《生物藥物分析與檢測(cè) 高效液相色譜法》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《生物藥物分析與檢測(cè) 高效液相色譜法（236頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、會(huì)計(jì)學(xué)1生物藥物分析與檢測(cè)生物藥物分析與檢測(cè) 高效液相色譜法高效液相色譜法2022-5-3第一節(jié)第一節(jié) 概述概述第二節(jié)第二節(jié) 基本理論基本理論第三節(jié)第三節(jié) 高效液相色譜的定性和定量分高效液相色譜的定性和定量分析析第四節(jié)第四節(jié) 實(shí)際操作中的問(wèn)題實(shí)際操作中的問(wèn)題第五節(jié)第五節(jié) 在藥物分析中的應(yīng)用在藥物分析中的應(yīng)用第1頁(yè)/共236頁(yè)第2頁(yè)/共236頁(yè)2022-5-3Tswett實(shí)驗(yàn)第3頁(yè)/共236頁(yè)2022-5-3Tswett實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)第4頁(yè)/共236頁(yè)2022-5-3第5頁(yè)/共236頁(yè)2022-5-3Tswett實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)第6頁(yè)/共236頁(yè)2022-5-3柱層析第7頁(yè)/共236頁(yè)高效液相色譜法高效液相色

2、譜法（ high performance liquid chromatography；HPLC）是在）是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，引入了氣相經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論與高壓技術(shù)，以色譜的理論與高壓技術(shù)，以高壓輸送流高壓輸送流動(dòng)相動(dòng)相，采用，采用高效固定相高效固定相及及高靈敏度檢測(cè)高靈敏度檢測(cè)器器，發(fā)展而成的現(xiàn)代液相色譜，發(fā)展而成的現(xiàn)代液相色譜分離分析分離分析方法。方法。第8頁(yè)/共236頁(yè)概述概述 高效液相色譜高效液相色譜(HPLC)是以是以溶劑液體為流動(dòng)相溶劑液體為流動(dòng)相的色譜方法。的色譜方法。 早期液相色譜，包括早期液相色譜，包括Tswett的工作，都是在直徑的工作，都是在

3、直徑1-5cm, 長(zhǎng)長(zhǎng)50-500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的固的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在定相顆粒直徑多在150-200 m范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低低(流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性正相分配色譜正相分配色譜（正相柱）（正相柱）組分極性越大，保留組分極性越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)；使用極性時(shí)間越長(zhǎng)；使用極性化合物的分離?；衔锏姆蛛x。反相分配色譜反相分配色譜（反相柱）（反相柱）固定相極性固定相極性流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性組分極性越小，保留組分極性越小，保留時(shí)間越長(zhǎng)；適用非極時(shí)間越長(zhǎng)；適用非極性化合物的分離。性化合物的分離。第

4、70頁(yè)/共236頁(yè)n將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體的將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體的表面，而構(gòu)成表面，而構(gòu)成化學(xué)鍵合相化學(xué)鍵合相。n以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為稱為化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱鍵鍵合相色譜法合相色譜法（BPC）。）。正相正相鍵合相鍵合相色譜色譜反相反相鍵合相鍵合相色譜色譜分類三、化學(xué)鍵合相色譜三、化學(xué)鍵合相色譜第71頁(yè)/共236頁(yè) 固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因此于可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因此它適用于種類繁多樣品的分離。它適用于種類繁多樣品的分離

5、。特點(diǎn)特點(diǎn) 將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。（擔(dān)體）表面的游離羥基上。第72頁(yè)/共236頁(yè)1. 鍵合固定相制備鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相鍵合相硅膠硅膠十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非極性非極性硅烷化反應(yīng)硅烷化反應(yīng)使用使用pH范圍：范圍： 2-8第73頁(yè)/共236頁(yè)2. 鍵合固定相類型鍵合固定相類型類類型型反相柱反相柱正相柱正相柱氨丙基氨丙基氰乙基、醚和醇等氰乙基、醚和醇等極性基團(tuán)極性基團(tuán)不同碳原子數(shù)的不同碳原子數(shù)的烷烴（烷烴（C8和和C18）、）、苯基等疏水基團(tuán)苯基等疏水基團(tuán)第74頁(yè)/共236頁(yè)保留時(shí)間：保留時(shí)間：例：以

6、例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇鍵合色譜柱、甲醇- -水為流動(dòng)相分離水為流動(dòng)相分離以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。COOHOHOHCOOHOHOHHO沒(méi)食子酸沒(méi)食子酸3,4-二羥基苯甲酸二羥基苯甲酸固定相固定相: 非極性非極性; 流動(dòng)相流動(dòng)相: 極性極性組分極性組分極性: 3,4-二羥基苯甲酸二羥基苯甲酸沒(méi)食子酸沒(méi)食子酸第75頁(yè)/共236頁(yè)例：正己烷例：正己烷 + 氯仿氯仿-甲醇，氯仿甲醇，氯仿-乙醇乙醇第76頁(yè)/共236頁(yè)第77頁(yè)/共236頁(yè)第78頁(yè)/共236頁(yè)第79頁(yè)/共236頁(yè)溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的子與極性溶劑分子間的

7、排排斥力斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生合相的烴基發(fā)生疏水締合疏水締合。不是溶質(zhì)分子與鍵合相間不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力，的色散力，第80頁(yè)/共236頁(yè)第81頁(yè)/共236頁(yè)6適用適用：非極性中等極性組分（非極性中等極性組分（HPLC80%問(wèn)題）問(wèn)題）第82頁(yè)/共236頁(yè)固定相極性小固定相極性小 如硅膠如硅膠-C18，硅膠硅膠-苯基；苯基； 流動(dòng)相極性大流動(dòng)相極性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液。水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液。 反相鍵合色譜法反相鍵合色譜法 分析對(duì)象分析對(duì)象 多用于多環(huán)芳烴多用于多環(huán)芳烴(PAHs)等低極性化合物分離；改變流等低極性化合物

