《王鏡巖生化 核酸PPT課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《王鏡巖生化 核酸PPT課件（75頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

1、P330 表5-1 兩類核酸的基本化學組成RNA： D-核糖， A、G、C、U堿基DNA： D-2-脫氧核糖， A、G、C、T堿基 第1頁/共75頁一、堿基1. 嘌呤堿： 腺嘌呤 A 鳥嘌呤 G2. 嘧啶堿： 胞嘧啶 C 尿嘧啶 U 胸腺嘧啶 T P331 結構式 3. 修飾堿基： 100余種，多數是甲基化的產物植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌體中，5-羥甲基胞嘧啶代替C。第2頁/共75頁二、核苷與脫氧核苷核酸中的核苷與脫氧核苷均為-型嘧啶堿： C1 N1，嘌呤堿： C1 N9。 P332 結構式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脫氧核苷第3頁/共75頁三、核苷酸核苷中戊糖C3、C5羥基被磷酸酯

2、化 P332結構式：5-AMP 3-dCMP 第4頁/共75頁第5頁/共75頁1、構成DNA、RNA的核苷酸P481表13-4DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA： AMP、 GMP、 CMP、 UMP2、細胞內游離核苷酸及其衍生物第6頁/共75頁核苷5-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代謝和物質代謝及調控中起重要作用。環(huán)核苷酸3,5-cAMP， 3,5-cGMP激素的第二信使，cAMP調節(jié)細胞的糖代謝、脂代謝。核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppGpp pppGpp ppApp核苷酸衍生物HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等輔助因子。GDP-

3、半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供體。第7頁/共75頁第二節(jié)第二節(jié)DNA的結構的結構一級：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。二級：DNA的兩條多聚核苷酸鏈間通過氫鍵形成的雙螺旋結構。三級：DNA雙鏈進一步折疊卷曲形成的構象。第8頁/共75頁一、DNA的一級結構dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通過3、5-磷酸二酯鍵連接起來的線形多聚體。 P483 圖 13-2 寫法：53：5-pApCpTpG-3，或5ACTG3 第9頁/共75頁第10頁/共75頁二、DNA的二級結構1953年，Watson和Crick根據Chargaff 規(guī)律和DNA Na鹽纖維的X光衍射分析提出了D

4、NA的雙螺旋結構模型。Chargaff 規(guī)律 1950年a. 所有DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。P486。b. DNA的堿基組成具有種的特異性。c. DNA堿基組成沒有組織和器官的特異性。d. 年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境等因素不影響DNA的堿基組成。 DNA的Na鹽纖維和DNA晶體的X光衍射分析。Franklin相 對 濕 度 9 2 % ： B DNA。相 對 濕 度 7 5 % ： A DNA。 ZDNA。第11頁/共75頁1、Watson-Crick雙螺旋結構模型(B-DNA)P486圖135 兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條53，另一條35 嘌呤

5、與嘧啶堿位于雙螺旋的內側，磷酸與脫氧核糖在雙螺旋外側。 磷酸與脫氧核糖彼此通過3、5-磷酸二酯鍵相連接，構成DNA分子的骨架。 兩條核苷酸鏈，依靠堿基間形成的氫鏈結合在一起。A=T、G=C 每圈螺旋含10個核苷酸，堿基堆積距離0.34nm，螺距：3.4nm，雙螺旋平均直徑2nm， 大溝：寬1.2nm ，深0.85nm，小溝 ：寬0.6nm，深0.75nmP487 圖13-6 13-7第12頁/共75頁第13頁/共75頁2、穩(wěn)定雙螺旋結構的因素堿基堆積力（主要因素） 形成疏水環(huán)境。堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。磷酸基上的負電荷與介質中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上

