酸所帶電荷 核苷酸核苷酸 磷酸基電荷磷酸基電荷 堿基的電荷堿基的電荷 凈電荷凈電荷 AMP-1+0.54-0.46GMP-1+0.05-0.95CMP-1+0.84-0.16UMP-1+0-1（三）核苷酸的重要衍生物（三）核苷酸的重要衍生物 1ATP類的高能磷酸化合物類的高能磷酸化合物 AMPADPATP2環(huán)狀核苷酸環(huán)狀核苷酸 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi) :ATP cAMP + PPi 磷酸二酯酶磷酸二酯酶 5 -AMP 腺苷酸環(huán)化酶腺苷酸環(huán)化酶 （AC） 3核苷多磷酸類核苷多磷酸類 四、四、DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) （一）（一）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 1DNA分子中核苷酸的

14、連接方式分子中核苷酸的連接方式 RNA簡(jiǎn)寫方法：線條式、文字式簡(jiǎn)寫方法：線條式、文字式 2DNA分子中核苷酸的排列順序分子中核苷酸的排列順序 英國(guó)英國(guó)Sanger 1975年加減法，年加減法，1977年末端終止法年末端終止法 美國(guó)美國(guó)Maxam和和Gilbert 1977年化學(xué)斷裂法年化學(xué)斷裂法 （1）酶法（雙脫氧法、末端終止法）酶法（雙脫氧法、末端終止法） （2）化學(xué)法（化學(xué)斷裂法）化學(xué)法（化學(xué)斷裂法） 利用多核苷酸激酶將利用多核苷酸激酶將3232P P標(biāo)記在標(biāo)記在DNADNA的的55末端，末端，用特異的化學(xué)試劑修飾用特異的化學(xué)試劑修飾DNADNA分子中的不同堿基，然分子中的不同堿基，然后用

15、特異的試劑在特異的地方斷裂，產(chǎn)生長(zhǎng)短不后用特異的試劑在特異的地方斷裂，產(chǎn)生長(zhǎng)短不同的同的DNADNA片段，再進(jìn)行電泳，放射自顯影，即可讀片段，再進(jìn)行電泳，放射自顯影，即可讀出出DNADNA序列。序列。（二）（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 1提出提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù) （1）x-光衍射分析光衍射分析 20世紀(jì)世紀(jì)40年代年代Astbury 1952年年M.Wilkins （2）DNA堿基組成的定量分析堿基組成的定量分析 20世紀(jì)世紀(jì)40年代年代chargaff規(guī)則規(guī)則 DNA堿基組成有種的特異性，但沒有組織、器官特異性。堿基組成有種的特異性，但沒有組織、器官特異性。

16、 A=T；G=C；A+G=T+C 2DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（double-helical structure） 1953年年Watson和和Crick提出了提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋結(jié)構(gòu)。 （3）堿基、糖、磷酸的位置。）堿基、糖、磷酸的位置。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：雙螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn)： （1）兩條反向平行的多核苷）兩條反向平行的多核苷 酸鏈，右手雙螺旋。酸鏈，右手雙螺旋。 （4）雙螺旋的直徑，螺距。）雙螺旋的直徑，螺距。 （2 2）大溝（深溝）大溝（深溝） 小溝（淺溝）小溝（淺溝） （5）堿基配對(duì)）堿基配對(duì) （6）堿基的序列）堿基的序列 穩(wěn)定穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵雙螺旋結(jié)構(gòu)

17、的化學(xué)鍵 （1）互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵）互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵 （2）堿基堆積力（）堿基堆積力（base-stacking forces） （3）磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子之間形成的離子鍵）磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子之間形成的離子鍵 3DNA雙螺旋的種類雙螺旋的種類 Watson Crick DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（雙螺旋結(jié)構(gòu)（B型型DNA） 當(dāng)當(dāng)DNA鈉鹽纖維鈉鹽纖維相對(duì)濕度相對(duì)濕度和和鹽的種類鹽的種類改變時(shí)，改變時(shí)，DNA的構(gòu)象發(fā)生改變。的構(gòu)象發(fā)生改變。 不同不同DNA纖維的空間結(jié)構(gòu)纖維的空間結(jié)構(gòu) 類型類型結(jié)晶狀態(tài)結(jié)晶狀態(tài)ANa鹽，相對(duì)濕度鹽，相對(duì)濕度75%時(shí)結(jié)晶時(shí)結(jié)晶BNa鹽，相對(duì)濕度