8、分離；改變流動(dòng)相配比，動(dòng)相配比，也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離解的化合物，如有機(jī)解的化合物，如有機(jī)有機(jī)酸、有機(jī)酸、有有機(jī)機(jī)堿和酚堿和酚類類。 固定相極性固定相極性大大 硅膠硅膠-OH(或雙或雙-OH)，硅膠硅膠-CN 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性小小 烴類烴類+適量極性溶劑適量極性溶劑(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 正正相鍵合色譜法相鍵合色譜法 分析對(duì)象分析對(duì)象 多用于極性或中等極性化合物的分離。多用于極性或中等極性化合物的分離。還可用于分離還可用于分離異構(gòu)體、異構(gòu)體、極性不同的化合物以及不同類型的化合物。極性不同的化合物以及不同類型的化合物。 正相和

9、反相鍵合色譜法正相和反相鍵合色譜法 在在HPLC分析中，有時(shí)要在流動(dòng)相中加入適量的鹽分析中，有時(shí)要在流動(dòng)相中加入適量的鹽(碳酸銨、四烷基銨鹽碳酸銨、四烷基銨鹽)或酸，為什么？答：都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類是為了減少待測(cè)物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類待測(cè)物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。或酸，為什么？答：都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類是為了減少待測(cè)物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類待測(cè)物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。第83頁(yè)/共236頁(yè)固定相與流動(dòng)相固定相與流動(dòng)相反相反相HPLC 極性極性:固定相固定相 流動(dòng)相流動(dòng)相 固定相固定相 - 極性強(qiáng)極性強(qiáng) 流動(dòng)相流

10、動(dòng)相(己烷己烷, 庚烷庚烷)- 極性弱極性弱 極性物質(zhì)后出峰極性物質(zhì)后出峰正相色譜正相色譜 20%反相色譜反相色譜80%正相色譜正相色譜 20%反相色譜反相色譜80%與固定相與固定相極性相近極性相近tR長(zhǎng)長(zhǎng)主流第85頁(yè)/共49頁(yè)第84頁(yè)/共236頁(yè)流動(dòng)相流動(dòng)相( (反相反相) )常用溶劑：乙腈、甲醇、水等乙腈、甲醇、水等實(shí)際使用：甲醇甲醇- -水水/ /乙腈乙腈- -水混合體系水混合體系等度洗脫：流動(dòng)相比例恒定流動(dòng)相比例恒定梯度洗脫：逐步提高有機(jī)溶劑比例逐步提高有機(jī)溶劑比例第86頁(yè)/共49頁(yè)第85頁(yè)/共236頁(yè)正相色譜正相色譜低極性流動(dòng)相低極性流動(dòng)相反相色譜反相色譜高極性流動(dòng)相高極性流動(dòng)相中等

11、極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測(cè)物極性：待測(cè)物極性：ABC正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系第86頁(yè)/共236頁(yè)四、離子交換色譜四、離子交換色譜固定相固定相：陰離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。：陰離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。陽(yáng)離子：陽(yáng)離子：SO3H(強(qiáng)強(qiáng))CO2H(弱弱)陰離子：陰離子：N+R3(強(qiáng)強(qiáng))NH2 (弱弱)擔(dān)擔(dān)體體苯乙烯苯乙烯-二二乙烯苯共乙烯苯共聚物微球聚物微球鍵合基團(tuán)鍵合基團(tuán)鍵合鍵合第87頁(yè)/共236頁(yè)流動(dòng)相流動(dòng)相：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂固定相，采用酸性水溶液；陽(yáng)離子交換樹(shù)脂固定相，采用酸性水溶液

12、；陰離子交換樹(shù)脂固定相，采用堿性水溶液。陰離子交換樹(shù)脂固定相，采用堿性水溶液?；驹恚夯驹恚?試樣組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反試樣組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)，依據(jù)組分與離子交換劑之間親和力的不同而應(yīng)，依據(jù)組分與離子交換劑之間親和力的不同而分離。分離。第88頁(yè)/共236頁(yè)陽(yáng)離子交換：陽(yáng)離子交換：RSO3H + M+ = RSO3 M + H+ 陰離子交換：陰離子交換：RNR4OH + X- = RNR4 X + OH-一般形式：一般形式： RA + B = RB + A 試樣組分與交換基試樣組分與交換基團(tuán)間的作用力的大小決團(tuán)間的作用力的大小決定色譜的保留行為。定色譜的保留行

13、為。第89頁(yè)/共236頁(yè)陽(yáng)離子交換：陽(yáng)離子交換：RSO3H + M+ = RSO3 M + H+ 陰離子交換：陰離子交換：RNR4OH + X- = RNR4 X + OH- 組分與離子交換劑之間作用力的大小與組分與離子交換劑之間作用力的大小與離子半離子半徑、電荷、存在形式徑、電荷、存在形式等有關(guān)。作用大，保留時(shí)間長(zhǎng)等有關(guān)。作用大，保留時(shí)間長(zhǎng)。應(yīng)用：應(yīng)用：離子及可離解的化合物，離子及可離解的化合物， 氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等。氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等。第90頁(yè)/共236頁(yè)五、離子對(duì)色譜五、離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜: 用正向或反向色譜柱分離離子和中性用正向或反向色譜柱分離離子和中性化合物混合物

14、的方法。化合物混合物的方法。 離子對(duì)：離子對(duì)：兩個(gè)相反電荷的離子相互作用形成一個(gè)中兩個(gè)相反電荷的離子相互作用形成一個(gè)中 性化合物。性化合物。第91頁(yè)/共236頁(yè)原理原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相（固定相）中使其與（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相（固定相）中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配。兩相之間進(jìn)行分配。第92頁(yè)/共236頁(yè) 由于待測(cè)離子的性質(zhì)不同，與對(duì)離子形成離子由于待測(cè)離子的性質(zhì)不同，與對(duì)離子形成離子對(duì)的能力不同，形成的離子對(duì)的

15、疏水能力不同，在對(duì)的能力不同，形成的離子對(duì)的疏水能力不同，在兩相間的分配系數(shù)不同，從而實(shí)現(xiàn)色譜分離。兩相間的分配系數(shù)不同，從而實(shí)現(xiàn)色譜分離。陰離子分離陰離子分離：烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化：烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子。十六烷基三甲銨作為對(duì)離子。陽(yáng)離子分離陽(yáng)離子分離：烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子：烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子。第93頁(yè)/共236頁(yè)六、空間排阻色譜六、空間排阻色譜-凝膠色譜凝膠色譜 原理：原理：利用凝膠中孔徑大小的不同，按分利用凝膠中孔徑大小的不同，按分子大小分離。子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，

