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1、word 生物化學 第一章 蛋白質(zhì)化學 第一節(jié) 蛋白質(zhì)的重要性 ü 蛋白質(zhì)是機體最豐富的有機分子，占人體重量的16~20%，占干重的45%，肺組織高達80%。 ü 蛋白質(zhì)的生物學功能：生物催化作用、調(diào)節(jié)作用〔激素，基因表達調(diào)控作用〕、免疫防御與保護作用〔細胞因子、補體、抗體〕、轉(zhuǎn)運和儲存作用〔轉(zhuǎn)運蛋白〕、結(jié)構(gòu)功能〔保護和維持細胞、組織、器官的正常生理形態(tài)，細胞骨架〕、運動與支撐作用、信息接收傳遞作用〔受體蛋白〕、生物膜功能 ü 蛋白質(zhì)組學：蛋白質(zhì)組指的是基因組編碼的全部蛋白質(zhì)，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)組學本質(zhì)上指的是在機體整體水平上系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)的

2、特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細胞代謝等過程的整體而全面的認識。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)的化學組成 ü 蛋白質(zhì)含氮量平均為16%，蛋白質(zhì)的含量=含氮量x6.25。 ü 天然存在的氨基酸約180種，組成蛋白質(zhì)的氨基酸只有20余種〔根本氨基酸〕。 ü 根本氨基酸的共同特點：①除脯氨酸為α-亞氨基酸外，其他組成蛋白質(zhì)的根本氨基酸均為α-氨基酸；②除甘氨酸外，其他氨基酸的α-碳原子為手性碳原子，且天然蛋白質(zhì)中根本氨基酸皆為L-型；③不同的氨基酸的R鏈不同，對蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有重要影響。 ü 20種常見氨基酸的名稱和結(jié)構(gòu)式

3、〔見書P11〕 ü 氨基酸的分類 非極性R基氨基酸：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸；極性不帶電R基氨基酸〔易溶于水〕：甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；帶負電的R基氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；帶正電的R基氨基酸：賴氨酸、組氨酸、精氨酸。 ü 氨基酸的物理性質(zhì)：①高熔點，200℃以上，以離子狀態(tài)存在；②一般均溶于水，溶于強酸、強堿；不溶于乙醚、氯仿等有機溶劑；③氨基酸一般有味；④除甘氨酸外均有旋光性。 ü 氨基酸的化學性質(zhì)：①兩性解離與等電點：pH高于等電點帶負電，低于等電點帶正電。等電點時主要以兩性離子存在，極少量以中性分子

4、存在。中性氨基酸的pI在微酸性圍，踐行氨基酸的pI在堿性圍，酸性氨基酸的pI在酸性圍。②紫外吸收性質(zhì)：色氨酸〔280nm〕、酪氨酸〔275nm〕和苯丙氨酸〔257nm〕含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)，具有紫外吸收特性。③茚三酮反響：與大多數(shù)α-氨基酸加熱反響產(chǎn)生藍紫色物質(zhì)，與脯氨酸、羥脯氨酸反響呈黃色，與天冬酰胺反響呈棕色；④α-羧基的反響：與堿、醇、硼氫化鋰反響；⑤R基的反響：Million反響〔Tyr-紅色〕、Folin反響〔Tyr-藍色〕、坂口反響〔Arg-紅色〕、Pauly反響〔His、Tyr-橘紅色〕、乙醛酸的反響〔Trp-紫紅色環(huán)〕。 ü 氨基酸的功能：①寡肽、多肽、蛋白質(zhì)的根本結(jié)構(gòu)單位；

5、②多種生物活性物質(zhì)的前體；③作為神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)營養(yǎng)素；④參與生物體的物質(zhì)代謝和能量代謝。 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) ü 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)包括：①組成蛋白質(zhì)的多肽鏈的數(shù)目；②多肽鏈的氨基酸順序；③多肽鏈或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。 ü 體多肽和蛋白質(zhì)生物合成時，均是從氨基端開始，延長到羧基端終止，因此N末端被定為多肽鏈的頭。 ü 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的概念：蛋白質(zhì)是由不同種類、數(shù)量和排列順序的氨基酸，通過肽鍵而構(gòu)成的高分子有機含氮化合物。它是蛋白質(zhì)作用的特異性、空間結(jié)構(gòu)的差異性和生物學功能多樣性的根底。 ü 活性多肽：谷胱甘肽GSH〔復(fù)原劑、與毒性藥物結(jié)合、維持紅細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、使巰基酶的活