18、鹽，相對(duì)濕度92%時(shí)結(jié)晶時(shí)結(jié)晶C鋰鹽，相對(duì)濕度鋰鹽，相對(duì)濕度66%時(shí)結(jié)晶時(shí)結(jié)晶A-DNA： 與與B-DNA相同處：相同處：與與B-DNA不同點(diǎn)不同點(diǎn) :（1）螺體寬而短，直徑）螺體寬而短，直徑2.55nm；11個(gè)核苷酸一圈，螺距個(gè)核苷酸一圈，螺距2.46nm。 （2）堿基的傾角大一些：傾角）堿基的傾角大一些：傾角19。 A-DNA：RNA分子中的雙螺旋區(qū)；分子中的雙螺旋區(qū)；DNA-RNA雜交分子。雜交分子。 A-DNA和和B-DNA之間可以相互轉(zhuǎn)換，推測(cè)在轉(zhuǎn)錄時(shí)，之間可以相互轉(zhuǎn)換，推測(cè)在轉(zhuǎn)錄時(shí)，DNA分子發(fā)生分子發(fā)生BA的轉(zhuǎn)變。的轉(zhuǎn)變。 反向的兩條多核苷酸鏈，右手螺旋。反向的兩條多核苷酸鏈，右

19、手螺旋。C型型DNA的一些數(shù)據(jù)與的一些數(shù)據(jù)與B型型DNA很相似。很相似。 C-DNA：4DNA雙螺旋的研究進(jìn)展雙螺旋的研究進(jìn)展 （1）Z-DNA 1979年美國(guó)年美國(guó)ARich等人發(fā)現(xiàn)了左旋等人發(fā)現(xiàn)了左旋DNA（左手（左手DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)）雙螺旋結(jié)構(gòu)）晶體晶體X-光衍射分析光衍射分析 d(Cp Gp Cp Gp Cp -Gp)Z-DNA的特點(diǎn)的特點(diǎn) Z-DNA的生物功能：的生物功能：與基因表達(dá)、基因調(diào)控有關(guān)。與基因表達(dá)、基因調(diào)控有關(guān)。 （2）三螺旋）三螺旋DNA （3）四螺旋）四螺旋DNA DNA 雙鏈線狀雙鏈線狀 雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀 單鏈線狀：動(dòng)物病毒單鏈線狀：動(dòng)物病毒MVM 單鏈環(huán)狀：噬菌體

20、單鏈環(huán)狀：噬菌體X174 真核細(xì)胞染色體真核細(xì)胞染色體DNA 噬菌體噬菌體T2，T5，T7，P22 E-Coli染色體染色體DNA 線粒體線粒體DNA 葉綠體葉綠體DNA 多瘤病毒多瘤病毒DNA，病毒，病毒SV40DNA 噬菌體噬菌體和和X174的復(fù)制型的復(fù)制型 （三）（三）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 噬菌體噬菌體T2DNA長(zhǎng)約長(zhǎng)約50m E-coli DNA 長(zhǎng)約長(zhǎng)約1mm 人生殖細(xì)胞人生殖細(xì)胞DNA長(zhǎng)約長(zhǎng)約1m 雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA（double stranded cyclic DNA, DSCDNA） : 雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA在自然界是廣泛存在的，如一些病毒在自然界是廣泛存在的，如一

21、些病毒DNA、一些噬菌體、一些噬菌體DNA、細(xì)菌質(zhì)粒、細(xì)菌質(zhì)粒DNA、線粒體和葉、線粒體和葉綠體綠體DNA等。等。 1共價(jià)閉合環(huán)狀共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）的）的超螺旋超螺旋結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)（superhelical structure） 形成超螺旋的基礎(chǔ)形成超螺旋的基礎(chǔ): DNA雙螺旋的扭曲形成超螺旋雙螺旋的扭曲形成超螺旋 （superhelix）負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋 正超螺旋正超螺旋超螺旋超螺旋DNA的性質(zhì)的性質(zhì) 結(jié)構(gòu)緊密，粘度較低，浮力密度大，沉降速度快。結(jié)構(gòu)緊密，粘度較低，浮力密度大，沉降速度快。變變性性2開環(huán)開環(huán)DNA（o

22、pen circular DNA, ocDNA）也稱松環(huán)也稱松環(huán)DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）+3連環(huán)連環(huán)DNA（Catenanes DNA） 單體單體二聚體二聚體（四）真核細(xì)胞染色體（四）真核細(xì)胞染色體DNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 1重復(fù)序列重復(fù)序列 （repeated sequence ） （1）高度重復(fù)序列（）高度重復(fù)序列（highly repeated sequence） 衛(wèi)星衛(wèi)星DNA（satellite DNA） 基因組（基因組（genome）主體主體DNA（bulk DNA） 衛(wèi)星衛(wèi)星DNA（satellite DNA） （2）中度重復(fù)序列（）中度重復(fù)序列（m

23、oderately repeated sequence） （3）單一序列（）單一序列（unique sequence） 2 2回文結(jié)構(gòu)（回文結(jié)構(gòu)（palindromic structurepalindromic structure） (1) (1) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu) 回文結(jié)構(gòu)也稱反向重復(fù)（回文結(jié)構(gòu)也稱反向重復(fù)（inverted repeats）(2) (2) 發(fā)夾形和十字形發(fā)夾形和十字形五、五、RNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) （一）（一）RNA的類別的類別 1核糖體核糖體RNA（ribosomal RNA, rRNA） 2轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移RNA（transfer RNA, tRNA） 3信使信使RNA（messe