16、由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 快速分離不同分子量混合物的色譜方法?？焖俜蛛x不同分子量混合物的色譜方法。 第94頁(yè)/共236頁(yè)相對(duì)分子質(zhì)量差別相對(duì)分子質(zhì)量差別大于大于10的化合物的化合物才可以分離才可以分離排阻色譜分離示意圖排阻色譜分離示意圖第95頁(yè)/共236頁(yè)七、親和色譜七、親和色譜 原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特性親和力，進(jìn)行選擇性分離

17、的一種色譜方法。種特性親和力，進(jìn)行選擇性分離的一種色譜方法。具有反應(yīng)具有反應(yīng)活性的連活性的連接鏈（環(huán)接鏈（環(huán)氧、聯(lián)胺氧、聯(lián)胺等）等） 酶、酶、抗原等抗原等第96頁(yè)/共236頁(yè)（一）色譜流出曲線色譜圖（chromatogram）是樣品被流動(dòng)相沖洗，通過(guò)色譜柱，流經(jīng)檢測(cè)器，所形成的濃是樣品被流動(dòng)相沖洗，通過(guò)色譜柱，流經(jīng)檢測(cè)器，所形成的濃度信號(hào)隨洗脫時(shí)間變化而形成的曲線稱為色譜流出曲線度信號(hào)隨洗脫時(shí)間變化而形成的曲線稱為色譜流出曲線(簡(jiǎn)稱流出曲線簡(jiǎn)稱流出曲線)，即濃度，即濃度時(shí)間曲線。時(shí)間曲線。動(dòng)畫(huà)動(dòng)畫(huà)第97頁(yè)/共236頁(yè)第98頁(yè)/共236頁(yè)第99頁(yè)/共236頁(yè)第100頁(yè)/共236頁(yè)第101頁(yè)/共2

18、36頁(yè)第102頁(yè)/共236頁(yè)第103頁(yè)/共236頁(yè)Fc：載氣流速（載氣流速（mL/min)第104頁(yè)/共236頁(yè)第105頁(yè)/共236頁(yè)第106頁(yè)/共236頁(yè) ) (Rt )(MRtttR第107頁(yè)/共236頁(yè)0MFtVM第108頁(yè)/共236頁(yè)0RFtVR第109頁(yè)/共236頁(yè)RV0RFtVR第110頁(yè)/共236頁(yè)式中式中 t tR2R2 組份組份2 2的調(diào)整保留時(shí)間的調(diào)整保留時(shí)間; ; t t R1R1 組份組份1 1的調(diào)整保留時(shí)間。的調(diào)整保留時(shí)間。它與流動(dòng)相的流速和色譜柱的物理指標(biāo)無(wú)關(guān)；僅與柱它與流動(dòng)相的流速和色譜柱的物理指標(biāo)無(wú)關(guān)；僅與柱溫和固定相的性質(zhì)有關(guān)溫和固定相的性質(zhì)有關(guān)第111頁(yè)/共

19、236頁(yè))lglglglg(100,)(,)(,)(,)(ZRnZRzRXRttttnZ第112頁(yè)/共236頁(yè))lglglglg()()()()()()()(ZttttItttZRZRZRXRXZRXRZR11100第113頁(yè)/共236頁(yè)第114頁(yè)/共236頁(yè)第115頁(yè)/共236頁(yè) 用來(lái)衡量色譜峰寬度的參用來(lái)衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：數(shù)，有三種表示方法：（1 1）標(biāo)準(zhǔn)偏差）標(biāo)準(zhǔn)偏差( ( ) )：即即0.6070.607倍倍峰高處色譜峰寬度的一半。峰高處色譜峰寬度的一半。（2 2）半峰寬）半峰寬( (WW1/21/2) )：色譜峰高色譜峰高一半處的寬度一半處的寬度 WW1/21/2

20、 =2.354 =2.354 （3 3）峰底寬）峰底寬( (WW) )：WW=4 =4 三三 、柱效參數(shù)、柱效參數(shù)第116頁(yè)/共236頁(yè)第117頁(yè)/共236頁(yè)Ms ccK 組分在流動(dòng)相中的濃度組分在流動(dòng)相中的濃度組分在固定相中的濃度組分在固定相中的濃度第三節(jié)第三節(jié) 色譜法基本原理色譜法基本原理一、分配系數(shù)和分配比：相平衡參數(shù)，是用來(lái)描述色譜一、分配系數(shù)和分配比：相平衡參數(shù)，是用來(lái)描述色譜過(guò)程中，樣品組分在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相中的分配情況過(guò)程中，樣品組分在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相中的分配情況動(dòng)畫(huà)動(dòng)畫(huà)第118頁(yè)/共236頁(yè) 一定溫度下，組分的分配系數(shù)一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；試樣

21、一定時(shí)，試樣一定時(shí)，K主要取決于固定相性質(zhì)；主要取決于固定相性質(zhì)；選擇適宜的固定相可改善分離效果；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；值是分離的基礎(chǔ)；某組分的某組分的K = 0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。同一條件下，若兩組分的同一條件下，若兩組分的K值相等，則色譜峰重合，值相等，則色譜峰重合，差別越大，色譜峰的距離越大差別越大，色譜峰的距離越大 組分在流動(dòng)相中的濃度組分在流動(dòng)相中的濃度組分在固定相中的濃度組分在固定相中的濃度 K第119頁(yè)/共236頁(yè) 在實(shí)際工作中，也常用分配比來(lái)表征色譜分配平在實(shí)

22、際工作中，也常用分配比來(lái)表征色譜分配平衡過(guò)程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩衡過(guò)程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比：相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比：Ms mmk 組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量組分在固定相中的質(zhì)量組分在固定相中的質(zhì)量 1. 分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。 2.分配系數(shù)決定于組分和兩相性質(zhì)分配系數(shù)決定于組分和兩相性質(zhì),與兩相體積無(wú)關(guān)與兩相體積無(wú)關(guān).而分配比與組分和兩相性質(zhì)有關(guān)而分配比與組分和兩