6、性基團維持復(fù)原狀態(tài)〕、降鈣素基因相關(guān)肽〔舒血管作用，參與心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)〕、肽類激素、多肽類抗生素。 ü 蛋白質(zhì)的水解反響：①酸水解: 6M鹽酸或4M硫酸，回流20小時，完全水解；得到L-氨基酸，不引起消旋，色氨酸被破壞，酰胺被水解。②堿水解: 5M氫氧化鈉，回流10-20小時，完全水解；得到等摩爾D-氨基酸L-氨基酸，引起消旋；色氨酸穩(wěn)定。③酶水解: 不引起消旋，不破壞氨酸酸，但一種酶水解不徹底，需要幾種酶協(xié)同作用。 ü 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的原理與方法： 1) 氨基酸的組成分析：蛋白質(zhì)樣品的純化→多肽鏈數(shù)目的測定→氨基酸組成的分析。 2) N端氨基酸的分析：①二硝基氟苯法〔DNFB〕：

7、N末端氨基與DNFB反響，生成DNP多肽衍生物；用酸水解，所有肽鍵被水解生成相應(yīng)氨基酸和DNP-末端氨基酸。②二甲氨基萘磺酰氯法〔DNS-Cl〕：DNS-氨基酸有強烈熒光，靈敏度高。DNFB法和DNS法的不足之處是不能在同一個肽鏈上重復(fù)應(yīng)用。③Edman降解法〔PITC、PTH-氨基酸〕：可標記并僅水解釋放多肽鏈的N末端氨基酸殘基，留下其他氨基酸殘基的完整肽鏈。④氨肽酶法：肽鏈外切酶，從N端開始逐個切掉氨基酸。 3) C末端氨基酸的分析：①肼解法：多肽與無水肼加熱發(fā)生肼解，C末端氨基酸以自由形式釋出；②羧肽酶法：特異地從C末端依次將氨基酸水解下來，有A、B、C、Y四種。 4) 二硫鍵確實定

8、：快原子轟擊、等離子體解吸、電噴霧典禮等軟電離質(zhì)譜技術(shù)。 5) 大分子多肽氨基酸順序的測定：先將大分子多肽裂解為小的肽片，經(jīng)別離純化后，分別測定各肽片的順序。此法適用于無二硫鍵的單鏈多肽組成的蛋白質(zhì)。 6) 核酸推導(dǎo)法。 ü 蛋白質(zhì)的構(gòu)象：蛋白質(zhì)分子中原子和基團在三維空間上的排列、分布與其走向稱為蛋白質(zhì)的構(gòu)象，又稱蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)等。 ü 維持構(gòu)象的化學鍵〔次級鍵〕：氫鍵、疏水鍵、鹽鍵、配位鍵、二硫鍵、德華力。 ü 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)：是指多肽鏈的主鏈骨架中假如干肽單位，各自沿一定的軸盤旋或折疊，并以氫鍵為主要的次級鍵而形成有規(guī)如此的重復(fù)構(gòu)象。蛋白質(zhì)的二級

9、結(jié)構(gòu)僅限于主鏈原子的局部空間排列，不包括與肽鏈其他區(qū)段的相互關(guān)系與側(cè)鏈構(gòu)象。 ü 肽單位：肽鍵與相鄰兩個α碳原子所組成的基團，稱為肽單位或肽平面。肽單位具有以下特性：①肽鍵中的C-N鍵具有局部雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)；②肽單位上六個原子處于同一平面；③肽單位中與C-N相連的氫和氧原子與兩個α碳原子呈反向分布。多肽鏈的盤旋或折疊是由肽鏈中許多α-碳原子的旋轉(zhuǎn)所決定的。 ü α螺旋：是蛋白質(zhì)中最常見、最典型、含量最豐富的二級結(jié)構(gòu)?！苍斠姇鳳28-29〕 ü β折疊：又稱β片層結(jié)構(gòu)?！苍斠姇鳳29-30〕 ü β轉(zhuǎn)角：又稱β彎曲，是球狀蛋白形成的主要原因?！苍斠姇鳳30〕 ü 無規(guī)卷曲：也