24、nger RNA, mRNA） 4其它類別的其它類別的RNA （1）病毒）病毒RNA（Viral RNA, rRNA） （2）核內(nèi)）核內(nèi)RNA（nuclear RNA, nRNA） 不均一核不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,HnRNA） 小分子核小分子核RNA（small nuclear RNA, sn RNA） 小分子核仁小分子核仁RNA（small nucleolar RNA, sno RNA） 染色體染色體RNA（chromosomal RNA, ch RNA） （3）線粒體）線粒體RNA（mitochondrial RNA, mit RNA） （4）葉

25、綠體）葉綠體RNA（chloroplast RNA, chlRNA或或ctRNA） （二）（二）RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 1RNA分子中核苷酸之間的連接方式分子中核苷酸之間的連接方式3 ,5 -磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 2RNA分子中核苷酸的排列順序分子中核苷酸的排列順序 酵母酵母tRNAAla小片段重疊法小片段重疊法 直接閱讀法（直讀法）直接閱讀法（直讀法） 19651965年年3幾類幾類RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) （1） tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) tRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的共同點(diǎn)一級(jí)結(jié)構(gòu)的共同點(diǎn): Mr較?。ㄝ^?。∕r25000），沉降常數(shù)），沉降常數(shù)4S。 各種各種tRNA的鏈長(zhǎng)很接近，一般在

26、的鏈長(zhǎng)很接近，一般在7393個(gè)核苷酸之間。個(gè)核苷酸之間。 tRNA分子中約分子中約20多個(gè)位置上的核苷酸是保守的（不變和半不變的）多個(gè)位置上的核苷酸是保守的（不變和半不變的） 各種各種tRNA的的3一端為一端為CCA；5一端大多數(shù)為一端大多數(shù)為pG，少數(shù)為，少數(shù)為pC。 tRNA分子中含有較多的修飾成分。分子中含有較多的修飾成分。 （2）rRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 原核生物核糖體原核生物核糖體 70S50S30S5S rRNA， 23S rRNA34種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì)16S rRNA21種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì)真核生物核糖體真核生物核糖體 80S60S40S5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRN

27、A49種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì)18SrRNA33種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì)（3）mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 真核生物真核生物mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)可用下式表示的一級(jí)結(jié)構(gòu)可用下式表示 :5 -帽子帽子 5 -非密碼區(qū)非密碼區(qū) 密碼區(qū)密碼區(qū)3 -非密碼區(qū)非密碼區(qū) polyA 5 -cap：m7G(5 )pppNmp 5 -cap cap0: m7G(5 )pppNp cap1: m7G(5 )pppNmpNp cap2: m7G(5 )pppNmpNmpNp 5 -cap的功能的功能 (1) (1) 防止防止mRNAmRNA被核酸酶降解。被核酸酶降解。(2) (2) 為為mRNAmRNA翻譯活性所必需。翻譯活性所必需

28、。(3) (3) 與蛋白質(zhì)合成的正確起始有關(guān)。與蛋白質(zhì)合成的正確起始有關(guān)。3 -polyA : polyA的殘基數(shù)的殘基數(shù)20200個(gè)，或更多。個(gè)，或更多。polyA的功能的功能 (1) (1) 保護(hù)保護(hù)mRNAmRNA，免受核酸外切酶的作用。，免受核酸外切酶的作用。(2) (2) 與翻譯有關(guān)，沒有與翻譯有關(guān)，沒有polyApolyA翻譯活性降低。翻譯活性降低。(3) (3) 與與mRNAmRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。RNA前體前體 成熟成熟RNA（有功能的（有功能的RNA） 斷裂、修剪、修飾斷裂、修剪、修飾 （三）（三）RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 大多數(shù)天然大多

29、數(shù)天然RNA是一條單鏈，通過自身回折形成部分螺旋區(qū)，是一條單鏈，通過自身回折形成部分螺旋區(qū)，部分非螺旋區(qū)。部分非螺旋區(qū)。 少數(shù)病毒少數(shù)病毒RNA如水稻矮縮病毒、呼腸孤病毒、傷瘤病毒等如水稻矮縮病毒、呼腸孤病毒、傷瘤病毒等RNA是雙鏈螺旋，類似于是雙鏈螺旋，類似于DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 RNA中雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素主要是堿基堆中雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素主要是堿基堆積力，其次是氫鍵。積力，其次是氫鍵。 1tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu) （1）aa接受臂（接受臂（amino acid arm） （2）二氫尿嘧啶環(huán)）二氫尿嘧啶環(huán) （dihydrouridine loop, DHU loop） （

