《高效液相色譜法 (2)課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《高效液相色譜法 (2)課件（47頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、返回章目錄高效液相色譜法高效液相色譜法 High Performance Liquid Chromatography分析化學(xué)教研室分析化學(xué)教研室高效液相色譜儀分析流程仿真高效液相色譜儀分析流程仿真系統(tǒng)系統(tǒng) 返回章目錄高效液相色譜法高效液相色譜法概述概述1 1基本原理基本原理2 2各類高效液相色譜法各類高效液相色譜法3 3固定相固定相4 4流動(dòng)相流動(dòng)相5 5高效液相色譜儀高效液相色譜儀6 6小結(jié)小結(jié)習(xí)題及解答習(xí)題及解答返回章目錄一、概一、概 述述v 高效液相色譜法高效液相色譜法：以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，在氣相色譜的：以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，在氣相色譜的理論和實(shí)驗(yàn)方法基礎(chǔ)上建立的一種分離分析方法。理論

2、和實(shí)驗(yàn)方法基礎(chǔ)上建立的一種分離分析方法。v 簡(jiǎn)稱：簡(jiǎn)稱：HPLC；HRLC；SPLC； UPLC 超高效液相色譜（超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography）v 與經(jīng)典與經(jīng)典LCLC相比相比高效高效 高效填料：高效填料：3 35m 5m 高壓泵輸液高壓泵輸液 高靈敏度的檢測(cè)器高靈敏度的檢測(cè)器: :在線檢測(cè)在線檢測(cè)返回章目錄一、概一、概 述述分析對(duì)象分析對(duì)象流動(dòng)相差別流動(dòng)相差別GC能氣化、熱能氣化、熱穩(wěn)定性好、且穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣沸點(diǎn)較低的樣品，占有機(jī)物品，占有機(jī)物的的20%20%惰性氣體惰性氣體HPLCl不受樣品揮不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定

3、發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，占性的限制，占有機(jī)物的有機(jī)物的80%80%l液體，種類液體，種類較多，選擇余較多，選擇余地廣地廣HPLCHPLC與與GCGC區(qū)別區(qū)別返回章目錄一、概一、概 述述 HPLCHPLC儀器示意圖儀器示意圖返回章目錄一、概一、概 述述Agilent 1100返回章目錄一、概一、概 述述 HPLCHPLC儀器圖儀器圖SHIMADZUAGILENTWATERS返回章目錄一、概一、概 述述application返回章目錄高效液相色譜法高效液相色譜法概述概述1 1基本原理基本原理2 2各類高效液相色譜法各類高效液相色譜法3 3固定相固定相4 4流動(dòng)相流動(dòng)相5 5高效液相色譜儀高效液相色譜

4、儀6 6返回章目錄二、基本原理二、基本原理v 范氏方程（Van Deemter equation)：重要GC： 填充柱填充柱 H = A + B/u + Cu 開(kāi)口毛細(xì)管柱開(kāi)口毛細(xì)管柱H = B/u + CuHPLC： H = A + Cu原因：原因：T； u 忽略忽略B/u2mBDmTD返回章目錄二、基本原理二、基本原理GC GC 和和 HPLC HPLC 的的 H-u H-u 圖圖(1)(1) B/u B/u (2)(2) Cu Cu (3)(3) A A (4)(4) HPLC HPLC 的的uopt (5)(5) GC GC 的的uopt返回章目錄二、基本原理二、基本原理v HPLC：

5、 H = A + Cu A = 2dp C = Cm+ Csmv影響因素影響因素： 選球形固定相，高壓、勻漿裝柱法 dp選粒徑小的化學(xué)鍵合相 C選粘度小、低流速的流動(dòng)相范氏方程范氏方程（van Deemter equation)返回章目錄高效液相色譜法高效液相色譜法概述概述1 1基本原理基本原理2 2各類高效液相色譜法各類高效液相色譜法3 3固定相固定相4 4流動(dòng)相流動(dòng)相5 5高效液相色譜儀高效液相色譜儀6 6返回章目錄三、各類高效液相色譜法三、各類高效液相色譜法液固吸附色譜法（液固吸附色譜法（LSCLSC）1 1液液分配色譜法（液液分配色譜法（LLCLLC）2 2化學(xué)鍵合相色譜法（化學(xué)鍵合相

