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1、 一、基因工程的基本操作工具 1.與DNA分子相關的酶 (1)幾種酶的比較續(xù)表 (2)限制酶與DNA連接酶的關系 限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。 DNA連接酶起作用時不需要模板。2載體(1)作用作為運載工具，將目的基因轉移到宿主細胞內。利用它在宿主細胞內對目的基因進行大量復制。(2)具備的條件能在宿主細胞內穩(wěn)定保存并大量復制。有多個限制酶切割位點，以便與外源基因連接。具有特殊的標記基因，以便進行篩選。 (3)種類 質粒：一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，能夠自我復制的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。 噬菌體的衍生物。 動植物病毒。

2、【友情提醒】一般來說，天然載體往往不能滿足人類的所有要求，因此人們根據不同的目的和需要，對某些天然的載體進行人工改造。 限制酶切割位點所處的位置必須是在所需的標記基因之外，這樣才能保證標記基因的完整性，有利于對目的基因的檢測。 【例1】（雙選）下列有關基因工程中限制性核酸內切酶的描述，錯誤的是() A一種限制性核酸內切酶能識別多種特定的脫氧核苷酸序列 B限制性核酸內切酶的活性受溫度影響 C限制性核酸內切酶能識別和切割RNA D限制性核酸內切酶可從原核生物中提取AC 【解析】本題考查基因工程中工具酶的有關知識。大部分酶的化學本質是蛋白質，少數酶的化學本質是RNA。酶的活性受到溫度和pH的影響；限

3、制性核酸內切酶的特點是能識別雙鏈DNA中特定的核苷酸序列，可在特定的位點進行切割；限制性核酸內切酶主要是從原核生物體內分離出來的。 【例2】質粒作為“分子運輸車”的條件是() 能夠自我復制雙鏈環(huán)狀DNA分子有多個限制酶切點有標記基因真核細胞中沒有 A B C D 【解析】載體具備的條件是：有標記基因；具有多個限制酶切點；能在宿主細胞內穩(wěn)定保存并大量復制。C 二、基因工程操作程序 1基因工程技術生產凝乳酶的過程 2基因工程的操作程序分析 (1)目的基因的獲取途徑 從自然界中已有的物種中分離出來，如從基因組文庫或cDNA文庫中獲取。 人工合成目的基因 常用的方法有反轉錄法和化學合成法。 利用PCR

4、技術擴增目的基因 通過PCR技術可對已獲取的目的基因進行擴增，以獲取大量的目的基因。 (2)基因表達載體的構建 目的基因的表達需要調控序列，因而用作載體的質粒的插入基因部位之前需有啟動子，之后需有終止子。 (3)目的基因導入受體細胞 (4)目的基因的檢測與鑒定 【例3】下列關于基因表達載體構建的相關敘述，不正確的是() A需要限制酶和DNA連接酶 B必須在細胞內進行 C抗生素抗性基因可作為標記基因 D啟動子位于目的基因的首端B 【解析】基因表達載體是目的基因與載體的結合，在此過程中需用同一種限制酶切割目的基因與載體，用DNA連接酶將相同的末端連接起來；基因表達載體的構建是在細胞外進行的；基因表

5、達載體包括啟動子(位于基因首端使轉錄開始)、終止子、目的基因和標記基因。1質粒是小型的環(huán)狀DNA分子，本質是DNA，不是細胞器。2基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。3標記基因的作用：篩選、檢查目的基因是否導入受體細胞，常見的標記基因有抗生素抗性基因、發(fā)光基因。4受體細胞常選用植物受精卵或體細胞(經組織培養(yǎng))、動物受精卵(一般不用體細胞)、微生物(大腸桿菌、酵母菌等)。一般不用支原體，因為它營寄生生活；一定不能用哺乳動物成熟的紅細胞，原因是它無細胞核，不能合成蛋白質。 1.(2010全國)下列敘述符合基因工程概念的是( ) AB淋巴細胞與腫瘤細胞融合，雜交瘤細胞中含有B淋巴細胞中的抗體基因

6、 B將人的干擾素基因重組到質粒后導入大腸桿菌，獲得能產生人干擾素的菌株 C用紫外線照射青霉菌，使其DNA發(fā)生改變，通過篩選獲得青霉素高產菌株 D自然界中天然存在的噬菌體自行感染細菌后其DNA整合到細菌DNA上B 【解析】單克隆抗體的制備屬于細胞工程技術；用紫外線照射青霉菌獲得青霉素高產菌株屬于誘變育種，而基因工程技術是按照人們的意愿，把一種生物的某一種基因提取出來，加以修飾和改造，然后放到另一種生物細胞里，定向地改造生物的遺傳性狀，因此，選B。 2.(2011四川)北極比目魚中有抗凍基因，其編碼的抗凍蛋白具有11個氨基酸的重復序列，該序列重復次數越多，抗凍能力越強。下圖是獲取轉基因抗凍番茄植株

7、的過程示意圖，有關敘述正確的是( )A過程獲取的目的基因，可用于基因工程和比目魚基因組測序B將多個抗凍基因編碼區(qū)依次相連成能表達的新基因，不能得到抗凍性增強的抗凍蛋白C過程構成的重組質粒缺乏標記基因，需要轉入農桿菌才能進行篩選D應用DNA探針技術，可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其完全表達B 【解析】通過過程獲得的目的基因只是比目魚基因組的部分基因，無法據此測定基因組堿基序列；由于每個抗凍基因的編碼區(qū)在轉錄時，均會在其產物mRNA中出現終止密碼子，故得不到抗凍能力增強的抗凍蛋白；重組質粒轉入農桿菌的目的是通過農桿菌轉化法將目的基因導入番茄細胞中；檢測目的基因在番茄植株內是否完全表達