6、的負電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。堿基處于雙螺旋內部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。第14頁/共75頁三、DNA二級結構的多型性P489 表13-6 A-、B-、Z-DNA的比較1、BDNA：典型的Watson-Crick雙螺旋DNA右手雙股螺旋每圈螺旋10.4個堿基對螺旋扭角36螺距：3.32nm堿基傾角：1生物體內DNA均為BDNA。第15頁/共75頁2、A-DNA在相對濕度75%以下所獲得的DNA纖維。右手雙螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結構。3、Z-DNA左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z-DNA。第16頁/共75頁4、D

7、NA三股螺旋（H-DNA）DNA的三鏈結構常出現(xiàn)在DNA復制、重組、轉錄的起始位點或調節(jié)位點。第三股鏈的存在可能使一些調控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結合，從而阻遏有關遺傳信息的表達。第17頁/共75頁四、四、DNA二級結構的不均一性二級結構的不均一性1、反向重復序列（回文序列）DNA序列中，以某一中心區(qū)域為對稱軸，其兩側的堿基對順序正讀和反讀都相同。較長的回文結構，可形成莖環(huán)結構和發(fā)夾結構。轉錄的終止作用與回文結構有關。較短的回文序列，可作為一種特別信號，如限制性核酸內切酶的識別位點。2、富含AT的序列很多有重要調節(jié)功能的DNA區(qū)段都富含AT堿基對。特別是在復制起點和轉錄啟動的Pribn

8、ow區(qū)，富含AT對。第18頁/共75頁五、環(huán)狀DNA某些病毒DNA某些噬菌體DNA某些細菌染色體DNA細菌質粒DNA真核細胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA第19頁/共75頁1、環(huán)狀DNA的不同構象P491圖13-12 松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負超螺旋第20頁/共75頁（1）、松弛環(huán)形DNA線形DNA直接環(huán)化（2）、解鏈環(huán)形DNA線形DNA擰松后再環(huán)化（3）、正超螺旋與負超螺旋DNA正超螺旋：在一端使繩子向纏緊的方向旋轉，再將繩子兩端連接起來，會產生一個左旋的超螺旋，以解除外加的旋轉造成的脅變，這樣的超螺旋叫正超螺旋。負超螺旋：在繩子一端向松弛方向旋轉，再將繩子兩端連接起來，會產生一個右旋的超螺旋，以解

9、除外加的旋轉所造成的脅變，這樣的超螺旋稱負超螺旋。第21頁/共75頁2、環(huán)形DNA的拓撲學特性以 2 6 0 b p 組 成 的 線 形 B - D N A 為 例 ， 螺 旋 周 數260/10.4=25。連環(huán)數（L）DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數，以L表示。松馳環(huán)：L=25解鏈環(huán)：L=23超螺旋：L=23第22頁/共75頁纏繞數（T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋數目，以T表示松馳環(huán)T=25解鏈環(huán)T=23超螺旋T=25超螺旋周數（扭曲數W）松馳環(huán)W=0解鏈環(huán)W=0超螺旋W= -2L=T+W第23頁/共75頁比連環(huán)差（）表示DNA的超螺旋程度=（LL0）/L

10、0L0是指松馳環(huán)形DNA的L值天然DNA的超螺旋密度一般為-0.03-0.09，平均每100bp上有3-9個負超螺旋。負超螺旋DNA是由于兩條鏈的纏繞不足引起（L），很易解鏈，易于參加DNA的復制、重組和轉錄等第24頁/共75頁Superhelix density=/=每一圈初級螺旋（10bp，360）出現(xiàn)超螺旋數不同生物的DNA分子的大小不同形成幾乎相同的超螺旋密度SV40 5226bp T=522 W=-26(L=496) =-0.05E.coli 4.2X106bp T=4.2X105 W=4.2X105X-0.05=-2X104一般天然DNA分子中=-0.05=5%負向超螺旋第25頁/

