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______________________________________________________________________________________________________________ TiO2納米管載pH響應(yīng)型膠束藥物控釋體系的研究 (面上項(xiàng)目) 1、立項(xiàng)的背景和意義 牙列缺損及牙列缺失是口腔患者的常見病、多發(fā)病，不僅直接降低患者的咀嚼效率，同時(shí)對患者的顏面部外形、全口牙齒咬合的穩(wěn)定性、全身營養(yǎng)的均衡都有一定的影響。隨著生活質(zhì)量水平的不斷提高,人們對牙齒修復(fù)體的要求已經(jīng)不僅僅是滿足于簡單的咀嚼功能的恢復(fù)，更要求在修復(fù)過程中不損傷天然牙，修復(fù)體更舒適，修復(fù)牙齒更逼真等。因此，以鈦材為基礎(chǔ)的骨內(nèi)種植技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，成為牙列缺損、牙列缺失和頜面部缺損最有效的修復(fù)手段之一，種植義齒以其不損傷臨牙，美觀，咀嚼功能強(qiáng)等不可替代的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)作為牙列缺損及缺失重要的修復(fù)方式被廣泛應(yīng)用于口腔臨床治療。 隨著優(yōu)質(zhì)鈦合金的出現(xiàn)及鈦合金表面改性技術(shù)的發(fā)展，鈦合金以其優(yōu)異的綜合性能（良好的生物相容性、機(jī)械強(qiáng)度、鈍化能力、抗腐蝕性、與骨組織相近的低彈性模量等）成為牙種植體、頜面贗復(fù)體固定樁、骨內(nèi)植入式假肢以及各種矯形材料等人體硬組織替代物和修復(fù)物的首選材料。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年我國植入牙種植體數(shù)百萬顆，人工關(guān)節(jié)、脊柱裝置、冠脈支架數(shù)十萬件，骨折內(nèi)固定器械數(shù)百萬套。然而，由此引起的植入物相關(guān)性感染問題也逐漸凸顯出來，成為臨床上一個(gè)非常棘手的問題[1]。牙種植體由植體、穿齦部分及上部結(jié)構(gòu)三部分組成，植體材料基本為商業(yè)純鈦或TC4鈦合金，鈦植體經(jīng)應(yīng)力分析對材料形態(tài)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)，表面采用不同技術(shù)處理以增大比表面積及使其在體內(nèi)容易形成類骨磷灰石（BLA）層，已實(shí)現(xiàn)材料與骨的化學(xué)性鍵合，其抗剪切力達(dá)50Mpa以上，完全可滿足負(fù)重、承載修復(fù)體的應(yīng)用要求；上部結(jié)構(gòu)的修復(fù)可根據(jù)不同口腔情況的要求，基本實(shí)現(xiàn)形態(tài)和功能并舉的目標(biāo)。但在實(shí)際應(yīng)用中，牙種植體仍有較高失敗率，其基本表現(xiàn)為牙齦附著下移或牙周袋形成，牙槽骨吸收，最終種植體松動、脫落。大量報(bào)道對種植體失敗的原因進(jìn)行了分析，除應(yīng)力過載或屏蔽致骨吸收外，種植體周圍炎的發(fā)生和發(fā)展是其最終失敗的重要表現(xiàn)和主要原因。因此，尋找有效的方法消除種植體相關(guān)感染具有非常重要的臨床意義，對鈦合金種植體進(jìn)行表面改性研究十分必要。 