23、相性質(zhì)有關(guān),也兩相體積有關(guān)也兩相體積有關(guān) 3. 分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長(zhǎng)。分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長(zhǎng)。 分配比也稱：分配比也稱： 容量因子容量因子(capacity factor)；容量比容量比(capacity factor)；第120頁(yè)/共236頁(yè) 式中式中為相比。為相比。 填充柱相比：填充柱相比：535；毛細(xì)管柱的相比：；毛細(xì)管柱的相比：501500。VM為流動(dòng)相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；為流動(dòng)相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積； VS為固定相體積，對(duì)不同類型色譜

24、柱，為固定相體積，對(duì)不同類型色譜柱， VS的含義不同；的含義不同； 氣氣-液色譜柱：液色譜柱： VS為固定液體積；為固定液體積； 氣氣-固色譜柱：固色譜柱： VS為吸附劑表面容量；為吸附劑表面容量；KVVccVVmVVmmmkmSmsmmmSSSmS第121頁(yè)/共236頁(yè)tR = tM(1+k)tR=ktM第122頁(yè)/共236頁(yè)a a = t R（2）/ t R（1）= k2 /k1= K2 /K1第123頁(yè)/共236頁(yè)ABAB組分組分A、B在沿柱移動(dòng)時(shí)不同位置的濃度輪廓在沿柱移動(dòng)時(shí)不同位置的濃度輪廓濃濃度度1.兩組分的分配系數(shù)必須有差異兩組分的分配系數(shù)必須有差異2.區(qū)域?qū)挾鹊臄U(kuò)展速度應(yīng)小于區(qū)

25、域分離的速度區(qū)域?qū)挾鹊臄U(kuò)展速度應(yīng)小于區(qū)域分離的速度3.在保證快速分離的前提下，提供足夠長(zhǎng)的色譜柱在保證快速分離的前提下，提供足夠長(zhǎng)的色譜柱第124頁(yè)/共236頁(yè)第125頁(yè)/共236頁(yè)第126頁(yè)/共236頁(yè) 色譜理論需要解決的問(wèn)題：色譜分離過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。色譜理論需要解決的問(wèn)題：色譜分離過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間：色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素控制；組分保留時(shí)間：色譜過(guò)程

26、的熱力學(xué)因素控制； （組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜峰變寬：色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素控制；色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素控制； （兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散）（兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；第127頁(yè)/共236頁(yè) 塔板理論的假設(shè)：塔板理論的假設(shè)： (1) 在每一個(gè)平衡過(guò)程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到；在每一個(gè)平衡過(guò)程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到； (2) (2) 將載氣看作成脈動(dòng)（間歇）過(guò)程；將載氣看作成脈動(dòng)（間歇）過(guò)程； (3) (3) 試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略；試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略； (4) (4) 每

27、次分配的分配系數(shù)相同。每次分配的分配系數(shù)相同。（5 5）所有物質(zhì)在開(kāi)始時(shí)全部進(jìn)入零號(hào)塔板）所有物質(zhì)在開(kāi)始時(shí)全部進(jìn)入零號(hào)塔板 （1 1）. .塔板理論塔板理論（plate theory）半經(jīng)驗(yàn)理論；半經(jīng)驗(yàn)理論； 將色譜分離過(guò)程比擬作蒸餾過(guò)程，將連續(xù)的色譜分離過(guò)程分割成多次的平衡過(guò)程的重復(fù)將色譜分離過(guò)程比擬作蒸餾過(guò)程，將連續(xù)的色譜分離過(guò)程分割成多次的平衡過(guò)程的重復(fù) （類似于蒸餾塔塔板上的平衡過(guò)程）；（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過(guò)程）；第128頁(yè)/共236頁(yè)載氣體積 01234柱出口N=010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040

28、.0630.250.3750.1250.063050.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1160.2750.2750.11880.0040.0320.0860.1960.2750.13890.0020.0180.0590.1410.2460.138100.0010.1010.0380.1000.1890.118第129頁(yè)/共236頁(yè) 色譜柱長(zhǎng)：色譜柱長(zhǎng)：L， 虛擬的塔板間距離：虛擬的塔板間距離：H， 色譜柱的理論塔板數(shù)：色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：則三者的關(guān)系為： n =

29、L / H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：保留時(shí)間包含死時(shí)間，在死時(shí)間內(nèi)不參與分配保留時(shí)間包含死時(shí)間，在死時(shí)間內(nèi)不參與分配! !222/1)(16)(54. 5bRRWtWtn第130頁(yè)/共236頁(yè) 單位柱長(zhǎng)的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。單位柱長(zhǎng)的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。 用不同物質(zhì)計(jì)算可得到不同的理論塔板數(shù)。用不同物質(zhì)計(jì)算可得到不同的理論塔板數(shù)。 組分在組分在tM時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：有效有效有效nLHYtYtnRR222/1)(16)(54. 5222/1)(16)(5

30、4. 5YtYtnRR理第131頁(yè)/共236頁(yè)222/1)(16)(54. 5WtWtnRR2,22/1,)(16)(54. 5WtWtnRReff第132頁(yè)/共236頁(yè)222)(02Rttecc得出色譜流出曲線方程得出色譜流出曲線方程： C0:進(jìn)樣的濃度tR:保留時(shí)間:標(biāo)準(zhǔn)偏差第133頁(yè)/共236頁(yè)1 1 較好地解析了色譜曲線形狀較好地解析了色譜曲線形狀2 2 濃度極大點(diǎn)濃度極大點(diǎn)CmaxCmax的位置是的位置是t tR R ( (即即V VR R) )3 3 計(jì)算評(píng)價(jià)柱效計(jì)算評(píng)價(jià)柱效塔板理論成功之處塔板理論成功之處: :第134頁(yè)/共236頁(yè)第135頁(yè)/共236頁(yè) (1)當(dāng)色譜柱長(zhǎng)度一定時(shí)

31、，塔板數(shù)當(dāng)色譜柱長(zhǎng)度一定時(shí)，塔板數(shù) n 越大越大(塔板高度塔板高度 H 越小越小)，被測(cè)組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。，被測(cè)組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。 (2) (2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。 (3) (3)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K K相同時(shí)，無(wú)論該色譜柱的塔板數(shù)多大

