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1、 考點75蛋白質(zhì)的提取與分離 高考頻度：★★☆☆☆ 難易程度；★★★☆☆ “考點解 1?蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù) 分子的形狀、大小；電荷性質(zhì)和多少；溶解度；吸附性質(zhì)；對其他分子親和力口 2,凝膠色譜法 (1)材料：凝膠 (2)步驟：混合物上柱一洗脫一大分子流動快、小分子流動慢一收集大分子一收集小分子 原理：當(dāng)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部 的通道，路程較長，移動速度較慢；相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能 在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。 3,緩沖溶液

2、(1)概念：在一定范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的溶液. (2)作用：能夠抵制外界的酸或堿的對溶液的pH的影響，維持pH基本不變, (3)配制：通常由1—2種緩;沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH 范圍內(nèi)使用的緩沖液。由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽溶解于水中。如HaCOMMaHCCh，NaH2PO4/Na2 HPOa 等口 (4)本實驗使用的是磷酸緩沖液(NaHaPCWN鼓HPCU),目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的pH環(huán)境，保證 血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)口 4,電泳法 (1)概念：指帶電粒

3、子在電場作用下發(fā)生遷移的過程. (2)原理：分離樣品中各種分予帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不 同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離打 (3)類型: 瓊脂糖凝膠電泳法：由于瓊脂糖本身不帶電荷，各種分子在電場中遷移速度決定于所帶電荷性質(zhì) 的差異及分子的大小、形狀的不同口 聚丙烯酰胺凝膠電泳法：在凝膠中加入SDS,使蛋白質(zhì)解聚成單鏈，與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)一S DS復(fù)合物，使其遷移速度完全取決于分子的大小。 5.實驗操作 實驗操作的基本步驟：樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。 （一）樣品處理 （1）紅細(xì)胞的洗滌： ①目的：去除雜蛋白。 ②為防止

4、血液凝固，應(yīng)先加入檸檬酸鈉。 ③所用洗滌液：是五倍體積的生理鹽水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液）。 ④緩慢攪拌，采用低速短時間離心。 ⑤洗滌干凈的標(biāo)準(zhǔn)是上清液沒有黃色。 （2）血紅蛋白的釋放：在蒸播水和甲苯的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。 （3）分離血紅蛋白溶液：（方法）離心。 試管中的溶液分為4層，從上往下依次是： ①無色透明的甲苯層。 ②白色薄層固體：脂溶性物質(zhì)沉淀層。 ③紅色透明液體：血紅蛋白溶液層。 ④暗紅色沉淀層：紅細(xì)胞破碎物沉淀。 （4）透析： ①方法：取1 mL血紅蛋白溶液裝入透析袋，將透析袋放入盛有300 mL物質(zhì)的量濃度為20 mm ol/L

5、的磷酸緩沖液（pH為7）中，透析12 h。 ②目的：去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)。 ③原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。 （二）凝膠色譜操作 （1）凝膠色譜柱的制作 制作步驟：打孔一挖穴一安管一覆網(wǎng)-紗包一插管。 （2）凝膠色譜柱的裝填 ①材料：實驗所用凝膠是交聯(lián)葡聚糖凝膠。 ②方法：凝膠用蒸儲水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)。不能有氣泡存 在。然后用300 mL物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡12 h,使凝膠裝填 緊密。 ⑶樣品的加入和洗脫 使吸管管口沿管壁將樣品緩慢加入色譜柱內(nèi)，不要破壞凝膠面口待紅色的蛋

6、白質(zhì)接近色譜柱低端 時，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。 點考向一 考向一蛋白質(zhì)提取與分離的方法及原理 1 .卜列有關(guān)提取和分離豬血紅蛋白的實驗，敘述錯誤的是 A.用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，以防止紅細(xì)胞破裂 B,用蒸僧水和甲苯處理紅細(xì)胞，使其釋放出血紅蛋白 C,用生理鹽水透析血紅蛋白溶液，以保持血紅蛋白活性 D.用磷酸緩沖液洗脫，有利于血紅蛋白在凝膠柱中移動 【參考答案】C 【試題解析】A.生理鹽水的濃度與紅細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的濃度相當(dāng)，在生理鹽水中，紅細(xì)胞能維持正常的 形態(tài)，因此用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，可以防止紅細(xì)胞破裂，A正確；B.紅細(xì)胞釋放血紅蛋白，需加入 蒸