30、3）反密碼環(huán)（）反密碼環(huán)（anticodon loop） （4）額外環(huán)（）額外環(huán)（extra loop） （5）TC環(huán)（環(huán)（TC loop） 1980年牛心線粒體年牛心線粒體tRNAser只有只有63個(gè)核苷酸，個(gè)核苷酸，沉降常數(shù)沉降常數(shù)3S，缺少，缺少D環(huán)和環(huán)和D臂，呈二葉草型。臂，呈二葉草型。 近年來發(fā)現(xiàn)近年來發(fā)現(xiàn)2種線蟲線粒體種線蟲線粒體tRNA也不是標(biāo)也不是標(biāo)準(zhǔn)的三葉草結(jié)構(gòu)。準(zhǔn)的三葉草結(jié)構(gòu)。 2rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 3mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu) （四）（四）RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu) tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 六、核酸酶類六、核酸酶類包括核酸水解酶、合成酶、連接酶等。包括核

31、酸水解酶、合成酶、連接酶等。 （一）核酸水解酶的分類（一）核酸水解酶的分類 1底物：核糖核酸酶（底物：核糖核酸酶（ribonuclease, RNase） 脫氧核糖核酸酶（脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase） 2作用方式：核酸內(nèi)切酶（作用方式：核酸內(nèi)切酶（endonuclease）3按磷酸二酯鍵斷裂的方式按磷酸二酯鍵斷裂的方式 4其它：如雙鏈酶、單鏈酶等其它：如雙鏈酶、單鏈酶等 核酸外切酶（核酸外切酶（exonuclease）（二）核糖核酸酶類（二）核糖核酸酶類 1牛胰核糖核酸酶（牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease, 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱RNase

32、 A或或RNase I） 2核糖核酸酶核糖核酸酶T1（ribonuclease T1，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱RNase T1） 3核糖核酸酶核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱RNase T2） 主要作用點(diǎn)為主要作用點(diǎn)為Ap殘基，水解速度殘基，水解速度AUGC PPPPPPPAUCGAG（三）脫氧核糖核酸酶（三）脫氧核糖核酸酶 1牛胰脫氧核糖核酸酶牛胰脫氧核糖核酸酶 （pancreatic deoxyribonuclease簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱DNase I） PPPPPPPP2牛脾脫氧核糖核酸酶牛脾脫氧核糖核酸酶 （spleen deoxyribonuclease, 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱DNase II）

33、 PPPPPPPPP3限制性內(nèi)切酶（限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease） 簡(jiǎn)稱限制酶簡(jiǎn)稱限制酶 限制性內(nèi)切酶主要降解外源的未經(jīng)特殊修飾的限制性內(nèi)切酶主要降解外源的未經(jīng)特殊修飾的DNA，對(duì)自身起了保護(hù)作用。，對(duì)自身起了保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)概況發(fā)現(xiàn)概況: （1）限制性內(nèi)切酶的特征）限制性內(nèi)切酶的特征 具有嚴(yán)格的堿基專一性，有專一的識(shí)別順序、切點(diǎn)具有嚴(yán)格的堿基專一性，有專一的識(shí)別順序、切點(diǎn) 粘性未端，平整末端粘性未端，平整末端 （2）限制性內(nèi)切酶的命名）限制性內(nèi)切酶的命名 ECoRI （3）限制性內(nèi)切酶舉例）限制性內(nèi)切酶舉例 （四）非專一性核酸酶類（四）非專一性核酸酶類（non

34、specific nuclease） 介紹二種外切酶介紹二種外切酶 1蛇毒磷酸二酯酶（蛇毒磷酸二酯酶（venom phosphodiesterase） PPPOHP5 -核苷酸核苷酸PPOHPPOH+蛇毒磷酸二酯酶對(duì)末端磷酸基有嚴(yán)格的要求蛇毒磷酸二酯酶對(duì)末端磷酸基有嚴(yán)格的要求 寡核苷酸寡核苷酸 水解速度水解速度 最快最快較慢，水解速度降低較慢，水解速度降低10倍倍最慢，幾乎不作用，水解速最慢，幾乎不作用，水解速度再降低度再降低100倍倍 PPPOHPPPPOHHOPPPPHO橘青霉磷酸二酯酶專一性：橘青霉磷酸二酯酶專一性：與蛇毒磷酸二酯酶相同與蛇毒磷酸二酯酶相同 2牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶

35、 對(duì)末端磷酸基的要求與蛇毒磷酸二酯酶相反對(duì)末端磷酸基的要求與蛇毒磷酸二酯酶相反 PPPPHOPPHO+PPPHOP3 -核苷酸核苷酸（五）磷酸單酯酶（五）磷酸單酯酶 將單核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸單酯鍵切開，將單核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸單酯鍵切開，得到磷酸和其它產(chǎn)物得到磷酸和其它產(chǎn)物 1特異性磷酸單酯酶特異性磷酸單酯酶 2非特異性磷酸單酯酶非特異性磷酸單酯酶 磷酸基無論在磷酸基無論在3 或或5 位，都能水解，如位，都能水解，如E. Coli磷酸單酯酶磷酸單酯酶 （1） 磷酸基連在磷酸基連在5 位才能水解，如牛精液位才能水解，如牛精液5 -核苷酸酶核苷酸酶 NP（2） 磷酸基連在磷酸基連在3