10、稱無規(guī)線團。不能被歸入明確二級結(jié)構(gòu)的多肽區(qū)段，既不是卷曲，也不是完全沒有規(guī)律，有著明確而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。 ü 超二級結(jié)構(gòu)〔基序、模體或模序〕：是指多肽鏈順序上相鄰的二級結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)如此的、在空間上能識別的二級結(jié)構(gòu)聚集體。 ü 結(jié)構(gòu)域：空間結(jié)構(gòu)上相近的幾個超二級結(jié)構(gòu)單元進一步折疊盤曲而形成的一個或多個相對獨立的致密的三維實體。結(jié)構(gòu)域是三級結(jié)構(gòu)的一局部，結(jié)構(gòu)域之間靠無規(guī)如此卷曲連接。結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的獨立結(jié)構(gòu)單元。 ü 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，包含了一條多肽鏈的主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象。具有二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域的一條多肽鏈，

11、由其序列上相隔較遠而空間上相近的氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用，進展圍更廣泛的盤曲折疊而形成包括主、側(cè)鏈在的空間整體排布，稱為三級結(jié)構(gòu)。 ü 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)：由兩個或兩個以上的亞基之間相互作用，彼此以非共價鍵相連而形成構(gòu)象更為復(fù)雜的聚集體結(jié)構(gòu)，成為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。在具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中，每一條具有三級結(jié)構(gòu)的肽鏈均被稱為亞基或亞單位，由2~10個亞基組成的具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)稱為寡聚體蛋白。對稱性是具有四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)之一。維持蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的主要化學鍵是疏水鍵，位于亞基外表的疏水基側(cè)鏈為了避開水相而相互作用形成疏水鍵進而導(dǎo)致亞基的聚合。 ü 蛋白質(zhì)和多肽的化學合成法：①氨基酸側(cè)鏈活

12、性基團的保護，常用保護劑是芐氧羰酰氯〔Cbz-Cl〕和叔丁羰酰氯〔BOC-Cl〕；②多肽的液相/固相合成。 ü 采用生物技術(shù)合成蛋白質(zhì)：基因工程、細胞工程、酶工程 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 ü 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系：①一級結(jié)構(gòu)不同，其生物學功能各異?！布訅核睾涂s宮素〕基因突變可導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的變化，使蛋白質(zhì)的生物學功能降低或喪失，甚至可引起生理功能的改變而發(fā)生疾病。這種由遺傳突變引起的、在分子水平上僅存在微觀差異而導(dǎo)致的疾病，稱為分子病。②一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，其根本構(gòu)象與功能也相似。③一級結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵序列變化，其生物活性或功能發(fā)生改變。 ü 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和功能的關(guān)系：①蛋

13、白質(zhì)前體的活化。生物體中有許多蛋白質(zhì)是以無活性的蛋白質(zhì)原的形式在體合成、儲存和分泌的，在機體應(yīng)急或細胞需要時，這些蛋白質(zhì)原中某條或某些肽鏈方才以特定的方式斷裂，生成有活性的蛋白，進而發(fā)揮他們所特有的生物學功能。分泌性蛋白質(zhì)除含有特征性的信號肽或?qū)щ男蛄型?，幾乎所有蛋白質(zhì)都有其前體，即原蛋白，含有信號肽或?qū)щ幕虿迦腚?，這些需切除的肽段是在蛋白質(zhì)生物合成中生成轉(zhuǎn)運以與形成獨特生理活性所需的空間結(jié)構(gòu)所必需的。但一旦其相應(yīng)的功能完成，肽段便被切除?！惨葝u素〕②蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象。受別構(gòu)劑或配基等因素的影響，其一級結(jié)構(gòu)不變而空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，進而導(dǎo)致其生物學功能的改變，稱為蛋白質(zhì)的變構(gòu)效應(yīng)。組成蛋白