32、，都無(wú)法分離。相同時(shí)，無(wú)論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無(wú)法分離。 (4) (4)塔板理論無(wú)法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無(wú)法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。塔板理論無(wú)法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無(wú)法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。第136頁(yè)/共236頁(yè)（一）（一）. . 范范. .弟姆特（弟姆特（Van DeemterVan Deemter）方程式方程式氣相色譜速率理論氣相色譜速率理論 H = A + B/u + Cu H：理論塔板高度，：理論塔板高度， u：載氣的線速度：載氣的線速度(cm/s) 減小減小A、B、C三項(xiàng)可提高柱效；三項(xiàng)

33、可提高柱效； 存在著最佳流速；存在著最佳流速； A、B、C三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？第137頁(yè)/共236頁(yè) A = 2dp dp：固定相的平均顆粒直徑固定相的平均顆粒直徑：固定相的填充不均勻因子固定相的填充不均勻因子 固定相顆粒越小固定相顆粒越小dp，填充的越均勻，填充的越均勻，A，H，柱效，柱效n。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。（動(dòng)畫(huà)）（動(dòng)畫(huà)）第138頁(yè)/共236頁(yè) B = 2 Dg ：彎曲因子，填充柱色譜，彎曲因子，填充柱色譜，11。 Dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（：試樣組分分子在氣相中

34、的擴(kuò)散系數(shù)（cm2s-1） (1) 存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散; (2) 擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H(n)，分離變差分離變差; (3) 分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速，滯留時(shí)間，滯留時(shí)間，擴(kuò)散，擴(kuò)散; (4) 擴(kuò)散系數(shù)：擴(kuò)散系數(shù)：Dg (M載氣載氣)-1/2 ； M載氣載氣，B值值。（動(dòng)畫(huà)）（動(dòng)畫(huà)）第139頁(yè)/共236頁(yè) k為容量因子；為容量因子； Dg 、DL為擴(kuò)散系數(shù)為擴(kuò)散系數(shù); dp：固定相的平均顆粒直徑固定相的平均顆粒直徑;df 液膜的厚度。液膜的厚度。 減小擔(dān)體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，降低固定相液膜厚度，可降低傳

35、質(zhì)阻力。減小擔(dān)體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，降低固定相液膜厚度，可降低傳質(zhì)阻力。 傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力和液相傳質(zhì)阻力CL即：即： C =（Cg + CL）gpgDdkkC22)1 (01. 0（動(dòng)畫(huà)）（動(dòng)畫(huà)）LfLDdkkC22)1 (32第140頁(yè)/共236頁(yè)A = 2dp 第141頁(yè)/共236頁(yè)載氣流速高時(shí)：載氣流速高時(shí)： 傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，流速流速 ，柱效，柱效 。載氣流速低時(shí)：載氣流速低時(shí)： 分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，流速流速 , ,柱效柱效 。H

36、- u曲線與最佳流速：曲線與最佳流速： 由于流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對(duì)柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。由于流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對(duì)柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。02CUBdUdHBCAH2minCBuopt/第142頁(yè)/共236頁(yè)(三）影響譜帶變寬的其它因素三）影響譜帶變寬的其它因素1、非線性分配色譜、非線性分配色譜2、載體表面活性吸附中心造成的拖尾峰、載體表面活性吸附中心造成的拖尾峰3、 柱外效應(yīng)柱外效應(yīng)第143頁(yè)/共236頁(yè)CSCM1、非線性分配色譜、非線性分

37、配色譜第144頁(yè)/共236頁(yè)CMCSCSCM非線性色譜。其具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：a、溶質(zhì)洗脫峰不再是對(duì)稱的正態(tài)分布，而是有“拖尾”或“伸舌”現(xiàn)象；b、樣品的保留值可變。線性色譜中同一樣品的保留值是常數(shù)，只隨樣品不同而變化；c、色譜峰的峰高與濃度不是線性關(guān)系。在線性色譜中峰高與組分是線性關(guān)系。峰高是定量分析的重要數(shù)據(jù)。在非線性色譜中，峰高增加的速率隨濃度的增加而逐漸降低，因而峰高不能作為定量分析的指標(biāo)。第145頁(yè)/共236頁(yè) (1) (1)組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散分子擴(kuò)散及及傳質(zhì)阻力傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平

38、衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。 (2)通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。 (3) (3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。 (4) 各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但

39、又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。第146頁(yè)/共236頁(yè)（二）（二）. . GiddingsGiddings方程式液相色譜速率理論方程式液相色譜速率理論液相色譜與氣相色譜的的主要區(qū)別在于液體和氣體性質(zhì)液相色譜與氣相色譜的的主要區(qū)別在于液體和氣體性質(zhì)的差異的差異第147頁(yè)/共236頁(yè)1958年，Giddings 和Snyder等提出液相色譜速率方程式：第148頁(yè)/共236頁(yè)uDCHm

40、md第149頁(yè)/共236頁(yè)uDdCHsfss2uDdCHmpmm2uDdCHmpmssm2第150頁(yè)/共236頁(yè)第151頁(yè)/共236頁(yè)第152頁(yè)/共236頁(yè)第153頁(yè)/共236頁(yè)第154頁(yè)/共236頁(yè)在高效液相色譜中, 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬(wàn)分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即： H = A +B/u+ C u 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。提高柱內(nèi)填料裝填的均勻性和降低粒度提高柱內(nèi)填料裝填的均勻性和降低粒度選用低粘度的流動(dòng)相或適當(dāng)提高柱溫選用低粘度的流動(dòng)相或適當(dāng)提高柱溫 第155頁(yè)/共236頁(yè)第156頁(yè)/共236頁(yè)第157頁(yè)/共236頁(yè) 塔板

41、理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對(duì)的實(shí)際分離程度。即柱效為多大時(shí)，相鄰兩組份能夠被完全分離。塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對(duì)的實(shí)際分離程度。即柱效為多大時(shí)，相鄰兩組份能夠被完全分離。 難分離物質(zhì)對(duì)的分離度大小受色譜過(guò)程中兩種因素的綜合影響：難分離物質(zhì)對(duì)的分離度大小受色譜過(guò)程中兩種因素的綜合影響：保留值之差保留值之差色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素；色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素； 區(qū)域?qū)挾葏^(qū)域?qū)挾壬V過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素。色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素。 色譜分離中的四種情況如圖所示：色譜分離中的四種情況如圖所示：第四節(jié) 分離度與基本色譜分離方程式第158頁(yè)/共236頁(yè) 色譜分離中的四種情況的討論：色譜分離中的四種情況