6、色譜法（BPCBPC）3 3返回章目錄三、各類高效液相色譜法三、各類高效液相色譜法v 液固吸附色譜法液固吸附色譜法 分離機(jī)理:組分分子與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)吸附劑表面活性中心 固定相:硅膠 流動(dòng)相:底劑（烷烴）+ 極性調(diào)節(jié)劑 出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱 例如：TLC返回章目錄三、各類高效液相色譜法三、各類高效液相色譜法v 液液分配色譜法液液分配色譜法 分離機(jī)制：利用組分在兩相中分配系數(shù)的差異分離機(jī)制：利用組分在兩相中分配系數(shù)的差異 分類分類: :概念及保留行為（重要）概念及保留行為（重要） 正相色譜正相色譜 NPLCNPLC固定液極性固定液極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性極性小的組分先出

7、柱，極性大的組分極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱后出柱 反相色譜反相色譜 RPLCRPLC固定液極性固定液極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性極性大的組分先出柱，極性小的組分極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱后出柱返回章目錄三、各類高效液相色譜法三、各類高效液相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法 (bonded phase chromatography (bonded phase chromatography，BPC) BPC) 概念：固定液的官能團(tuán)通過(guò)概念：固定液的官能團(tuán)通過(guò) 化學(xué)反應(yīng)鍵合在載體表面化學(xué)反應(yīng)鍵合在載體表面 反相鍵合相反相鍵合相 離子抑制離子抑制 正相鍵合相正相鍵合相 離子

8、對(duì)離子對(duì)返回章目錄三、各類高效液相色譜法三、各類高效液相色譜法v反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法(RBPC)(RBPC)分離機(jī)制分離機(jī)制：疏溶劑理論等：疏溶劑理論等固定相：非極性的鍵合相固定相：非極性的鍵合相如如: :十八烷基硅烷鍵合相（十八烷基硅烷鍵合相（ODSODS；C C1818柱柱) )流動(dòng)相：極性大的流動(dòng)相流動(dòng)相：極性大的流動(dòng)相如如: :甲醇甲醇- -水或乙腈水或乙腈- -水水流動(dòng)相極性與流動(dòng)相極性與k k的關(guān)系的關(guān)系: :極性極性，洗脫能力，洗脫能力，kk，組分，組分t tR R極性大的組分先出柱極性大的組分先出柱應(yīng)用：非極性應(yīng)用：非極性-中等極性組分中等極性組分(80%)(80%

9、)返回章目錄三、各類高效液相色譜法三、各類高效液相色譜法2. 正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法(NBPC)(NBPC)分離機(jī)制分離機(jī)制：定向作用力、誘導(dǎo)作用力、或氫鍵作用：定向作用力、誘導(dǎo)作用力、或氫鍵作用力的差別力的差別固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相流動(dòng)相：極性小的底劑（烷烴）流動(dòng)相：極性小的底劑（烷烴）+ 極性調(diào)節(jié)劑極性調(diào)節(jié)劑 流動(dòng)相極性與流動(dòng)相極性與k k的關(guān)系的關(guān)系：流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性，洗脫能力，洗脫能力，組分，組分t tR R，k k結(jié)構(gòu)相近組分，極性大的組分后出柱結(jié)構(gòu)相近組分，極性大的組分后出柱返回章目錄三、各類高效液相色譜法三、各類高效液相色譜

10、法3. 離子對(duì)色譜法離子對(duì)色譜法(IPC,PIC)(IPC,PIC)分離機(jī)制分離機(jī)制：在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，使形成：在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，使形成不帶電的中性離子對(duì)，以改善分離不帶電的中性離子對(duì)，以改善分離機(jī)理：機(jī)理： 流動(dòng)相流動(dòng)相 固定相固定相 B+H+ BH+ + RSO3Na RSO-3+Na+ BH+.RSO-3 BH+.RSO-3 中性離子對(duì)中性離子對(duì) 增加了在非極性固定相中溶解度。增加了在非極性固定相中溶解度。返回章目錄三、各類高效液相色譜法三、各類高效液相色譜法常用離子對(duì)試劑： 分析對(duì)象離子對(duì)試劑例如堿烷基磺酸鈉C5、C6、C7、C8磺酸鈉,SDS酸四丁基季銨鹽四丁基胺磷酸

11、鹽（TBA）返回章目錄三、各類高效液相色譜法三、各類高效液相色譜法4. 離子抑制色譜法離子抑制色譜法(ISC)(ISC)分離機(jī)制分離機(jī)制：通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的：通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pHpH，抑制組分離解，抑制組分離解，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸，弱堿的目的弱堿的目的適用范圍：適用范圍：3.0pK3.0pKa a7.0 7.0 的弱酸的弱酸 7.0pK7.0pKa a8.0 8.0 的弱堿的弱堿抑制劑抑制劑: : 弱酸（弱酸（HAcHAc）、弱堿（）、弱堿（NHNH3 3H H2 2O O）或緩沖液）或緩沖液 返回章目錄HPLC概述概述1