14、質(zhì)的各個亞基共同控制著蛋白質(zhì)分子的生物活性，并對別構(gòu)劑或配基等信息信號物做出反響，信號物與一個亞基的結(jié)合可傳遞到整個蛋白質(zhì)分子，這個傳遞是通過亞基構(gòu)象的改變而實現(xiàn)的。〔血紅蛋白〕 ü 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象改變可引起疾?。阂恍┑鞍踪|(zhì)盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但折疊發(fā)生錯誤，使其構(gòu)象發(fā)生改變，進而影響到其正常功能，嚴重時可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因蛋白質(zhì)折疊錯誤或折疊導(dǎo)致構(gòu)象異常變化而引起的疾病，成為蛋白質(zhì)構(gòu)象病?！搽貌《尽? 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì) ü 蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點：體多數(shù)蛋白質(zhì)的酸堿氨基酸比例相近，其等電點大多為中性偏酸，約在5.0左右。所以在生理條件下〔pH約為7.4〕，它們大都以負離子形式存在。

15、 ü 蛋白質(zhì)的變性：天然蛋白質(zhì)分子受環(huán)境因素的影響，從有規(guī)如此的嚴密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o規(guī)如此的松散狀態(tài)，即變性作用。構(gòu)象的破壞是蛋白質(zhì)變性的結(jié)構(gòu)根底。在某些物理/化學因素的作用下，蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變或破壞，進而導(dǎo)致其理化性質(zhì)發(fā)生改變和生物活性降低或喪失，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性作用。蛋白質(zhì)變性作用的本質(zhì)是破壞了形成與穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的各種次級鍵從而導(dǎo)致其空間構(gòu)象的改變或破壞，并不涉與一級結(jié)構(gòu)的改變和肽鍵的斷裂。變性作用有以下特征：生物活性喪失和理化性質(zhì)改變〔溶解度降低、黏度增加、結(jié)晶能力消失、易被蛋白酶水解〕。分可逆變性和不可逆變性。 ü 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：蛋白質(zhì)分子直徑在2~20

16、nm，在溶液中易形成大小介于1~100nm的質(zhì)點。蛋白質(zhì)外表易于發(fā)生水合作用形成水化層，使蛋白質(zhì)顆粒不致聚集而沉淀。蛋白質(zhì)外表具有同性電荷，與周圍的反離子構(gòu)成雙電層。 ü 蛋白質(zhì)的沉淀反響：①中性鹽沉淀反響。逐漸向蛋白質(zhì)溶液中參加中性鹽，低鹽濃度可使蛋白質(zhì)溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶，其原因為蛋白質(zhì)外表吸附了某種離子，導(dǎo)致其顆粒外表同性電荷增加而排斥加強，同時與水分子作用也增強，從而提高了其溶解度；隨著鹽濃度的不斷增加，因蛋白質(zhì)水化層的破壞并中和了其外表電荷，而促使蛋白質(zhì)顆粒相互聚集而沉淀，這種現(xiàn)象被稱為鹽析。主要特點是沉淀出的蛋白質(zhì)不變性。②加熱使蛋白質(zhì)凝固變性。③參加有機溶劑使蛋白質(zhì)外表

17、水化層削弱或破壞并使其介電常數(shù)降低而增加帶電質(zhì)點的相互作用，從而使得蛋白質(zhì)顆粒更易相互聚集沉淀。有時可引起蛋白質(zhì)變性。④重金屬鹽沉淀反響。蛋白質(zhì)在pH大于pI的溶液中呈負離子，可與重金屬離子結(jié)合成不溶性蛋白鹽或蛋白絡(luò)合物而沉淀。⑤生物堿試劑的沉淀反響。蛋白質(zhì)在pH小于pI時呈正離子，可與生物堿試劑結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。 ü 蛋白質(zhì)分子量的測定：蛋白質(zhì)分子量一般為1x104 ~ 1x106Da或更高。蛋白質(zhì)在溶液中的形狀可根據(jù)不對稱常數(shù)分為球形、橢圓形、纖維狀等。①凝膠過濾法。②SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。③生物質(zhì)譜法?！苍斠姇鳳48-49〕 ü 蛋白質(zhì)分子的免疫學性質(zhì)。凡能刺激機體免疫系統(tǒng)