36、位才能水解，如麥芽位才能水解，如麥芽3 一核苷酸酶一核苷酸酶 NP七、核酸的性質(zhì)和最常用的研究方法七、核酸的性質(zhì)和最常用的研究方法 （一）一般性質(zhì)：分子大小、性狀、溶解度。（一）一般性質(zhì)：分子大小、性狀、溶解度。 分子大小：分子大?。篋NA Mr 1061010或更大或更大性狀：性狀： DNA為白色纖維狀固體，而為白色纖維狀固體，而RNA為白色粉末。為白色粉末。 溶解度：溶解度：DNA和和RNA均不溶于一般的有機(jī)溶劑，微溶于水，均不溶于一般的有機(jī)溶劑，微溶于水， 但它們的鈉鹽在水中溶解度較大。但它們的鈉鹽在水中溶解度較大。 RNA Mr 104106或更大或更大 （二）粘度（二）粘度 （三）酸

37、堿性質(zhì)（三）酸堿性質(zhì) （四）紫外吸收（四）紫外吸收 由于核酸中堿基的共軛雙鍵，所以對(duì)紫外有強(qiáng)烈吸由于核酸中堿基的共軛雙鍵，所以對(duì)紫外有強(qiáng)烈吸收，最大吸收峰在收，最大吸收峰在260nm260nm附近，利用這一特性可進(jìn)行核附近，利用這一特性可進(jìn)行核酸的定量測(cè)定。酸的定量測(cè)定。 1紫外分光光度法紫外分光光度法 首先根據(jù)首先根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸樣品的純度的比值判斷核酸樣品的純度純純DNA：A260/A280=1.8 純純RNA：A260/A280=2.0（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低）比值明顯降低）純的核酸樣品可根據(jù)純的核酸樣

38、品可根據(jù)260nm的光吸收值算出其含量的光吸收值算出其含量若若260nm光吸收值為光吸收值為1相當(dāng)于相當(dāng)于50g/ml雙螺旋雙螺旋DNA或相當(dāng)于或相當(dāng)于40g/ml單鏈單鏈DNA或或RNA或相當(dāng)于或相當(dāng)于20g/ml寡核苷酸。寡核苷酸。2摩爾磷消光系數(shù)（摩爾磷消光系數(shù)（molar absorptivity）法）法 A：樣品的光吸收值：樣品的光吸收值 C：每升溶液中磷的摩爾數(shù)：每升溶液中磷的摩爾數(shù) L：光徑：光徑 L CA)p(8)磷的原子量(30.9每升中磷的重量C( (g g) )W W LLLWA98.3098.30WACA)p( 在在pH7.0時(shí)；時(shí)；DNA的的 為為6600, RNA的

39、的 為為77007800。 )p( )p( ：摩爾磷消光系數(shù)，也稱摩爾磷吸光系數(shù)：摩爾磷消光系數(shù)，也稱摩爾磷吸光系數(shù) )p( 知道了磷的含量就可知核酸的含量知道了磷的含量就可知核酸的含量3增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)與減色效應(yīng) 增色效應(yīng)（增色效應(yīng)（hyperchromic effect） 減色效應(yīng)（減色效應(yīng)（hypochromic effect） （五）沉降特性（五）沉降特性 1核酸浮力密度的測(cè)定核酸浮力密度的測(cè)定 浮力密度：經(jīng)密度梯度沉降平衡法測(cè)出的密度浮力密度：經(jīng)密度梯度沉降平衡法測(cè)出的密度 氯化絕（氯化絕（CsCl）密度梯度沉降平衡）密度梯度沉降平衡 用用12個(gè)已知浮力密度的標(biāo)準(zhǔn)個(gè)已知浮力

40、密度的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品作參考樣品作參考 102022010)rr (2 . 4 式中式中 ：未知：未知DNA的密度的密度 0：標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)DNA的密度的密度 ：角速度（弧度：角速度（弧度/秒）秒） r： 未知未知DNA與轉(zhuǎn)軸之間的距離與轉(zhuǎn)軸之間的距離 r0：已知：已知DNA與轉(zhuǎn)軸之間的距離與轉(zhuǎn)軸之間的距離 2DNA中中G-C含量的測(cè)定含量的測(cè)定 G-C對(duì)的含量與浮力密度之間呈正比關(guān)系對(duì)的含量與浮力密度之間呈正比關(guān)系 Rolfe-Meselson導(dǎo)出了如下公式：導(dǎo)出了如下公式： =0.100（G-C%）+1.658(g/cm3) 知道了浮力密度就可計(jì)算出知道了浮力密度就可計(jì)算出G-C對(duì)的含量對(duì)的含量