種植體表面易感染的主要有兩方面原因：一、表面生物膜的形成；二、種植體/組織界面免疫能力低下。鈦種植體在生理環(huán)境下其表面會吸附一層蛋白層，使鈦表面適合于細(xì)菌聚集和生物膜形成[2-3]。生物膜是指附著在物質(zhì)表面的微生物實(shí)體，是細(xì)菌在復(fù)雜多變的環(huán)境中，產(chǎn)生外部多糖包膜多聚體，使細(xì)菌相互粘連形成膜狀物，它可以通過多種機(jī)制保護(hù)其內(nèi)部的細(xì)菌不受攻擊[3]。此外，在種植體植入后的早期，種植體/組織界面血管分布量較少，防御能力較低，有利于細(xì)菌入侵從而發(fā)生感染。種植體手術(shù)的病人臨床上常規(guī)會給予全身抗生素預(yù)防性治療以阻止感染的發(fā)生[4,5]。然而，全身抗生素給藥具有許多缺點(diǎn)，如靶點(diǎn)藥物濃度低和全身毒副作用等。因此，從這些角度考慮局部抗生素給藥更有優(yōu)勢。目前已有多種方法實(shí)現(xiàn)植入體表面局部緩釋給藥，如在種植體表面制備各種涂層[6-7]，采用共價(jià)結(jié)合的方法將藥物固定在鈦表面等方法[8]；但是這些緩釋方法存在藥物載量少，且涂層易剝脫等缺點(diǎn)。 近年來一種新的局部藥物緩釋設(shè)計(jì)理念是在鈦種植體表面用陽極氧化法形成TiO2（二氧化鈦）納米級小管作為局部“藥物納米儲存緩釋器”，為種植體局部藥物緩釋提供了新思路[9]。藥物在TiO2 納米管中的釋放主要受管孔結(jié)構(gòu)支配（直徑和長度比），納米管長徑比對于藥物釋放率起著決定性作用，可以有效延遲或加速藥物釋放［10］。目前延長藥物釋放的方法主要是減小TiO2 納米管徑，通過降低藥物釋放率來延長釋放持續(xù)時(shí)間，但是此法存在降低藥物裝載總量、納米管直徑調(diào)控范圍有限（20-300nm），“突釋”現(xiàn)象明顯以及很難滿足長時(shí)間（數(shù)周）藥物連續(xù)釋放的臨床需求等缺點(diǎn)［11］。因此，如何增加可控孔徑范圍內(nèi)TiO2納米管的藥物裝載總量，達(dá)到藥物緩釋的可控性，實(shí)現(xiàn)植入體表面緩釋給藥從而達(dá)到有效控制種植體周圍炎十分重要。 近年來，生物可降解聚合物膠束作為納米藥物載體備受矚目[12-14]。它能包裹疏水性藥物，提高藥物在水中的溶解度，延長藥物在體液中的循環(huán)時(shí)間．另外，聚合物膠束的尺寸一般為10～200nm，處于TiO2納米管直徑調(diào)控范圍之內(nèi)（20-300nm），裝載入TiO2納米管內(nèi)可以避免聚合物膠束過早地 被腎臟清除和機(jī)體免疫系統(tǒng)吞噬，局部用藥可降低全身藥物副作用和改善藥物利用率[15]．值得注意的是，單純TiO2納米管裝載聚合物膠束無法控制藥物的釋放量為靶向位點(diǎn)提供有效的藥物濃度。刺激響應(yīng)性膠束可根據(jù)內(nèi)部刺激（如pH、氧化還原電位、溶酶體酶）或外部刺激（如溫度、磁場、光）快速響應(yīng)，如溶解、溶脹或坍塌，從而達(dá)到在合適時(shí)間釋放藥物的目的，提高治療療效。在這些刺激中，pH響應(yīng)性是使用最廣泛的, 在正常人體組織，ph值在7.4，某些病理狀態(tài)(如炎癥)下，病灶組織局部由于缺氧導(dǎo)致無氧代謝而被酸化，pH值降低，在種植體穿齦或穿皮部位，由與細(xì)菌大量產(chǎn)酸，在菌斑內(nèi)ph值甚至低至5.5。因此，低pH值被視為炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志之一。因此，我們可以利用正常組織和炎癥組織的ph值差異，設(shè)計(jì)一種能對環(huán)境中pH值做出響應(yīng)的TiO2納米管加載聚合物膠束的藥物緩釋系統(tǒng)。 