11、共75頁3、拓撲異構酶改變DNA拓撲異構體的L值。拓撲異構酶酶I（擰緊）能使雙鏈負超螺旋DNA轉變成松馳形環(huán)狀DNA，每一次作用可使L值增加1，同時，使松馳環(huán)狀DNA轉變成正超螺旋。拓撲異構酶酶II（擰松）能使松馳環(huán)狀DNA轉變成負超螺旋形DNA，每次催化使L減少2，同時能使正超螺旋轉變成松馳DNA。第26頁/共75頁六、DNA的生物學功能首次直接證明DNA的遺傳功能的是Avery的肺炎雙球菌轉化實驗。 P342 14 Avery的肺炎雙球菌轉化實驗第27頁/共75頁第28頁/共75頁第三節(jié)第三節(jié)RNA的結構的結構一、RNA的一級結構AMP、GMP、CMP、UMP通過3、5磷酸二酯鍵形成的線形

12、多聚體。 P484 圖13-3 RNA基本結構第29頁/共75頁組成RNA的戊糖是核糖RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有堿基。天然RNA分子都是單鏈線形分子，只有部分區(qū)域是A-型雙螺旋結構。第30頁/共75頁二、RNA的類型核糖體RNA： rRNA 轉運 RNA： tRNA信使 RNA： mRNA 核內小RNA： snRNA （small nuclear RNA ） P344 表5-7 大腸桿菌中的RNA第31頁/共75頁三、tRNA的結構 70-90b，分子量在25kd左右，沉降系數4S左右有較多稀有堿基 圖3末端為CpCpA-OH，用來接受活化的氨基酸，此末端稱接受末端

13、。5末端大多為pG或pC二級結構是三葉草形 P496 圖46-18 tRNA的二級結構（三葉草模型） 第32頁/共75頁第33頁/共75頁四、mRNA的結構1、真核mRNA的結構（1）、3-端有一段約30-300核苷酸的polyA。PolyA是mRNA由核進入胞質所必需的形式。PolyA大大提高mRNA在胞質中的穩(wěn)定性。polyA與mRNA半壽期有關，新合成的mRNA，其polyA較長；而衰老的mRNA，其polyA較短。（2）、5-帽子P346 帽子結構：第34頁/共75頁帽子結構： 3-mG-5ppp5-Nm-3-P5末端的鳥嘌呤N7被甲基化，鳥嘌呤核苷酸經焦磷酸與相鄰的一個核苷酸相連，形

14、成5-5-磷酸二酯鍵。帽子的功能：可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。 可為核糖體提供識別位點，使mRNA很快與核糖體結合，促進蛋白質合成起始復合物的形成。第35頁/共75頁2、原核mRNA的結構（多順反子）由先導區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒有5帽子和3polyA。SD序列：5端先導區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5-AGGAGGU-3，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarno發(fā)現(xiàn)，稱SD序列。SD序列和核糖體16S的rRNA的3末端富含嘧啶堿基的序列互補。第36頁/共75頁六、rRNA的結構rRNA與核糖體蛋白結合一起構成核糖體。大腸桿菌中有三

15、類rRNA：5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA真核細胞有四類rRNA：5S rRNA，5.8S rRNA，8SrRNA28S rRNA P346 圖5-14 大腸桿菌 5S rRNA 結構第37頁/共75頁第38頁/共75頁第四節(jié)第四節(jié)核酸的性質核酸的性質第39頁/共75頁一、解離性質磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。DNA等電點 44.5RNA 等電點 22.5第40頁/共75頁二、水解性質1、堿水解室溫，0.1mol/LNaOH可將RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。 圖 在相同條件下，DNA不被水解。這是因為RNA中C2-OH的存在，促進了磷酸酯鍵的水解。DNA、RN

16、A水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義：DNA穩(wěn)定 ，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務后迅速降解。第41頁/共75頁2、酶水解RNA水解酶 RNaseDNA水解酶 DNase核酸外切酶核酸內切酶 ：限制性核酸內切酶第42頁/共75頁三、光吸收性堿基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有強烈的光吸收，max=260nm1、鑒定純度純DNA的A260/A280應為1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。純RNA的A260/A280應為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。第43頁/共75頁2、含量計算1 ABS值相當于：5