41、 3核酸的構(gòu)象和分離核酸的構(gòu)象和分離 ：RNA環(huán)狀環(huán)狀DNA線狀線狀DNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) DNA 沉降沉降（六）核酸的變性、復(fù)性和雜交（六）核酸的變性、復(fù)性和雜交 1變性（變性（denaturation） 核酸變性的概念核酸變性的概念 引起核酸變性的因素引起核酸變性的因素 （1）熱變性）熱變性 結(jié)構(gòu)：螺旋結(jié)構(gòu)：螺旋線團(tuán)線團(tuán) 理化性質(zhì)：紫外吸收理化性質(zhì)：紫外吸收 粘度粘度比旋光度比旋光度 生物活性：生物活性生物活性：生物活性或喪失或喪失 （2）熔點(diǎn)（）熔點(diǎn)（Tm） Tm: 熔點(diǎn)，熔解溫度，熔點(diǎn)，熔解溫度， 變性溫度，解鏈溫度變性溫度，解鏈溫度 （3）影響）影響Tm值的因素值的因素 DNA的均一性的

42、均一性 DNA中中G-C對(duì)的含量對(duì)的含量 經(jīng)驗(yàn)式經(jīng)驗(yàn)式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44 鹽離子強(qiáng)度鹽離子強(qiáng)度 2復(fù)性（復(fù)性（renaturation） （1）復(fù)性）復(fù)性 理化性質(zhì)理化性質(zhì): 比旋光度比旋光度 粘度粘度)p( 高于高于Tm值值5 復(fù)性復(fù)性 也稱退火也稱退火（annealing）緩緩慢慢冷冷卻卻迅迅速速冷冷卻卻生物活性得到部分恢復(fù)生物活性得到部分恢復(fù) （2）影響復(fù)性的因素）影響復(fù)性的因素 樣品的性質(zhì)樣品的性質(zhì) DNA的濃度的濃度 DNA片段的大小片段的大小 溫度溫度 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度 （3）復(fù)性動(dòng)力學(xué)）復(fù)性動(dòng)力學(xué) DNA的復(fù)性過程是一種雙分子反應(yīng)的復(fù)性過程是一種雙分子反

43、應(yīng) DSSk S：single strand DNA D：double strand DNA 2kcdtdc 經(jīng)重排，積分等經(jīng)重排，積分等 式中式中 C0：t=0時(shí)，起始時(shí)，起始DNA的濃度（的濃度（mol/L） C：t時(shí)間時(shí)，單鏈時(shí)間時(shí)，單鏈DNA的濃度（的濃度（mol/L） k：復(fù)性反應(yīng)常數(shù)（：復(fù)性反應(yīng)常數(shù)（L/molsec） t：復(fù)性時(shí)間（：復(fù)性時(shí)間（sec） CC0= 11+kC0t21CC0 Cot : 21時(shí)的時(shí)的Cot值，即指復(fù)性完成一半時(shí)的值，即指復(fù)性完成一半時(shí)的Cot值。值。 3雜交（雜交（hybridization） 核酸的雜交：是指不同來源的單鏈核酸之間可通過核酸的雜交：

44、是指不同來源的單鏈核酸之間可通過 堿基互補(bǔ)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。堿基互補(bǔ)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。 單鏈單鏈DNA與單鏈與單鏈DNA雜交（雜交（DNA-DNA）利用核酸雜交可檢測(cè)特定的核苷酸片段或研究同源性等。利用核酸雜交可檢測(cè)特定的核苷酸片段或研究同源性等。單鏈單鏈DNA與單鏈與單鏈RNA雜交（雜交（DNA-RNA）單鏈單鏈RNA與單鏈與單鏈RNA雜交（雜交（RNA-RNA）用硝酸纖維素膜作為支持物進(jìn)行雜交用硝酸纖維素膜作為支持物進(jìn)行雜交 1975年英國(guó)年英國(guó)E. M. Southern首創(chuàng)的首創(chuàng)的Southern blotting（Southern印跡）印跡）原理原理方法方法探針：作為檢測(cè)用的已知探針：作

45、為檢測(cè)用的已知DNA序列或序列或RNA序列的片段序列的片段 1977年年G.K.Stark首創(chuàng)首創(chuàng)Northern blotting （Northern印跡）印跡） Western blotting（Western 印跡）印跡） （七）凝膠電泳（七）凝膠電泳 核酸研究中最常用的方法核酸研究中最常用的方法 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、靈敏、成本低。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、靈敏、成本低。 通過凝膠電泳通過凝膠電泳 （1）可進(jìn)行核酸分離，知道核酸的純度。）可進(jìn)行核酸分離，知道核酸的純度。 （2）測(cè)定分子大小。）測(cè)定分子大小。 （3）估計(jì)核酸的構(gòu)象。）估計(jì)核酸的構(gòu)象。 凝膠電泳兼有分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)凝膠電泳兼有分子