綜上所述，充分利用TiO2納米管結(jié)構(gòu)的可控性、聚合物膠束良好的穩(wěn)定性、藥物包封率及腙鍵的pH響應(yīng)性能等優(yōu)勢，結(jié)合兩者的優(yōu)勢對鈦基體表面進(jìn)行改性研究，從而達(dá)到鈦種植體表面pH智能響應(yīng)型藥物緩釋的目的，降低藥物全身副作用，改善藥物利用率。本項(xiàng)目在前期已成功采用陽極氧化法在純鈦基體表面制備TiO2納米管陣列，針對不同電壓、電解質(zhì)濃度、陽極氧化時(shí)間等因素對制備不同管徑、長度TiO2納米管陣列的影響做了初步的實(shí)驗(yàn)和探討，確定參數(shù)后制備結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的TiO2納米管，采用簡易真空凍干法成功在TiO2納米管內(nèi)直接加載阿莫西林，通過SEM、XRD、EDS觀測等手段對TiO2納米管進(jìn)行表面觀測及結(jié)構(gòu)表征，同時(shí)在緩沖溶液中模擬體外藥物釋放，證實(shí)了鈦表面TiO2納米管結(jié)構(gòu)直接裝載藥物呈現(xiàn)出藥物“突釋”現(xiàn)象，本項(xiàng)目擬在前期研究基礎(chǔ)上，采用聚合物膠束良好的藥物包封率和pH智能響應(yīng)的優(yōu)勢，改善TiO2納米管載藥“突釋”現(xiàn)象，從而建立一種新型種植體周抗炎藥物緩釋體系并實(shí)現(xiàn)釋放速率的調(diào)控，模擬正常生理過程中出現(xiàn)種植體周圍炎時(shí)藥物的響應(yīng)性釋放，最大限度的降低種植體周圍炎對種植體初期愈合產(chǎn)生的不良影響，促進(jìn)種植體早期愈合、提植成功率。 2、國內(nèi)外現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢 陽極氧化是指金屬或合金的電化學(xué)氧化。在相應(yīng)的電解液和特定的工藝條件下，由于外加電流的作用下，將金屬或合金的制件作為陽極，采用電解的方法使其表面形成氧化物薄膜。雖然陽極氧化的歷史已經(jīng)超過50年，但直到1995年，人們發(fā)現(xiàn)通過優(yōu)化陽極氧化條件可以形成高度有序孔陣列的氧化膜。1999年，Zwilling[16]等第一次報(bào)道了在含氟離子溶液中，鈦表面經(jīng)過電化學(xué)陽極氧化得到TiO2納米管陣列。TiO2納米管制備設(shè)備要求較低，并可通過調(diào)整制備電壓、電解質(zhì)濃度、陽極氧化時(shí)間、pH值等參數(shù)獲得一定管徑和管長的TiO2納米管陣列，具有很好的生物相容性。目前TiO2納米管陣列已廣泛用于種植體表面處理方面的研究。 近年來，在鈦種植體表面用陽極氧化法形成TiO2納米級小管作為局部“藥物納米儲存緩釋器”為種植體局部藥物緩釋提供了新思路。TiO2納米管的制備是鈦金屬基片通過在電解質(zhì)溶液中陽極腐蝕而獲得納米級小管，這種方法可以制得排列整齊的納米管陣列，且納米管與基體金屬直接相連，結(jié)合非常牢固。TiO2納米管具有良好的生物相容性，且其納米管狀結(jié)構(gòu)有利于藥物裝載和緩釋，已經(jīng)使用TiO2納米管實(shí)現(xiàn)藥物緩釋[17]。藥物在TiO2 納米管中的釋放動力學(xué)主要受孔結(jié)構(gòu)支配（直徑和長度比），納米管長徑比對于藥物釋放率起著決定性作用，可以有效延遲或加速藥物釋放［17］。目前延長藥物釋放的方法主要是減小TiO2 納米管徑，通過降低藥物釋放率來延長釋放持續(xù)時(shí)間，此法存在降低藥物裝載總量、“突釋”現(xiàn)象明顯以及很難以滿足長時(shí)間（數(shù)周）藥物緩釋的臨床需求等缺點(diǎn)［18］。 