42、的討論： 柱效較高，柱效較高，K(分配系數(shù)分配系數(shù))較大較大,完全分離；完全分離； K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；柱效較低，柱效較低，K較大較大,但分離的不好；但分離的不好； K小，小，柱效低，分離效果更差。柱效低，分離效果更差。第159頁(yè)/共236頁(yè)R=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)：兩峰的分離程度可達(dá)89%；R=1：分離程度：分離程度98%；R=1.5：達(dá)：達(dá)99.7%（相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。（相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。21)1()2()(2WWttRRR第160頁(yè)/共236頁(yè)令令W2=W1=W（相鄰兩峰的峰底寬近似相等相鄰兩峰的

43、峰底寬近似相等），），引入相對(duì)保留值和塔板數(shù)，可導(dǎo)出下式：引入相對(duì)保留值和塔板數(shù)，可導(dǎo)出下式：akknR1141aa第161頁(yè)/共236頁(yè)1. 分離度與柱效的關(guān)系分離度與柱效的關(guān)系nR 因?yàn)?Rn所以HnLn1或已知RnHL，或所以nR 因?yàn)镠RLR1或2121221)(LLnnRR第162頁(yè)/共236頁(yè)2 分離度與容量比的關(guān)系（容量因子）分離度與容量比的關(guān)系（容量因子） kkR100RkRkkk，1，峰擴(kuò)張，的影響對(duì)時(shí)RtRk變慢時(shí)，Rkk10改變改變k 的方法的方法:改變柱溫和相比改變柱溫和相比第163頁(yè)/共236頁(yè)3 分離度與分離度與柱選擇性的關(guān)系（選擇因子）柱選擇性的關(guān)系（選擇因子）

44、aa1R因?yàn)镽，所以aaa1，無(wú)法分離01Ra的影響都很大微小變化對(duì)Ra一倍R2 . 11 . 1a增大增大的最有效方法是選擇合適的固定液。的最有效方法是選擇合適的固定液。第164頁(yè)/共236頁(yè)第165頁(yè)/共236頁(yè)221R16）（有效aan有效）（HL221R16aa已知任何兩項(xiàng)，可求第三項(xiàng)已知任何兩項(xiàng)，可求第三項(xiàng)4. 分離度、柱效和選擇性參數(shù)關(guān)系分離度、柱效和選擇性參數(shù)關(guān)系第166頁(yè)/共236頁(yè)有效n .)1(2kkn)1(41aa有效nR第167頁(yè)/共236頁(yè)第168頁(yè)/共236頁(yè)第169頁(yè)/共236頁(yè)2211-4nkkR第170頁(yè)/共236頁(yè)第171頁(yè)/共236頁(yè)2dp第172頁(yè)/共2

45、36頁(yè)的的1/105，故在液相色譜中，故在液相色譜中B可以可以忽略。忽略。第173頁(yè)/共236頁(yè) 3 傳質(zhì)阻抗傳質(zhì)阻抗 由三個(gè)系數(shù)組成： C Cs CmCsm Cs固定相傳質(zhì)阻抗 Cm流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗 Csm靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗 第174頁(yè)/共236頁(yè) GC中，固定液的傳質(zhì)阻抗起決定作用， CCs。而HPLC中， “固定液”是鍵合在載體表面固定液官能團(tuán)的單分子層，厚度df可以忽略。因此，Cs可以忽略。sfssDdC2（1）固定相傳質(zhì)阻抗第175頁(yè)/共236頁(yè)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Cm Cm與固定相顆粒粒度dp得平方成正比，與組分分子在流動(dòng)相中得擴(kuò)散系數(shù)成反比。m是由柱和填充的性質(zhì)決定的因子是由柱和填充的性

46、質(zhì)決定的因子第176頁(yè)/共236頁(yè)（3）靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Csm 由于固定相的多孔性，使部分流動(dòng)相滯留在固定相微孔內(nèi)。流動(dòng)相要與固定相進(jìn)行質(zhì)量交換，必須先擴(kuò)散到微孔內(nèi)。如果固定相的微孔多，且又深又小，傳質(zhì)阻抗就大，使峰展寬就嚴(yán)重。 Csm固定相顆粒粒度dp得平方成正比，與組分分子在流動(dòng)相中得擴(kuò)散系數(shù)成反比。 sm與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。及容量因子有關(guān)。第177頁(yè)/共236頁(yè)第178頁(yè)/共236頁(yè)第179頁(yè)/共236頁(yè)第180頁(yè)/共236頁(yè)（NH3）、緩沖液（磷酸鹽、）、緩沖液（磷酸鹽、醋酸鹽）醋酸鹽）第181頁(yè)/共236頁(yè)第182

47、頁(yè)/共236頁(yè)第四節(jié)第四節(jié) 高效液相色譜分析方法高效液相色譜分析方法一、定性分析方法一、定性分析方法 HPLC的定性方法與的定性方法與GC相似，可分為色譜相似，可分為色譜鑒定法及非色譜鑒定法兩類。鑒定法及非色譜鑒定法兩類。 1色譜鑒定法色譜鑒定法 保留時(shí)間或相對(duì)保留時(shí)間保留時(shí)間或相對(duì)保留時(shí)間對(duì)照。對(duì)照。 2化學(xué)鑒定法化學(xué)鑒定法 分離后收集組分定性。分離后收集組分定性。 第183頁(yè)/共236頁(yè)3 3兩譜聯(lián)用鑒定法兩譜聯(lián)用鑒定法 （1 1）兩譜聯(lián)用法：）兩譜聯(lián)用法：用用 HPLCHPLC制備純組分，制備純組分，用光譜儀器鑒定。用光譜儀器鑒定。 （2 2）兩譜聯(lián)用儀：）兩譜聯(lián)用儀：能同時(shí)獲得定性、定