46、篩效應(yīng)和電荷效應(yīng) 1瓊脂糖凝膠電泳（瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis） 瓊脂糖凝膠電泳的遷移率主要與分子大小、膠濃度、瓊脂糖凝膠電泳的遷移率主要與分子大小、膠濃度、核酸構(gòu)象、電流等有關(guān)。核酸構(gòu)象、電流等有關(guān)。 2聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 （polyacrylamide gel electrophoresis） 用于分析用于分析RNA或或Mr小于小于1000bp的的DNA片段片段 適用于大分子核酸，一般用于適用于大分子核酸，一般用于DNA分析。分析。 八、核酸的生物功能八、核酸的生物功能 （一）（一）DNA的生物功能的生物功能 1DNA與遺傳與遺

47、傳 （1）DNA是主要的遺傳物質(zhì)是主要的遺傳物質(zhì)間接證據(jù)間接證據(jù)直接證據(jù)直接證據(jù) 細(xì)菌轉(zhuǎn)化作用細(xì)菌轉(zhuǎn)化作用 （transformation ）肺炎球菌（肺炎球菌（pneumococcus） 1928年細(xì)菌學(xué)家年細(xì)菌學(xué)家Griffith 細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn)細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn) 1944年年Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)化作用：轉(zhuǎn)化作用：轉(zhuǎn)化作用的物質(zhì)稱轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化作用的物質(zhì)稱轉(zhuǎn)化因子 從一種細(xì)菌中得到從一種細(xì)菌中得到DNA通過一定途徑進(jìn)入另一種細(xì)菌，通過一定途徑進(jìn)入另一種細(xì)菌，從而引起后者遺傳特性的改變。從而引起后者遺傳特性的改變。 噬菌體感染實(shí)驗(yàn)噬菌體感染實(shí)驗(yàn) 1952年美國(guó)年美國(guó)Hershey 噬

48、菌體感染實(shí)驗(yàn)噬菌體感染實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（transduction） 人工合成基因的表達(dá)人工合成基因的表達(dá) （2）DNA的復(fù)制（的復(fù)制（replication） （3）DNA的轉(zhuǎn)錄（的轉(zhuǎn)錄（transcription） 2DNA與變異與變異 突變突變 染色體畸變?nèi)旧w畸變 基因突變基因突變 （1）基因突變（）基因突變（genetic mutation） 基因概念的發(fā)展、補(bǔ)充基因概念的發(fā)展、補(bǔ)充 什么是基因突變什么是基因突變 基因突變的幾種主要形式基因突變的幾種主要形式 堿基取代（堿基取代（base substitution，也稱堿基置換），也稱堿基置換） A.轉(zhuǎn)換（轉(zhuǎn)換（transiti

49、on） B.顛換（顛換（transversion） 堿基缺失（堿基缺失（base deletion） 堿基插入（堿基插入（base insertion） 突變的原因突變的原因 自發(fā)突變自發(fā)突變 誘發(fā)突變?nèi)缱贤饩€、誘發(fā)突變?nèi)缱贤饩€、X-射線、亞硝酸、烷化劑、射線、亞硝酸、烷化劑、 堿基類似物等堿基類似物等 嘧啶二聚體嘧啶二聚體 脫氨脫氨（2）基因重組（）基因重組（gene recombination） 基因的體外重組，即基因工程（基因的體外重組，即基因工程（genetic engineering） 獲得目的基因獲得目的基因 基因載體（基因載體（vector） 目的基因與基因載體連接形成重組目的基

50、因與基因載體連接形成重組DNA 通過轉(zhuǎn)化或其它方法將重組通過轉(zhuǎn)化或其它方法將重組DNA分子引入受體細(xì)胞分子引入受體細(xì)胞 被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選和繁殖被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選和繁殖 3. DNA與遺傳性疾病、癌變的關(guān)系與遺傳性疾病、癌變的關(guān)系（1）鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的）鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的DNA點(diǎn)突變點(diǎn)突變（2）白化病的基因缺失）白化病的基因缺失（3）癌變）癌變（二）（二）RNA的生物功能的生物功能 1RNA與蛋白質(zhì)的生物合成與蛋白質(zhì)的生物合成 （1）mRNA與遺傳密碼與遺傳密碼 遺傳密碼（遺傳密碼（genetic code） 密碼子（密碼子（codon） mRNA的主要功能的主要功能 （2）tRNA的作用的

51、作用 tRNA的作用是多方面的，它接受氨基酸、攜帶氨基酸，的作用是多方面的，它接受氨基酸、攜帶氨基酸，把氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體上，然后按照把氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體上，然后按照mRNA上的密碼順序上的密碼順序裝配成多肽或蛋白質(zhì)。裝配成多肽或蛋白質(zhì)。 tRNA必須識(shí)別相應(yīng)的氨基酸和識(shí)別必須識(shí)別相應(yīng)的氨基酸和識(shí)別mRNA上相應(yīng)的密上相應(yīng)的密碼子。碼子。 tRNA怎樣識(shí)別相應(yīng)的氨基酸怎樣識(shí)別相應(yīng)的氨基酸: 主要靠高度專一的氨主要靠高度專一的氨酰酰-tRNA合成酶。合成酶。Eaa+tRNAaatRNA+EtRNA怎樣識(shí)別怎樣識(shí)別mRNA上相應(yīng)的密碼子上相應(yīng)的密碼子 （3）rRNA的作用的作用 2RNA與遺傳與遺