17、0ug/mL雙螺旋DNA 或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA） 或：20ug/mL核苷酸3、增色效應與減色效應P347 圖5-15 DNA的紫外吸收光譜 增色效應：在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數增大減色效應：在DNA的復性過程中，摩爾吸光系數減小。第44頁/共75頁第45頁/共75頁四、沉降特性（DNA）不同構象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度離心就可以將它們區(qū)分開來，這一方法常用于質粒DNA的純化。 P348 圖516 Cs-Cl密度梯度離心純化質粒DNA 相對沉降常數線型雙螺旋分子 1.00松馳雙鏈閉環(huán) 1.14切刻雙鏈環(huán) 1.14單鏈環(huán) 1.

18、14線型單鏈 1.30正超或負超螺旋雙鏈環(huán)狀 1.41坍縮 3.0第46頁/共75頁五、變性、復性1、變性核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價鍵斷裂。DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內。P350 圖5-18變性過程 因素 ：熱變性 酸堿變性（pH小于4或大于11） 變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 變性后 ：260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二級結構改變，部分失活。 第47頁/共75頁第48頁/共75頁（1）、熔解溫度（Tm）：DNA的雙螺旋結構失去一半時對應的溫度。濃度50ug/mL時，雙鏈DNA A260=1.00，完全變性（單鏈）A260= 1

19、.37當A260增加到最大增大值一半時，即1.185時，對應的溫度即為Tm。DNA的Tm一般在7085之間。第49頁/共75頁（2）、影響DNA的Tm值的因素DNA均一性 。 均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍內。G-C含量與Tm值成正比。測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44 P351圖5-19 圖5-20 Tm值與GC含量的關系介質中離子強度其它條件不變，離子強度高，Tm高。P351 圖5-21第50頁/共75頁第51頁/共75頁2、復性變性DNA在適當（一般低于Tm2025）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結構。變性DNA在緩慢冷卻時可以復性，快速冷卻不能復性

20、。DNA片段越大，復性越慢；DNA濃度越大，復性越快。復性速度可用Cot衡量。Co為變性DNA原始濃度molL-1，t為時間，以秒表示。第52頁/共75頁 P352 圖5-22，不同DNA的復性時間。1個核苷酸對（A.U），若濃度為Co=1.0m mol/L，則50%復性時， Cot1/2=410-6mol.s/L，t=0.004秒全部復性， Cot=10-4， t=0.1秒E.coli 4.2106堿基對，若濃度Co=1.0 umol/L，則復性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，約115天。復性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5108秒，5758天。復

21、性機制：10-20bp成拉鏈第53頁/共75頁第54頁/共75頁第五節(jié)第五節(jié)核酸研究技術核酸研究技術一、核酸的分離純化盡可能保持其天然狀態(tài)。條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌。抑制核酸酶。第55頁/共75頁1、DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或鹽（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性質，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。DNA核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質。第56頁/共75頁2、RNA的制備（重點介紹mRNA的分離、純化）用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（R

22、NP）。去蛋白：鹽酸胍、苯酚等必須防止RNA酶對RNA的破壞。第57頁/共75頁二、核酸的凝膠電泳1、瓊脂糖電泳 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數成反比 凝膠濃度 DNA的構象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。 電流，不大于5V/cm2、PAGE電泳第58頁/共75頁三、限制性核酸內切酶（1979年發(fā)現(xiàn)）1、限制修飾系統(tǒng) 圖 第59頁/共75頁2、II型核酸內切酶限制和修飾活性分開，蛋白質結構是單一成分，輔助因子Mg2+，位點序列旋轉對稱（反向重復）。II型酶的切割頻率識別位點 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536 限制酶的命名：E.coRI第一位： 屬名E（大寫）第