12、1基本原理基本原理2 2各類高效液相色譜法各類高效液相色譜法3 3固定相固定相4 4流動(dòng)相流動(dòng)相5 5高效液相色譜儀高效液相色譜儀6 6返回章目錄四、固定相四、固定相v 液液- -固色譜固定相固色譜固定相v 載體：載體： 硅膠硅膠無(wú)定形全多孔硅膠無(wú)定形全多孔硅膠YWGYWG球形全多孔硅膠球形全多孔硅膠YQGYQG 高分子多孔微球高分子多孔微球YSGYSG特點(diǎn)：柱選擇性好，峰形好，柱效低特點(diǎn)：柱選擇性好，峰形好，柱效低 返回章目錄四、固定相四、固定相v 化學(xué)鍵合相化學(xué)鍵合相特點(diǎn)特點(diǎn)： 不易流失不易流失；熱穩(wěn)定性好；化學(xué)性能穩(wěn)定熱穩(wěn)定性好；化學(xué)性能穩(wěn)定 載樣量大；適于梯度洗脫載樣量大；適于梯度洗脫

13、分類分類：非極性鍵合相：非極性鍵合相：ODSODS中等極性鍵合相：醚基鍵合相中等極性鍵合相：醚基鍵合相極性鍵合相：氨基、氯基鍵合相極性鍵合相：氨基、氯基鍵合相返回章目錄四、固定相四、固定相v 非極性鍵合相：非極性鍵合相：ODSODS 載體：全多孔載體：全多孔YWGYWG，YQGYQG、堆積硅球、堆積硅球 表面覆蓋度：表面覆蓋度： 參加反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。 其大小，決定鍵合相是分配還是吸附占主導(dǎo)作用。 鍵合基團(tuán)鍵長(zhǎng)：鍵長(zhǎng)鍵合基團(tuán)鍵長(zhǎng)：鍵長(zhǎng)，載樣量，載樣量，kk 返回章目錄HPLC概述概述1 1基本原理基本原理2 2各類高效液相色譜法各類高效液相色譜法3 3固定相固定相4

14、4流動(dòng)相流動(dòng)相5 5高效液相色譜儀高效液相色譜儀6 6返回章目錄五、流動(dòng)相五、流動(dòng)相v 要求：要求： 與固定液不反應(yīng)；對(duì)樣品有良好溶解度與固定液不反應(yīng)；對(duì)樣品有良好溶解度 粘度??；與檢測(cè)器匹配粘度小；與檢測(cè)器匹配22114kknR 與固定相性質(zhì)和流動(dòng)相種類有關(guān)與固定相性質(zhì)和流動(dòng)相種類有關(guān) k 與流動(dòng)相配比有關(guān)與流動(dòng)相配比有關(guān)返回章目錄五、流動(dòng)相五、流動(dòng)相v 正相洗脫正相洗脫流動(dòng)相的極性小于固定相的洗脫流動(dòng)相的極性小于固定相的洗脫v 反相洗脫反相洗脫流動(dòng)相的極性大于固定相的洗脫流動(dòng)相的極性大于固定相的洗脫v 洗脫方式：洗脫方式：等度洗脫(isocratic elution)恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫

15、梯度洗脫(gradient elution)在一個(gè)分析周期內(nèi)不斷改變流動(dòng)相的比例返回章目錄五、流動(dòng)相五、流動(dòng)相 返回章目錄HPLC概述概述1 1基本原理基本原理2 2各類高效液相色譜法各類高效液相色譜法3 3固定相固定相4 4流動(dòng)相流動(dòng)相5 5高效液相色譜儀高效液相色譜儀6 6返回章目錄六、高效液相色譜儀六、高效液相色譜儀輸液泵輸液泵進(jìn)樣器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱檢測(cè)器檢測(cè)器工作站工作站高效液相色譜儀高效液相色譜儀HPLC返回章目錄六、高效液相色譜儀六、高效液相色譜儀v 輸液泵輸液泵進(jìn)樣器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱檢測(cè)器檢測(cè)器工作站工作站 泵：恒壓泵恒流泵:柱塞往復(fù)泵返回章目錄六、高效液相色譜儀六、高效液相