18、產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)的抗體和〔或〕致敏淋巴細胞受體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)，統(tǒng)稱為抗原。異物性、大分子性、特異性?？乖碳C體產(chǎn)生能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合并具有免疫功能的免疫球蛋白，稱為抗體。注意抗體與免疫球蛋白之間的區(qū)分。 ü 蛋白質(zhì)免疫性質(zhì)的應(yīng)用：①疾病的免疫預(yù)防：卡介苗、脊髓灰質(zhì)炎糖丸疫苗、白喉類毒素、乙肝的基因工程疫苗等； ②疾病的免疫診斷：α-甲胎蛋白診斷肝癌，血型、 HBsAg檢測等；③疾病的免疫治療：破傷風抗毒素、狂犬病毒抗血清、抗蛇毒抗毒素、胸腺素和干擾素等，單克隆抗體也常作為靶向藥物載體用于腫瘤治療；④免疫分析：免疫擴散、免疫電泳；⑤標記免疫分析：放射免疫分析〔RIA〕、酶聯(lián)免

19、疫分析〔EIA〕、熒光標記免疫分析等；⑥免疫別離純化：免疫親和層析。 ü 蛋白質(zhì)的紫外吸收：由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280280 260 ü 蛋白質(zhì)的呈色反響：①茚三酮反響。蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反響， 生成藍紫色化合物。②雙縮脲反響。蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反響稱為雙縮脲反響，雙縮脲反響可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。 第六節(jié) 蛋白質(zhì)的別離純化與分析根本原理 ü 蛋白質(zhì)的提?。涸黾拥鞍椎募兌龋栽黾訂挝坏鞍踪|(zhì)中所需要的蛋白質(zhì)重量和生物活性。 既要盡量提

20、取所需目標的蛋白質(zhì)，又要防止蛋白酶等的降解和其他因素對其空間構(gòu)象的破壞作用。 ü 根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度差異別離：①等電點沉淀。蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小。單純使用此法不易使蛋白質(zhì)沉淀完全，常與其他方法配合使用。②鹽析法。是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等參加蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)外表電荷被中和以與水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素被去除沉淀。優(yōu)點：沉淀的蛋白質(zhì)保持著它的天然構(gòu)象，能 再溶解。③有機溶劑分級別離法。是將有機溶劑〔丙酮、乙醇〕參加蛋白質(zhì)溶液中，導(dǎo)致溶液介電常數(shù)降低，增加了相反電荷之間的吸引力，蛋白質(zhì)分子外表可解離基的離子化強度減弱，水化程度降低，因此促進了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀

21、。須知事項：使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃下進展。 蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即別離，防止變性。④溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響。一般在0～40℃，多數(shù)球狀蛋白的溶解度隨溫度的升高而增加；40～50℃以上，多數(shù)蛋白質(zhì)不穩(wěn)定并開始變性。因此，對蛋白質(zhì)的沉淀一般要求 低溫條件。 ü 根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量差異別離：①透析與超濾法。透析指利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法 。只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)。超過濾指應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。用于除小分子雜質(zhì)，別離、濃縮蛋白質(zhì)。②凝膠過濾法。也稱分子排阻層析，層析柱填滿帶有小孔的顆粒，一般由葡聚糖

22、制成。蛋白質(zhì)溶液加于柱頂部，小分子蛋白質(zhì)進入孔，因而在柱中滯留時間較長，大分子不能進入孔而徑直流出，因此不同大小的蛋白質(zhì)得以別離。分子篩：具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。常用分子篩有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠。③密度梯度離心。蛋白質(zhì)顆粒的沉降速度取決于它的大小和密度。當其在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)梯度時，即停滯不前，可分步收集進展分析。 ü 根據(jù)蛋白質(zhì)的電離性質(zhì)差異別離：①電泳法。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳：A.SDS-聚丙烯

