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1、第1頁(yè)/共63頁(yè)第2頁(yè)/共63頁(yè)第3頁(yè)/共63頁(yè)第4頁(yè)/共63頁(yè)第5頁(yè)/共63頁(yè)第6頁(yè)/共63頁(yè)第7頁(yè)/共63頁(yè)第8頁(yè)/共63頁(yè)識(shí)別序列 大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成。 也有少數(shù)限制酶識(shí)別序列由4、5、或8個(gè)核苷酸組成。第9頁(yè)/共63頁(yè)第10頁(yè)/共63頁(yè)第11頁(yè)/共63頁(yè)第12頁(yè)/共63頁(yè)平末端平末端第13頁(yè)/共63頁(yè)第14頁(yè)/共63頁(yè)第15頁(yè)/共63頁(yè)E.coliDNA連接酶 從大腸桿菌中分離得到的。只能用于粘性末端的連接T4DNA連接酶從T4噬菌體中分離得到的。既能用于粘性末端的連接，又能用于平末端的連接，但是平末端的連接效率低。第16頁(yè)/共63頁(yè)為什么要用運(yùn)載體？第17頁(yè)/共6

2、3頁(yè)第18頁(yè)/共63頁(yè)第19頁(yè)/共63頁(yè)第20頁(yè)/共63頁(yè)第21頁(yè)/共63頁(yè)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu)調(diào)控遺傳信息表達(dá),上 游有啟動(dòng)子，下游有終止子第22頁(yè)/共63頁(yè)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子 外顯子 啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列： 包括非編

3、碼區(qū)和內(nèi)含子第23頁(yè)/共63頁(yè)原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)不同點(diǎn)編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點(diǎn)相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第24頁(yè)/共63頁(yè)第25頁(yè)/共63頁(yè)供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶第26頁(yè)/共63頁(yè)1、目的基因的獲取1目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子2獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫(kù)中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成第27頁(yè)/共63頁(yè)概念：基因文庫(kù) （

4、gene library）基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)） 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(kù)(gene library)第28頁(yè)/共63頁(yè)基因組文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù).部分基因文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù).第29頁(yè)/共63頁(yè)基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系第30頁(yè)/共63頁(yè)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建mRNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補(bǔ)DNA） DNA聚合酶雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄法：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA第31頁(yè)/共63頁(yè)基

5、因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較第32頁(yè)/共63頁(yè)如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。第33頁(yè)/共63頁(yè)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過(guò)此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。第34頁(yè)/共63頁(yè)第35頁(yè)/共63頁(yè)v 人工合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成第36頁(yè)/共63頁(yè)3、基因表達(dá)載體（重組

6、質(zhì)粒）的構(gòu)建（1）用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出_。（2）用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個(gè)重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1過(guò)程:第37頁(yè)/共63頁(yè)2基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點(diǎn)位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞第38頁(yè)/共63頁(yè)第39頁(yè)/共63頁(yè)質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶表達(dá)載體同一種過(guò)程:第40頁(yè)/共63頁(yè)2

7、、基因表達(dá)載體的作用a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？第41頁(yè)/共63頁(yè)第42頁(yè)/共63頁(yè)第43頁(yè)/共63頁(yè)第44頁(yè)/共63頁(yè)1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn):能感染雙子葉植物和祼子植物,對(duì)單子葉植物無(wú)感染能力Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過(guò)程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第45頁(yè)/共63頁(yè)（2）基因槍法 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體

8、DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。第46頁(yè)/共63頁(yè)（3）花粉通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。第47頁(yè)/共63頁(yè)2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法:顯微注射技術(shù)操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物第48頁(yè)/共63頁(yè)3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體

9、與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA第49頁(yè)/共63頁(yè)第50頁(yè)/共63頁(yè)(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)導(dǎo)入檢測(cè)：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞方法DNA分子雜交表達(dá)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄檢測(cè)分子雜交翻譯檢測(cè)抗原抗體雜交分子檢測(cè)法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個(gè)體水平的鑒定第51頁(yè)/共63頁(yè)第52頁(yè)/共63頁(yè)知識(shí)延伸DNA分子雜交技術(shù) 該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。第53頁(yè)/共63頁(yè)第54頁(yè)/共63頁(yè)DNA附著在膜上硝化纖維素加探針報(bào)告基因（含熒光素分子）變性DNA雜交（如檢測(cè)SARS病毒等）abcd第55頁(yè)/共63頁(yè)復(fù)習(xí)題1）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞有哪些方法?(試舉例說(shuō)明)2）簡(jiǎn)述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第56頁(yè)/共63頁(yè)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子終止子基因的結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子原核真核第57頁(yè)/共63頁(yè)第58頁(yè)/共63頁(yè)第59頁(yè)/共63頁(yè)第60頁(yè)/共63頁(yè)第61頁(yè)/共63頁(yè)第62頁(yè)/共63頁(yè)感謝您的觀看！第63頁(yè)/共63頁(yè)