16、色譜儀Agilent Agilent 二元泵示意圖二元泵示意圖返回章目錄六、高效液相色譜儀六、高效液相色譜儀v 輸液泵輸液泵進(jìn)樣器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱檢測(cè)器檢測(cè)器工作站工作站返回章目錄六、高效液相色譜儀六、高效液相色譜儀v 輸液泵輸液泵進(jìn)樣器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱檢測(cè)器檢測(cè)器工作站工作站 色譜柱：由柱管色譜柱：由柱管( (不銹鋼管不銹鋼管) )和固定相組成和固定相組成 分析柱分析柱 2-4.6mm L 10-25cm 常量柱常量柱 1-1.5mm L 10-20cm 常微量柱常微量柱 制備柱制備柱 20-50mm L 3-25cm 返回章目錄六、高效液相色譜儀六、高效液相色譜儀v輸液泵輸液泵進(jìn)樣器進(jìn)

17、樣器色譜柱色譜柱檢測(cè)器檢測(cè)器工作站工作站檢測(cè)器檢測(cè)器: :紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器其它檢測(cè)器其它檢測(cè)器返回章目錄六、高效液相色譜儀六、高效液相色譜儀v 輸液泵輸液泵進(jìn)樣器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱檢測(cè)器檢測(cè)器工作站工作站返回章目錄六、高效液相色譜儀六、高效液相色譜儀T/min波長(zhǎng)波長(zhǎng)(nm)色譜光譜圖色譜光譜圖返回章目錄六、高效液相色譜儀六、高效液相色譜儀v 輸液泵輸液泵進(jìn)樣器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱檢測(cè)器檢測(cè)器工作站工作站2489UVD2489UVD2414RID2414RID2424ELSD2424ELSD2465ECD2465ECDWATERSWATER

18、SWATERSWATERS返回章目錄六、高效液相色譜儀六、高效液相色譜儀v超高效液相色譜儀()返回章目錄小結(jié)熟悉掌握了解HPLC的特點(diǎn).HPLC的儀器結(jié)構(gòu)及各部件.HPLC中色譜條件的選擇.化學(xué)鍵合相色譜法.范氏方程在HPLC的表達(dá)形式.分離度影響因素正相色譜和反相色譜.返回章目錄習(xí)題及解答習(xí)題及解答3. HPLC3. HPLC流動(dòng)相的流動(dòng)相的pHpH值應(yīng)控制為值應(yīng)控制為_(kāi) 小于小于H = A + CuH = A + Cu2-82-81. 1. 反相色譜中固定相的極性反相色譜中固定相的極性 流動(dòng)相的極性流動(dòng)相的極性. .2. HPLC2. HPLC中范氏方程的表達(dá)式為中范氏方程的表達(dá)式為: :

19、 _填空題：填空題：返回章目錄習(xí)題及解答習(xí)題及解答1. 1. 鍵合相的鍵合基團(tuán)的碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)后鍵合相的鍵合基團(tuán)的碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)后 ( ( ) )A.A.極性減少極性減少 B.B.極性增大極性增大 C.C.載樣量增大載樣量增大 D.D.載樣量減少載樣量減少2. 2. 提高色譜柱柱效的可行方法是提高色譜柱柱效的可行方法是 ( )( )A.A.選擇小粒度的固定相選擇小粒度的固定相 B.B.降低固定相的粒度分布降低固定相的粒度分布C.C.選擇球形固定相選擇球形固定相 D.D.勻漿裝柱勻漿裝柱E.E.增加柱長(zhǎng)增加柱長(zhǎng) F.F.選擇適宜流動(dòng)相選擇適宜流動(dòng)相G.G.降低流速降低流速ACABCD選擇題：選擇題：

20、返回章目錄習(xí)題及解答習(xí)題及解答計(jì)算題：計(jì)算題：1. 用用15 cm長(zhǎng)的長(zhǎng)的ODS柱分離兩個(gè)組分，已知在實(shí)驗(yàn)條件下柱分離兩個(gè)組分，已知在實(shí)驗(yàn)條件下柱效柱效 n=2.84104 m-1，用苯磺酸溶液測(cè)得死時(shí)間，用苯磺酸溶液測(cè)得死時(shí)間 t0=1.31 min，測(cè)得，測(cè)得tR1=4.10 min及及tR2=4.38 min。求：（求：（1）k1、k2 、R； （2）若增加柱長(zhǎng)至）若增加柱長(zhǎng)至30cm，分離度可否達(dá)到，分離度可否達(dá)到1.5？返回章目錄習(xí)題及解答習(xí)題及解答解：（解：（1） 同理：同理：24.381.312.341.31k212.341.102.13kk2211.041knRk（2）211222RLRL2221.00.150.30R21.4R13. 231. 131. 110. 4000111tttttkRR返回章目錄分析化學(xué)教研室