7、饋水和40%的甲苯，再在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0 min,在蒸憎水和甲苯的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋 放出血紅蛋白，B正確；C.將盛有血紅蛋白溶液的透析袋放入一定濃度的磷酸緩沖液中透析，C錯誤; D、磷酸名爰沖液可維持血紅蛋白的正常特性，用磷酸緩沖液洗脫，有利于血紅蛋白在凝膠柱中移動，D 正確。 然M噌 2 .已知某樣品中存在甲、乙，丙、丁，戊五種蛋白質(zhì)分子，分子大小、電荷的性質(zhì)和數(shù)量情況如圖所示， 下列有關(guān)蛋白質(zhì)分離的敘述正確的是 丙, 甲 ■ 相對分子質(zhì)fit ?T ?皮 A.若將樣品以2 000 r/min的速度離心10 min,分子戊在沉淀中，則丙也一定在沉淀中 B.若用

8、凝膠色譜法分離樣品中的蛋白質(zhì)，則分子甲移動速度最快 C.將樣品裝入透析袋中透析12 h,若分子丙保留在袋內(nèi)，則乙也一定保留在袋內(nèi) D.若用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質(zhì)，則分子甲和分子丁形成的電泳帶相距最遠(yuǎn) 【答案】A 【解析】丙的分子量比戊要大，因此若將樣品以2 000 r/min的速度離心10 min,分子戊在沉淀中，則 丙也一定在沉淀中，A正確；分析題圖可知，甲分子量最小，如果用凝膠色譜柱分離樣品中的蛋白質(zhì)， 甲很容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程最長，移動的速度最慢，B錯誤；分析題圖可知，與乙相比丙的分 子量較大，如果將樣品裝入透析袋中透析12 h,若分子丙保留在袋內(nèi)，乙

9、不一定保留在袋內(nèi)，C錯誤； SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳的迂移速率完全取決于分子大小，甲和丙之間分子量相差最大，因此二 者之間的電泳帶相距最遠(yuǎn)，D錯誤。 考向二 蛋白質(zhì)提取與分離的實驗操作 3 .下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是 A.可采集豬血作為實驗材料 B.用蒸儲水重復(fù)洗滌紂細(xì)胞 C.血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時間離心 D.洗脫液接近色譜柱底端時開始收集流出液 【參考答案】A 【試題解析】A、豬是哺乳動物，其成熟的紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核和眾多細(xì)胞器，含有大量的血紅蛋白，可 采集豬血作為實臉材料，A正確；B、用生理鹽水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞，B錯誤；C、血紅蛋

10、白釋放后應(yīng)中速 長時間離心，C錯誤：D、血紅蛋白為有色蛋白，分離時，可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗 脫液，D錯誤。 易錯警示 1 .紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心口 2 .色譜柱的裝填:裝填盡量緊密，降低顆粒間隙：無氣泡；洗脫液不能斷流口 3 .凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡電 4 .色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。 5 .血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中Oz或CCh的運輸=請根據(jù)血紅蛋白 的提取和分離流程圖回答問題。 (1)將實驗流程補充完整：A為, B為 凝膠色譜法是根據(jù) 而達(dá)到蛋白

11、 質(zhì)分離的有效方法。 (2)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除,洗滌次數(shù)過少，無法除去:離心速度過高和時間 過長會使_ 一同沉淀，達(dá)不到分離的效果.洗滌干凈的標(biāo)志是一 口釋放血紅蛋白的 過程中起作用的是. (3)在洗脫過程中加入物質(zhì)的量濃度為20 mmoVL的磷酸緩沖液(pH為7.。)的目的是 0如果 紅色區(qū)帶，說明色譜柱制作成功， 【答案】(1)血紅蛋白的釋放 樣品的加入和洗脫 相對分子質(zhì)量的大小 (2)雜蛋白(血漿蛋白) 血漿蛋白 白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞 離心后的上清液中沒有黃色 蒸鐳水和甲苯 (3.)準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的生理環(huán)境，保持體外的pH和體內(nèi)一致 均勻一致地移動 【解析】血紅蛋的提取

12、與分離的實驗步藤主要有①樣品處理：紅細(xì)胞的洗滌—血紅蛋白的釋放一 分離血紅蛋白溶液一透析；②粗分離；③純化：凝膠色譜柱的制作一凝膠色譜柱的裝填一樣品的加入和 洗脫；④純度鑒定——聚丙烯酰胺胺電泳口所以A表示血紅蛋白的釋放，日表示樣品的加入和洗脫“凝 膠色譜法的原理是分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快：分子量小的分子穿過多 孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。所以凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量大小而達(dá)到蛋白質(zhì)分離的有效 方法0 (2)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜質(zhì)蛋白，釋放血紅蛋白的過程是讓紅細(xì)胞吸水脹破◎如果分層 不明顯，可能是洗滌次數(shù)少，無法除去血漿蛋白。此外，離心速度過高和時間過