一些學(xué)者用各種方法對鈦納米管藥物緩釋進(jìn)行調(diào)控。如采用PLGA和殼聚糖對鈦納米管管口進(jìn)行封閉藥物可以以零級速率緩釋達(dá)6-8周。還有一些學(xué)者采用電化學(xué)沉積法將羥基磷灰石沉積于鈦納米管管口，大大延緩了藥物的釋放速率。目前這些調(diào)控緩釋的方法僅僅是針對早期的藥物突釋進(jìn)行調(diào)控，這些緩釋系統(tǒng)不能對組織的微環(huán)境做出反應(yīng)，不管種植體周圍組織是否存在感染，抗菌藥物都按既定的方式進(jìn)行釋放。 在正常生理狀態(tài)下，人體組織環(huán)境處于pH=7.4，某些病理狀態(tài)(如炎癥)下，病灶組織局部由于缺氧導(dǎo)致無氧代謝而被酸化，pH值降低，在種植體穿齦部位，由于細(xì)菌大量產(chǎn)酸，在菌斑內(nèi)pH值甚至低至5.5。因此，可以將低pH值作為炎癥狀態(tài)的一種典型特點(diǎn)，充分利用炎癥狀態(tài)與正常生理組織環(huán)境下pH值的差異，設(shè)計(jì)一種對pH響應(yīng)敏感的種植體表面改性體系。 近年來，生物可降解膠束作為納米藥物載體備受矚目。聚合物膠束是一類由兩親性共聚物在水溶液中通過自組裝形成的納米粒子，親脂性的藥物分子能通過物理包裹進(jìn)入膠束的疏水內(nèi)核，而親水的殼層用來穩(wěn)定膠束，聚合物膠束具有良好的生物相容性和生物可降解性。聚乙二醇（PEG）和聚（ε-己內(nèi)酯）（PCL）是具有生物可降解性和良好生物相容性的材料，并已獲得FDA批準(zhǔn)．由PEG-PCL嵌段共聚物自組裝形成的膠束作為納米藥物載體尤為常見．但其存在降解緩慢和無刺激響應(yīng)性等缺陷，從而阻礙了藥物在靶向部位高效累積，降低了藥物的有效利用率。 目前，已有大量基于酸敏感鍵（原酸酯、腙和縮醛等）的ｐＨ響應(yīng)性膠束的研究。其中，特別是腙鍵，它在中性條件下穩(wěn)定，酸性環(huán)境中容易水解，并被廣泛用于連接聚合物主鏈和各種活性治療藥物．在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中，腙鍵常被用到pH敏感聚合物膠束中，且能在酸催化下快速水解，其結(jié)構(gòu)合成簡單，對酸靈敏度高，最常被用來作為pH敏感藥物載體的酸可裂解官能團(tuán)。Wang等[19]報(bào)道了葉酸和細(xì)胞穿透肽R7修飾的含腙鍵PLGA-mPEG膠束，負(fù)載硫酸長春堿以后，在pH=7.4條件下8 h內(nèi)釋放了35.8%. 而在pH=5.0條件下8h內(nèi)釋放了65.6%.說明載藥膠束釋放呈pH依賴性。因此，充分利用官能團(tuán)腙鍵敏感的pH響應(yīng)特點(diǎn)，結(jié)合PEG-PCL嵌段共聚物良好的生物相容性和生物可降解性，將其共聚物載藥后裝載入鈦表面TiO2納米管內(nèi)，從而可獲得一種具有pH智能響應(yīng)的藥物緩釋體系。 參考文獻(xiàn) [1] Campoccia D, Montanaro L, Arciola CR. 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Mol Pharmaceutics, 2014, 11(3): 885-894. 3、研究內(nèi)容、研究目標(biāo)、擬解決的問題和今后研究思路 （一）研究內(nèi)容 1.