23、二、三位：種名的頭兩個字母小寫co第四位： 菌株R第五位： 從該細菌中分離出來的這一類酶的編號第60頁/共75頁第61頁/共75頁同裂酶：來源不同的限制酶（名稱自然不同），識別位點相同，切割位點相同，產生同樣的粘性末端。 BamHI：GGATCC BstI GGATCCMboI GATC Sau3A GATC同尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，但都產生相同的粘性末端。BclI TGATCA BglII AGATCA 星號活力：在一定條件下（低離子強度，堿性pH，或50%甘油），限制酶的特異性降低。結果，它的識別與切割所需的典型的核苷酸序列的數量和種類會發(fā)生變化。例如 HindIII AAGCT

24、T 第62頁/共75頁四、DNA物理圖譜及構建（限制酶切圖譜、DNA酶切位點圖譜）在研究某一種DNA時，弄清該DNA分子有哪些限制酶切位點是很重要的。建立物理圖譜是進一步分析此DNA的基礎。末端標記法構建DNA物理圖譜：（1）單酶完全降解和部分降解（2）雙酶降解 圖第63頁/共75頁五、分子雜交1、SouthernBlottingP353 圖5-23DNA樣品 酶切 電泳 變性 轉膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影變性（NaOH 0.5mol/L）轉膜（NC膜）固定（80，4-6h）雜交（高鹽濃度，68，幾小時）Southern Blotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的

25、大小和定位?？捎肈NA或RNA探針。第64頁/共75頁第65頁/共75頁2、NorthernBlotting研究對象是mRNA，探針一般是DNA?？俁NA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）3、WesternBlotting是研究克隆基因表達產物、鑒定克隆株的常用技術。 抗原與抗體的雜交第66頁/共75頁六、DNA序列分析（一）（一）化學裂解法（化學裂解法（Maxam-Gilbert法）法）原理： 利用特異性的化學裂解法，制備出具有同一標記末端，而另一端是長度只差一個核苷酸的片段群，然后將此片段群在能夠分辨長度只差一個核苷酸DNA片段的PAGE上分離。 第67頁/共75頁 32P-GC

26、TACGTA特異性化學裂解在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT在G處： 32p ，32p-GCTAC在C處：32P-G和 32P-GCTA在T處：32P-GC和32P-GCTACG第68頁/共75頁硫酸二甲酯特異切割：G 甲酸特異切割：G和A肼在Nacl條件下切割：C 肼在無 Nacl條件下切割：T和C32P *ACTTCGACAA硫酸二甲酯： *ACTTC 甲酸： *P *ACTTC*ACTTCG *ACTTCGAC *ACTTCGACA肼（有Nacl）： *A *ACTT *ACTTCGA 肼（無Nacl）： *A *AC *ACT *ACTT*ACTTCGA從下往上讀：CTAC

27、GTA，末端G不能讀出。第69頁/共75頁（二）（二）雙脫氧終止法雙脫氧終止法英國 Sanger 1955 確定牛胰島素結構， 1958 獲諾貝爾化學獎 1980 設計出DNA測序法， 1980 獲諾貝爾化學獎合成一段與待測DNA序列互補的DNA片段群。 第70頁/共75頁（三）（三）序列分析儀序列分析儀四色熒光基團標記的ddNTP第71頁/共75頁七、DNA合成（探針、引物、基因）1、化學合成：固相合成法（亞磷酸三酯法）P353 合成過程合成方向：3 5端5-OH用二對甲氧三苯甲基（DMT）保護。3-OH用氨基磷酸化合物活化堿基上氨基用苯甲酸保護 保護： 5-OH、活化3-OH、保護所有NH2第72頁/共75頁第73頁/共75頁2、DNA的酶合成PCR模板DNA（單鏈）引物DNA聚合酶dATP、 dGTP、dCTP、dTTP 一定濃度的Mg2+合成方向：5 3端化學合成：方向3 5，不需DNA模板，酶。生物合成：方向5 3，需模板，引物，DNA聚合酶。第74頁/共75頁感謝您的觀看！第75頁/共75頁