13、長，會使白細(xì)胞和淋巴 細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。重復(fù)洗滌三次，直至上清液中 沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。甲苯是表面活性劑的一種，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，釋 放血紅蛋白的過程中起作用的是蒸餡水和甲苯。（3）磷酸緩沖液（pH為7.0）能夠準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的 生理環(huán)境，保持體外的pH和體內(nèi)的一致。如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確，能清楚地 看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻一致地移動，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說 明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。 、（點過關(guān)、* 1.下列關(guān)于蛋白質(zhì)性質(zhì)的敘述中，不會影響到蛋白

14、質(zhì)在凝膠電泳中運動速度的是 A.蛋白質(zhì)分子的大小 B.蛋白質(zhì)分子的密度 C.蛋白質(zhì)分子的形狀 D.蛋白質(zhì)分子所帶電荷量 2.在蛋白質(zhì)的提取和分離中，對于樣品的處理過程的分析正確的是 A.洗滌時離心速度過高、時間過長，白細(xì)胞等會沉淀，達(dá)不到分離的效果 B.洗滌紅細(xì)胞的目的是除去血漿中的葡萄糖、無機鹽 C.洗滌過程中用0.1%的生理鹽水 D.透析的目的是去除樣品中相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì) 3 .下列關(guān)于從細(xì)胞中提取分離血紅蛋白的說法，錯誤的是 A.對樣品的處理過程分為紅細(xì)胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液和透析 B.洗滌血紅蛋白的目的是去除一些雜蛋白，所用試劑為生理鹽

15、水 C.凝膠色譜法分離血紅蛋白時相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)通過色譜柱的速度快 D.將樣品加入色譜柱頂端時，下端的流出口應(yīng)處于打開狀態(tài) 4 .下列關(guān)于血紅蛋白的提取和分離的敘述中，錯誤的是 A.紅細(xì)胞的洗滌效果與洗滌次數(shù)、離心速度和離心時間有關(guān) B.凝膠柱中適量氣泡的存在會提高分離的效果 C.凝膠色譜法是一種根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小來分離蛋白質(zhì)的方法 D.判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求可以采用電泳法 5 .下列有關(guān)蛋白質(zhì)提取和分離的說法，錯誤的是 A.透析法分離蛋白質(zhì)的原理是利用蛋白質(zhì)不能通過半透膜的特性 B.采用透析法使蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分離開來 C離心沉降法通過控制離心速

16、率使分子大小，密度不同的蛋白質(zhì)分離 D.蛋白質(zhì)在電場中可以向與其自身所帶電荷電性相同的電極方向移動 6 .相對分子質(zhì)量不同的兩種蛋白質(zhì)在凝膠色譜柱中的行進(jìn)過程，可表示為圖中哪一個 7 .下列有關(guān)血紅蛋白的提取與分離的實驗操作的敘述，正確的是 A.分離紅細(xì)胞時采用低速長時間離心 8 .紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸譚水即可 C分離血紅蛋白溶液要低速短時間離心 D.透析時要用20 mmoVL的磷酸緩沖液,透析12 h 8 .鐮刀型細(xì)胞貧血癥是一種由基因突變引起的遺傳病，患者的紅細(xì)胞是彎曲的鐮刀狀口這樣的紅細(xì)胞容易 破裂，使人患溶血性貧血.嚴(yán)重時會導(dǎo)致死亡。某科學(xué)興趣小組計劃從

17、血紅蛋白的成分是否變化來開展 研究性學(xué)習(xí)，下列是該小組成員獲得純度很高的血紅蛋白的實驗過程，不正確的一項是 A.對紅細(xì)胞進(jìn)行洗滌，在加入蒸儲水和甲苯使紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白后，將混合液靜置一段時間 后分層獲得血紅蛋白溶液 B.將血紅蛋白溶液裝入透析袋中透析，可達(dá)到粗分離的目的 C利用凝膠色譜操作對血紅蛋白進(jìn)行純化 D.使用SDS 一聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行純度鑒定，以獲得純度很高的血紅蛋白 9 . 2019年1月10 0,施一公教授研究團(tuán)隊在《科學(xué)》上報道了人源Y-分泌酶結(jié)合淀粉樣前體蛋白（APP） 的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，揭示了結(jié)合底物后廣分泌酶發(fā)生的構(gòu)象變化，并對這些構(gòu)象變化的