48、能同時(shí)獲得定性、定量信息。如量信息。如HPLCHPLCUVUV、HPLCHPLCFTIRFTIR及及 HPLCHPLCMSMS等。等。 第184頁(yè)/共236頁(yè) 二、定量分析方法二、定量分析方法 液相色譜法的定量方法與氣相色譜法相液相色譜法的定量方法與氣相色譜法相同，常用外標(biāo)法及內(nèi)標(biāo)對(duì)比法等進(jìn)行定量分同，常用外標(biāo)法及內(nèi)標(biāo)對(duì)比法等進(jìn)行定量分析。析。1 1外標(biāo)法外標(biāo)法 以待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，以待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，對(duì)比求算試樣含量的方法稱為外標(biāo)法。對(duì)比求算試樣含量的方法稱為外標(biāo)法。 可分為外標(biāo)工作曲線法、外標(biāo)一點(diǎn)法及可分為外標(biāo)工作曲線法、外標(biāo)一點(diǎn)法及外標(biāo)二點(diǎn)法等。外標(biāo)二點(diǎn)法等。2 2內(nèi)標(biāo)法

49、內(nèi)標(biāo)法 分為工作曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法、分為工作曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法、內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法、內(nèi)標(biāo)對(duì)比法及校正因子法等，內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法、內(nèi)標(biāo)對(duì)比法及校正因子法等，在在HPLCHPLC中最常用內(nèi)標(biāo)對(duì)比法。中最常用內(nèi)標(biāo)對(duì)比法。 第185頁(yè)/共236頁(yè)1 1、相對(duì)分子量、相對(duì)分子量分子量分子量20002000，凝膠色譜柱，凝膠色譜柱分子量分子量20002000，但同時(shí)分子量相差，但同時(shí)分子量相差10%10%，凝膠色譜柱凝膠色譜柱分子量分子量20002000的水溶性電解質(zhì)，酸性物質(zhì)用的水溶性電解質(zhì)，酸性物質(zhì)用陰離子交換樹(shù)脂，堿性物質(zhì)用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂陰離子交換樹(shù)脂，堿性物質(zhì)用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂第186頁(yè)/共236頁(yè)分子量分子量2

50、0002000的水溶性非電解質(zhì)，選用反相的水溶性非電解質(zhì)，選用反相色譜法色譜法分子量分子量20002000的非水溶性物質(zhì)，弱極性物質(zhì)的非水溶性物質(zhì)，弱極性物質(zhì)選用反相色譜法，極性物質(zhì)選用正相色譜法。選用反相色譜法，極性物質(zhì)選用正相色譜法。第187頁(yè)/共236頁(yè)2 2、溶解度、溶解度第188頁(yè)/共236頁(yè)3 3、化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)結(jié)構(gòu)第189頁(yè)/共236頁(yè)極性增加極性增加不溶于水不溶于水溶于水溶于水非極性非極性離子離子非離子極性非離子極性吸附吸附反向分配反向分配分配分配正向分配正向分配離子交換離子交換尺寸排阻尺寸排阻凝膠滲透凝膠滲透凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾分分子子量量第190頁(yè)/共236頁(yè)192第191頁(yè)/

51、共236頁(yè)193第192頁(yè)/共236頁(yè)194第193頁(yè)/共236頁(yè)195第194頁(yè)/共236頁(yè)1964. 六通閥的使用第195頁(yè)/共236頁(yè)197第196頁(yè)/共236頁(yè)198第197頁(yè)/共236頁(yè)199第198頁(yè)/共236頁(yè)200第199頁(yè)/共236頁(yè)201樣品溶劑對(duì)分離結(jié)果的影響樣品溶劑對(duì)分離結(jié)果的影響第200頁(yè)/共236頁(yè)202柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)；當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動(dòng)相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測(cè)定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)清洗柱；

52、若分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；第201頁(yè)/共236頁(yè)優(yōu)良的常規(guī)操作優(yōu)良的常規(guī)操作第202頁(yè)/共236頁(yè) 預(yù)先稀釋預(yù)先稀釋使用流動(dòng)相溶解樣品使用流動(dòng)相溶解樣品 - 減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)尤為重要減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)尤為重要 - 保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀尤其在柱中產(chǎn)生沉淀樣品瓶進(jìn)樣前準(zhǔn)備進(jìn)樣前準(zhǔn)備0.45m 濾膜樣品過(guò)濾樣品過(guò)濾第203頁(yè)/共236頁(yè) ） 采用采用 “HPLCHPLC” 級(jí)溶劑。級(jí)溶劑。 對(duì)試樣有適宜的溶解度。對(duì)試樣有適宜的溶解度。 溶劑粘度要小與固定相

53、不發(fā)生化學(xué)溶劑粘度要小與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。反應(yīng)。 溶劑與檢測(cè)器相適應(yīng)。例如用溶劑與檢測(cè)器相適應(yīng)。例如用紫外檢測(cè)器時(shí)，選用溶劑的適宜波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器時(shí)，選用溶劑的適宜波長(zhǎng)應(yīng)在檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)。應(yīng)在檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)。第204頁(yè)/共236頁(yè)流動(dòng)相脫氣流動(dòng)相脫氣吹氦吹氦脫氣脫氣法法抽抽真空脫氣真空脫氣法法超聲波超聲波脫氣法脫氣法在線在線真空脫氣真空脫氣法法第205頁(yè)/共236頁(yè)溶劑吸濾頭的清洗溶劑吸濾頭的清洗1.取下吸濾頭放在取下吸濾頭放在(1:4,V/V)的硝酸溶液燒杯中超聲清的硝酸溶液燒杯中超聲清洗洗15分鐘分鐘;2.取出后用蒸餾水超聲清洗取出后用蒸餾水超聲清洗10分鐘分鐘;3.用吸球吹出吸濾頭中的

54、液體用吸球吹出吸濾頭中的液體;4.再用蒸餾水超聲清洗再用蒸餾水超聲清洗10分鐘分鐘;5.用吸球吹凈吸濾頭中的水份用吸球吹凈吸濾頭中的水份;6.將吸濾頭重新插入管路并放入溶劑瓶中將吸濾頭重新插入管路并放入溶劑瓶中(正相系統(tǒng)注正相系統(tǒng)注意將吸濾頭烘干意將吸濾頭烘干)流程第206頁(yè)/共236頁(yè)5 5重新連接色譜柱，設(shè)定適當(dāng)流速，當(dāng)流動(dòng)相流出約重新連接色譜柱，設(shè)定適當(dāng)流速，當(dāng)流動(dòng)相流出約3030倍于倍于色譜柱體積，并且檢測(cè)器基線平衡后，流動(dòng)相更換完畢色譜柱體積，并且檢測(cè)器基線平衡后，流動(dòng)相更換完畢1 1將新流動(dòng)相置于儲(chǔ)液瓶中將新流動(dòng)相置于儲(chǔ)液瓶中( (已過(guò)濾和超聲處理的已過(guò)濾和超聲處理的) ) 2 2