8、，應進行抗原抗體雜交實驗或個體生物學水平檢測。3.(2011上海)回答下列有關基因工程的問題。(1)基因工程中使用的限制酶，其特點是 。下圖四種質粒含有E1和E2兩種限制酶的識別位點，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四環(huán)素的抗性基因。特異性地識別和切割DNA(2)將兩端用E1切開的Tcr基因與用E1切開的質粒X1混合連接，連接后獲得的質粒類型有 。(可多選) AX1 BX2 CX3 DX4(3)若將上圖所示X1、X2、X3、X4四種質粒導入大腸桿菌，然后分別涂布在含有青霉素或四環(huán)素的兩種培養(yǎng)基上。在這兩種培養(yǎng)基上均不能生長的大腸桿菌細胞類型有 、 。ABC無質粒細胞含X3的細胞(4)

9、如果X1用E1酶切，產生850對堿基和3550對堿基兩種片段；那么質粒X2(Tcr基因的長度為1200對堿基)用E2酶切后的片段長度為 對堿基。(5)若將外源的Tcr基因兩端用E2切開，再與用E2切開的X1混合連接，并導入大腸桿菌細胞，結果顯示，含X4的細胞數與含X1的細胞數之比為1 3，增大DNA連接酶用量能否提高上述比值？ 。原因是 。4750不能DNA連接酶對DNA片段沒有選擇性或兩段DNA末端相同 【解析】每種限制酶能特異性識別專一DNA序列，并在切割位點將其準確切割。因目的基因和質粒都是用E1切開且質粒上有兩個E1酶切位點，故Apr基因和Tcr基因的黏性末端相同，既可能出現Apr基因

10、和X1連接的產物(X1)，也可能出現Tcr基因和X1連接的產物(X2)，還可能出現X1兩端連接形成的產物(X3)。X1即質粒中含有Apr基因，能在含有青霉素的培養(yǎng)基上生長，X2中含有Tcr基因，能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，X4中含有Apr基因和Tcr基因，能在含有青霉素或者四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長，而X3中沒有這兩種抗性基因，故沒有導入質粒的大腸桿菌細胞和導入X3的大腸桿菌細胞在這兩種培養(yǎng)基上均不能生長。由圖可知，X2為X1剪切Apr基因后再連接Tcr基因形成的，故其長度為335012004750對堿基。DNA連接酶作用于磷酸二酯鍵，對DNA片段沒有選擇性，故不能通過增大DNA連接酶的用量提高兩

11、種細胞數目的比值。 4.下列屬于PCR技術的條件的是( )引物 目的基因所在的DNA片段 脫氧核苷酸 核糖核苷酸 DNA連接酶 DNA聚合酶 DNA限制性核酸內切酶 A B C DB【解析】 PCR技術需要一小段與要擴增的DNA兩端的一些序列互補的RNA作為引物、要擴增的DNA作為模板、四種脫氧核苷酸作為原料、需要耐熱的DNA聚合酶催化。 5.下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是( )CA BC D 【解析】圖是將一個DNA切成互補的兩個黏性末端，必需限制性核酸內切酶的作用；圖是將兩個DNA片段連接在一起

12、，需DNA連接酶的作用；圖是DNA分子雙鏈解旋成兩條互補單鏈的過程，需解旋酶的作用；圖是DNA復制的過程，需DNA聚合酶的作用。6.（雙選）甲、乙兩圖表示從細菌細胞中獲取目的基因的兩種方法，以下說法中錯誤的是( )A甲方法可建立該細菌的基因組文庫B乙方法可建立該細菌的cDNA文庫C甲方法要以脫氧核苷酸為原料D乙方法需要DNA聚合酶參與CD 【解析】首先要知道甲圖描述的為該細菌的基因組文庫，只要利用DNA限制性核酸內切酶將其原有的DNA切斷即可，不需要以脫氧核苷酸為原料。乙圖描述的為細菌的部分基因組文庫。乙方法需要逆轉錄酶參與，并需要以脫氧核苷酸為原料。7.（雙選）下圖是將人的生長激素基因導入細

13、菌B細胞內制“工程菌”的示意圖。已知細菌B細胞內不含質粒A，也不含質粒A上的基因。判斷下列說法正確的是( ) CDA將重組質粒導入細菌B常用的方法是顯微注射法B將完成導入過程后的細菌涂布在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能生長的只是導入了重組質粒的細菌C將完成導入過程后的細菌涂布在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，能生長的就是導入了質粒A的細菌D目的基因成功導入并表達的標志是受體細胞中能檢測到人的生長激素 【解析】將目的基因導入到細菌細胞中常用的方法是Ca2處理法；基因必須保持結構的完整性才能得以表達，而抗氨芐青霉素基因結構完整，能夠表達而使細菌具有對氨芐青霉素的抗性，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能存活的是導入了質粒A或導入了重組質粒的細菌；由于將人的生長激素基因導入到質粒的抗四環(huán)素基因上，破壞了抗四環(huán)素基因的完整性，導入了重組質粒的細菌也沒有對四環(huán)素的抗性，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能存活，能存活的是導入質粒A的細菌。目的基因成功表達的標志是檢測到相應蛋白質。