18、功能進(jìn)行 了生化研究，從而為研究與癌癥以及阿爾茲海默癥相關(guān)的特異性藥物設(shè)計提供了重要的結(jié)構(gòu)信息?；卮?下列問題： （】）該項研究進(jìn)行時，需控制溫度、酸堿度等條件，因為高溫、過酸、過堿會使「分泌酶的 一遭到破壞，失去活性。 （2）根據(jù)蛋白質(zhì)的各種特性，如蛋白質(zhì)分子的、所帶電荷的、以及溶解度、 吸附性、對其他分子親和力等，可用來分離不同種類蛋白質(zhì)，從而得到上分泌酶口 (3) y-分泌酶由4個跨膜蛋白亞基組成,分別為PSI、Pen-2> Aph-1和Nicastrin0若對y-分泌酶4個跨 膜蛋白亞基進(jìn)行分離、純化及分子量測定，需采用 及電泳技術(shù)。前者是根據(jù)相對分 子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)

19、的有效方法，相對分子質(zhì)量較(填“大”或“小”)的跨膜蛋白移 動速度較慢口 (4)電泳是指 在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。對『分泌酶的4個跨膜蛋白亞基進(jìn)行分 子量測定時，通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法,該方法測定的結(jié)果只是 的分子量。該電泳遷移率完全取決于相對分子量的大小，原因是—― 一 ― 10.紅細(xì)胞內(nèi)含有大量血紅蛋白，我們可以選用豬、牛、羊或其他哺乳動物的血液進(jìn)行實驗，來提取和分 離血紅蛋白口請回答下列有關(guān)問題： (1)血紅蛋白的提取和分離一般可分為四步：、粗分離、純化和. (2)實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行處理，離心

20、后，收集血紅蛋白溶液。以上所述的過程即是樣品處理，它包括紅細(xì)胞的洗滌、: (3)收集的血紅蛋白溶液要進(jìn)行粗分離，其方法是。然后通過 將樣品進(jìn)一步純化, 最后經(jīng) 迸行純度鑒定. (4)如圖是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品加入和洗脫示意圖.請據(jù)圖回答下列問題. ①在加樣品示意圖中，正確的順序是 0 ②用吸管加樣品時，應(yīng)注意正確操作，分別是 ⑶待 時,才加入緩沖溶液。 ④待 ^接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每 mL收集一管，連續(xù)收集。 般/考答案. L【答案】B 【解析】凝膠電泳法的原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量，形狀和大小不同，在電場中受到的作用力 大小、方向、阻

21、力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。蛋白質(zhì)在凝膠電泳中運 動速度曖到蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小的影響，與蛋白質(zhì)分子的密度無關(guān)，故B正確中 2 .【答案】A 【解析】A,洗滌紅細(xì)胞時，采用低速短時間離心法，否則達(dá)不到離心的效果，A正確；B,洗滌紅細(xì)胞 的出的是去除雜蛋白，B錯誤；C、洗滌過程中要用0.9%的生理鹽水，C錯誤；D、透析的目的是去除樣 品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，D錯誤? 3 .【答案】D 【解析】血紅蛋白的提取實驗中，對樣品的處理過程分為紅細(xì)胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋 白溶液和透析，A正確：洗滌血紅蛋白的目的是去除一些雜蛋白,所用試劑為

22、生理鹽水，B正確；凝膠 電譜法分離血紅蛋白時相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)通過色譜柱的速度快，因為分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)會進(jìn) 入凝膠顆粒內(nèi)，因此，路徑較長，運行速度慢，而分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)則通過的路徑短，運行速度快， 故C正確；將樣品加入色譜柱頂端時，下端的流出口應(yīng)處于關(guān)閉狀態(tài)，加樣完之后才打開下端出口，是 樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口，然后再加入磷酸畿沖液進(jìn)行洗脫，待紅 色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集，故D錯誤。 4,【答案】B 【解析】紅細(xì)胞的洗滌效果與洗滌次數(shù)、離心速度和離心時間有關(guān)，A正確；凝膠柱中適量氣泡的存在 會攪亂洗