52、傳 九、核酸的分離、純化和核苷酸的制備九、核酸的分離、純化和核苷酸的制備 （一）核酸的分離、提取通則（一）核酸的分離、提取通則 為了得到完整的大分子核酸，一般要注意為了得到完整的大分子核酸，一般要注意3點(diǎn)點(diǎn) :1保持低溫（保持低溫（04）。）。 2防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌。防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌。 3防止核酸酶的作用。防止核酸酶的作用。 抑制抑制DNase： 可加檸檬酸鈉、可加檸檬酸鈉、EDTA等金屬螯合劑；或加去污劑等金屬螯合劑；或加去污劑 ： 十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDS）；或加蛋白變性劑。）；或加蛋白變性劑。 抑制抑制RNase： （1）實(shí)驗(yàn)器皿高溫，或高壓滅菌，不能

53、高壓滅菌的用）實(shí)驗(yàn)器皿高溫，或高壓滅菌，不能高壓滅菌的用 具用具用0.1%二乙基焦碳酸鹽（二乙基焦碳酸鹽（diethyl pyrocarbonate, DEPC）處理。）處理。 （2）加強(qiáng)的蛋白變性劑如硫氰酸胍、異硫氰酸胍等。）加強(qiáng)的蛋白變性劑如硫氰酸胍、異硫氰酸胍等。 （3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等）等RNase的抑制劑。的抑制劑。 （二）大分子（二）大分子DNA的提取的提取 1材料的選擇材料的選擇 2細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 3DNA-蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)（DNP）的提取）的提取 真核細(xì)胞真核細(xì)胞DNA與蛋白質(zhì)結(jié)與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白（合成核蛋白（DNP），），RNA

54、與與蛋白質(zhì)結(jié)合成蛋白質(zhì)結(jié)合成RNP，而且，而且DNP和和RNP常常混在一起。利用常常混在一起。利用DNP和和RNP在不同濃度在不同濃度NaCl中中溶解度的不同來分離溶解度的不同來分離DNP和和RNP。 可用可用1mol/LNaCl溶液提取溶液提取DNP。 0.51.0012 0.14相相對(duì)對(duì)溶溶解解度度NaCl（mol/L）DNP在在NaCl中的溶解度中的溶解度4 4去蛋白質(zhì)去蛋白質(zhì) （1 1）SDS SDS （2 2）苯酚法）苯酚法 （3 3）氯仿法）氯仿法 （4 4）酚）酚: :氯仿氯仿: :異戊醇異戊醇25:24:1 25:24:1 5沉淀沉淀DNA 6去雜質(zhì)去雜質(zhì) （1）去）去RNA

55、（2）去多糖）去多糖 7進(jìn)一步純化進(jìn)一步純化 生物材料生物材料 DNP（RNP） DNP 纖維狀纖維狀DNA 較純較純DNA 純純DNA *原核生物的原核生物的DNA是裸露的，與蛋白質(zhì)結(jié)合不多，分離純化要簡(jiǎn)單些。是裸露的，與蛋白質(zhì)結(jié)合不多，分離純化要簡(jiǎn)單些。 破細(xì)胞破細(xì)胞1.0mol/L NaCl*去蛋白質(zhì)去蛋白質(zhì)酒精沉淀酒精沉淀去去RNA柱層析，電泳柱層析，電泳密度梯度離心密度梯度離心去去多糖多糖（三）（三）RNA的提取的提取 1不同種類不同種類RNA的提取的提取 2大分子大分子RNA的提取的提取 （1）酚提?。┓犹崛?（2）酚）酚-氯仿氯仿-SDS法法 3mRNA的提取的提取 4工業(yè)上制備工業(yè)上制備RNA （1）稀堿法）稀堿法 （2）濃鹽法）濃鹽法 清液調(diào)pH至2.5RNA酵酵母母稀稀堿堿法法1%NaOH濃濃鹽鹽法法10%NaCl破破細(xì)細(xì)胞胞壁壁釋釋放RNA中中和和后后離離心心除除去去菌菌體體離離心心（四）核酸純度鑒定（四）核酸純度鑒定 1.A260/A280 2.電泳電泳 （五）核酸含量的測(cè)定（五）核酸含量的測(cè)定 1.定磷法定磷法 2.定糖法定糖法 3.紫外吸收法紫外吸收法 （六）核苷酸的制備（六）核苷酸的制備 1堿水解堿水解 2酶水解酶水解 3.自溶法自溶法