23、酰胺凝膠電泳。在蛋白質(zhì)樣品和聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中參加帶負電荷較多的十二烷基磺酸鈉〔SDS〕，使所有蛋白質(zhì)顆粒外表覆蓋有一層SDS分子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的電荷差異消失，此時蛋白質(zhì)在電場中的泳動速率僅與蛋白質(zhì)顆粒大小有關(guān)。常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。SDS的作用：a.由于SDS是陰離子，使多肽外表覆蓋的負電荷遠遠超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了原來的 電荷差異。b.SDS是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用，巰基乙醇打開二硫鍵，因此使蛋白質(zhì)分子處于伸展狀態(tài)。改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，長軸長度隨其分子量的大小成正比變化。B.醋酸纖維薄膜電泳。它以

24、醋酸纖維薄膜作為支持物，電泳效果比紙電泳好，時間短、電泳圖譜清晰。臨床用于血漿蛋白電泳分析。C.等電聚焦電泳。在聚丙烯酰胺凝膠中參加系列兩性電解質(zhì)載體，在電場中形成一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，也即pH從凝膠的正極向負極依次遞增，電泳時被別離蛋白質(zhì)處在偏離其等電點的pH位置時帶有電荷而移動，至該蛋白質(zhì)pI值相等的pH區(qū)域時，其靜電荷為零而不再移動，這種通過蛋白質(zhì)的等電 點的差異而別離蛋白質(zhì)的電泳方法稱為等電聚焦電泳。D.雙向凝膠電泳。第一向為蛋白質(zhì)等電聚焦電泳，第二項為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過被別離蛋白質(zhì)等電點和分子量的差異，將復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物在二維平面上別離。E.免疫電泳。把電泳技術(shù)

25、和抗原與抗體反響的特異性相結(jié)合，一般以瓊脂或瓊脂糖凝膠為支持物。本法常用于蛋白質(zhì)的鑒定與其純度的檢查。目前此類方法已有許多新的開展，如熒光免疫電泳、酶免疫電泳、放射免疫電泳、Western Blot分析等。②離子交換層析法。利用離子交換樹脂作為支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進展別離的方法。分類：陽離子交換樹脂，帶負電，如羧甲基纖維素等；陰離子交換樹脂，帶正電，如二乙基氨基乙基纖維素。③親和層析別離。利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力，把待純化的某一蛋白質(zhì)的特異配體通過適當?shù)幕瘜W反響共價的連接到像瓊脂糖凝膠一類外表的功能基，當?shù)鞍踪|(zhì)混合物加到填有親和介質(zhì)的層析柱時，待純化的某一蛋白質(zhì)如此被

26、吸附在含配體的瓊脂糖顆粒外表上時，而其它的蛋白質(zhì)如此因?qū)υ撆潴w無特異的結(jié)合部位而不被吸附，它們通過洗滌可除去，被特異結(jié)合蛋白質(zhì)可用含游離的相應(yīng)配體溶液把它從柱上洗脫下來。 ü 蛋白質(zhì)純度的鑒定：①層析法：用分子篩或離子交換層析檢查樣品時，如果樣品是純的應(yīng)顯示單一的洗脫峰，稱為“層析純〞。②電泳法：用PAGE檢查樣品呈現(xiàn)單一區(qū)帶，也是純度的一個指標，這明確樣品在電荷和質(zhì)量方面的均一性。純的蛋白質(zhì)電泳僅有一條區(qū)帶，但僅有一條區(qū)帶卻不一定是純的，僅能明確它在電泳上的均一性，稱為“電泳純〞。③免疫化學法：免疫學技術(shù)是鑒定蛋白質(zhì)純度的有效方法，它根據(jù)抗原與抗體反響的特異性，可用抗體檢查抗原或抗原檢查抗體。④其他方法：還有超速離心法，蛋白質(zhì)化學組成和結(jié)構(gòu)分析等。 8 / 8