23、脫液中藪白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果，B錯誤；根據(jù)上述分析可知，凝膠色譜法是一種根 據(jù)相對分子質(zhì)量的大小來分離蛋白質(zhì)的方法，C正確；判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求可以采用電泳法， D正確口 5 .【答案】D 【解析】蛋白質(zhì)是生物大分子，不能通過半透膜，而其他小分子可以通過半透膜，可以利用半透膜進(jìn)行 分離得到蛋白質(zhì)，AB正確口分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)其離心速率不同，通過控制離心速率使分子大 小、密度不同的蛋白質(zhì)分離，C正確◎蛋白偵在電場中可以向與其自身所帶電荷電性相反的電極方向移 動，D錯。 【解析】相對分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程長，移動的速度慢，相對分子質(zhì)量大 的

24、蛋白質(zhì)不容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程短，移動的速度快，B正確。 7 .【答案】D 【解析】分離紅細(xì)胞應(yīng)采用低速短時間離心，防止白細(xì)胞與紅細(xì)胞一同沉淀，A錯誤；紅細(xì)胞釋放血紅 蛋白，需加入蒸值水和40%體積的甲苯，再在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0 min, B錯誤；分離血紅蛋白要 高速長時間離心，C錯誤；透析時要用20 mmol/L的磷酸緩沖液，透析12 h, D正確。 8 .【答案】A 【解析】對樣品進(jìn)行處理時，應(yīng)先通過低速短時間離心的方法對紅細(xì)胞進(jìn)行洗滌，再加入蒸儲水和甲苯 使紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白后，將混合液置于離心管中，以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后分層獲 得血紅

25、蛋白溶液，A項錯誤；將血紅蛋白溶液裝入透析袋中，再將透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量 濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中（pH為7.0）,透析12 h,可達(dá)到粗分離的目的，B項正確；可利用 凝膠色譜操作對血紅蛋白進(jìn)行純化，C項正確；使用SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行純度鑒定，以獲 得純度很高的血紅蛋白，D項正確。 9 .【答案】（I）空間結(jié)構(gòu) （2）形狀和大小 性質(zhì)和多少 （3）凝膠色譜 小 （4）帶電粒子 單條肽鏈 SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋 了不同蛋白質(zhì)間的電荷差別 【解析】（1）酶需要適宜的溫度和pH,高溫、過酸、過堿會使Y-分泌

26、酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，失去 活性。（2）根據(jù)蛋白質(zhì)的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、以及溶解度、吸附性、對其他分子親 和力等，可用來分離不同種類蛋白質(zhì)，從而得到Y(jié)-分泌酶。（3）可以用凝膠色譜法和電泳技術(shù)對Y- 分泌酶4個跨膜蛋白亞基進(jìn)行分離、純化及分子量測定。凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋 白質(zhì)的有效方法，相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)行凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外移動，路程較短， 移動速度較快。相對分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠內(nèi)部，經(jīng)過的路程較長，移動速度較慢。（4）電泳 是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。對Y-分泌酶的4個跨膜蛋白亞基進(jìn)行分子量測定時， 通常采用SDS-聚

27、丙烯酰胺凝膠電泳的方法，SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù) 合體在SDS的作用下會分解成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS所帶負(fù)電荷的量 大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間的電荷差別，故該電泳遷移率完全取決 于相對分子量的大小。 （2）血紅蛋白的釋放 分離血紅蛋白溶液 （3）透析 凝膠色譜法 SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳 （4）①④t①t②一③ ②不能破壞凝膠面貼著管壁加樣使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動③ 樣品完全進(jìn)入凝膠層 ③紅色的蛋白質(zhì) 5 【解析】（1）血紅蛋白的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。（2）樣 品處理包括紅細(xì)胞洗滌、血紅蛋白釋放、分離血紅蛋白溶液和透析四步。（3）收集的血紅蛋白溶液要 通過透析的方法進(jìn)行粗分離：樣品的純化是通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，最后 經(jīng)SDS—聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。（4）①加樣和洗脫的具體過程為:調(diào)節(jié)緩沖液面一加入蛋 白質(zhì)樣品一調(diào)節(jié)緩沖液面一洗脫一收集分裝蛋白質(zhì)，因此正確的如樣順序是④一①t■②—③。②用吸 管加樣時，應(yīng)注意的正確操作，分別是：使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動；貼著管壁加樣；不要破壞凝膠 面。③待樣品完全進(jìn)入凝膠層時，才加入緩沖溶液。④待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收 集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。