55、打開(kāi)排空閥，啟動(dòng)泵打開(kāi)排空閥，啟動(dòng)泵, ,使新的流動(dòng)相使新的流動(dòng)相從排空閥出口流出從排空閥出口流出20ml20ml左右左右3 3關(guān)閉排空閥，然后將進(jìn)樣閥與色譜柱相連接端關(guān)閉排空閥，然后將進(jìn)樣閥與色譜柱相連接端卸開(kāi)，用小容器放置于進(jìn)樣閥的出口處卸開(kāi)，用小容器放置于進(jìn)樣閥的出口處4 4啟動(dòng)恒流泵，讓流動(dòng)相從進(jìn)樣閥出口流出啟動(dòng)恒流泵，讓流動(dòng)相從進(jìn)樣閥出口流出10ml10ml左右左右第207頁(yè)/共236頁(yè)n的最高壓力的最高壓力n流動(dòng)相應(yīng)先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生流動(dòng)相應(yīng)先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性氣泡，影響流量的穩(wěn)定性和分析結(jié)和分析結(jié)果。果。第208頁(yè)/共236頁(yè)色譜色譜柱的保柱的保養(yǎng)養(yǎng)8

56、945612370 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx000 0000 0LC-10AD :輸液時(shí)不要打開(kāi)排液閥輸液時(shí)不要打開(kāi)排液閥瞬間壓力劇烈變化瞬間壓力劇烈變化第209頁(yè)/共236頁(yè)第210頁(yè)/共236頁(yè)峰形展寬峰形展寬“鬼峰鬼峰”脫尾峰脫尾峰雙重峰或雙重峰或分叉峰分叉峰第211頁(yè)/共236頁(yè)四、四、HPLC常見(jiàn)故障與維護(hù)常見(jiàn)故障與維護(hù)1 1、HPLCHPLC對(duì)流動(dòng)相的一般要求對(duì)流動(dòng)相的一般要求第213頁(yè)/共49頁(yè)第212頁(yè)/共236頁(yè)第214頁(yè)/共49頁(yè)第213頁(yè)/共236頁(yè)第215頁(yè)/共49頁(yè)過(guò)濾器過(guò)濾器第214頁(yè)/共236頁(yè)第216頁(yè)/共49頁(yè)泵

57、的使用要點(diǎn)泵的使用要點(diǎn)第215頁(yè)/共236頁(yè)第217頁(yè)/共49頁(yè)第216頁(yè)/共236頁(yè)第218頁(yè)/共49頁(yè)第217頁(yè)/共236頁(yè)第219頁(yè)/共49頁(yè)第218頁(yè)/共236頁(yè)第220頁(yè)/共49頁(yè)第219頁(yè)/共236頁(yè)第221頁(yè)/共49頁(yè)第220頁(yè)/共236頁(yè)第222頁(yè)/共49頁(yè)自動(dòng)進(jìn)樣器常見(jiàn)故障自動(dòng)進(jìn)樣器常見(jiàn)故障第221頁(yè)/共236頁(yè)第223頁(yè)/共49頁(yè)第222頁(yè)/共236頁(yè)第224頁(yè)/共49頁(yè)DAD常見(jiàn)故障及原因常見(jiàn)故障及原因第223頁(yè)/共236頁(yè)2、HPLC日常維護(hù)日常維護(hù)第225頁(yè)/共49頁(yè)第224頁(yè)/共236頁(yè)第226頁(yè)/共49頁(yè)第225頁(yè)/共236頁(yè)第227頁(yè)/共49頁(yè)第226頁(yè)/共23

58、6頁(yè)第228頁(yè)/共49頁(yè)3、HPLC常見(jiàn)故障診斷常見(jiàn)故障診斷第227頁(yè)/共236頁(yè)第229頁(yè)/共49頁(yè)第228頁(yè)/共236頁(yè)第230頁(yè)/共49頁(yè)第229頁(yè)/共236頁(yè)第231頁(yè)/共49頁(yè)第230頁(yè)/共236頁(yè)第232頁(yè)/共49頁(yè)第231頁(yè)/共236頁(yè)第233頁(yè)/共49頁(yè)第232頁(yè)/共236頁(yè)HPLC在環(huán)保方面的應(yīng)用五、五、HPLC的應(yīng)用的應(yīng)用1、農(nóng)藥殘留量分析、農(nóng)藥殘留量分析 ：含氯農(nóng)藥：含氯農(nóng)藥 、有機(jī)磷、有機(jī)磷 農(nóng)農(nóng)藥藥 、除蟲(chóng)菊等、除蟲(chóng)菊等2、致癌物質(zhì)、致癌物質(zhì) ：硝基呋喃及其代謝物、霉素：硝基呋喃及其代謝物、霉素 、亞硝胺、苯并芘等、亞硝胺、苯并芘等3、水質(zhì)分析：內(nèi)分泌污染物等、水質(zhì)分

59、析：內(nèi)分泌污染物等4、其它、其它第234頁(yè)/共49頁(yè)第233頁(yè)/共236頁(yè)HPLC在生化方面的應(yīng)用在生化方面的應(yīng)用1、蛋白質(zhì)分析、蛋白質(zhì)分析2、肽類的分析、肽類的分析3、核酸、核酸4、氨基酸、氨基酸 5、其它、其它第235頁(yè)/共49頁(yè)第234頁(yè)/共236頁(yè)HPLC在醫(yī)藥方面的應(yīng)用在醫(yī)藥方面的應(yīng)用1、新藥研發(fā)：目標(biāo)物的檢測(cè)、純度等、新藥研發(fā)：目標(biāo)物的檢測(cè)、純度等2、藥品的預(yù)處理：片劑，油膏，水劑等、藥品的預(yù)處理：片劑，油膏，水劑等3、體液：血、尿、脊椎液、唾液等、體液：血、尿、脊椎液、唾液等4、抗菌素、抗菌素 ：青霉素：青霉素 、甾族、甾族(激素激素)等等 5、其它、其它第236頁(yè)/共49頁(yè)第235頁(yè)/共236頁(yè)