微結(jié)構(gòu)的制備：采用陽極氧化法在Ti表面制備不同管徑、長度的TiO2納米管，構(gòu)建PEG-NH-N=CH-PCL聚合物膠束裝載的載體（已部分完成） ①在含NH4F，H2O 和甘油的電解液中通過陽極氧化法在鈦表面制備TiO2 納米管陣列。 ②對TiO2 納米管陣列進(jìn)行表征。 2.制備PEG-NH-N=CH-PCL聚合物膠束并載藥 ①利用具有生物相容性和生物可降解的PEG和PCL作為原料，采用開環(huán)聚合方法，合成PEG-NH-N=CH-PCL嵌段共聚物，并將腙鍵引入到PEG-NH-N=CH-PCL的主鏈上，并以此為構(gòu)筑單元制備共聚物膠束。 ②取一定量的PEG-NH-N=CH-PCL和阿莫西林溶于Ｎ，Ｎ-二甲基甲酰胺（DMF）中，超聲溶解后滴入磷酸鹽緩沖溶液后離心處理，冷凍干燥上層清液得到載藥膠束。 ③采用動態(tài)光散射（DLS）測量聚合物膠束的粒徑及粒徑分布．通過透射電鏡（TEM）觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，利用核磁共振證實(shí)腙鍵的成功引入，用UV/Vis可見光譜檢測230nm激發(fā)波長處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算包封率和載藥量。 3.采用真空凍干法裝載聚合物膠束 ①在TiO2納米管內(nèi)裝載已完成藥物包封的PEG-NH-N=CH-PCL膠束。 ②在體外模擬體液中研究PEG-NH-N=CH-PCL膠束的pH智能響應(yīng)性釋放，通過改變TiO2納米管管徑比，選出能最大程度裝載聚合物膠束的制備參數(shù)。 4.生物學(xué)評價(jià) （1）體外細(xì)胞學(xué)評價(jià) 對加載了含阿莫西林的pH響應(yīng)型聚合物膠束的TiO2納米管進(jìn)行生物相容性評價(jià)，以及體外模擬炎癥環(huán)境下藥物緩釋對于種植體周圍炎中常見致病菌中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用。 （二）研究目標(biāo) 本課題的主要目標(biāo)是成功構(gòu)建一種安全、有效的種植體周pH響應(yīng)型局部緩釋給藥系統(tǒng)，以獲得最大限度裝載阿莫西林及聚合物膠束，充分發(fā)揮聚合物膠束pH智能響應(yīng)型釋放藥物的優(yōu)勢，模擬種植體周圍炎情況下的低pH 環(huán)境，最大限度的提高藥物利用率，保證種植體的穩(wěn)定性，提高種植成功率。其中包涵以下任務(wù)： （1）成功構(gòu)建一種安全、有效的種植體周局部緩釋給藥系統(tǒng)，獲得TiO2納米管加載聚合物膠束實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)性釋放藥物的效果。 （2）體外模擬試驗(yàn)證實(shí)TiO2納米管加載聚合物膠束pH響應(yīng)型釋放藥物，抑制種植體周圍炎的發(fā)生發(fā)展，提高種植成功率。 （三）擬解決的問題 如何控制聚合物膠束的粒徑和TiO2納米管管徑及管長，以期可以達(dá)到最大載藥量和包封率的同時(shí)，保證TiO2納米管的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，是本項(xiàng)目亟需解決的問題。 （四）今后研究思路 利用本課題的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)一步探討種植體周輔助給藥應(yīng)用，進(jìn)一步研制更加“智能”的種植體藥物緩控釋系統(tǒng)，如不需要時(shí)藥物不會從TiO2 納米管中釋放，而情況需要時(shí)在某種因素刺激下藥物可以按我們設(shè)定的釋放動力學(xué)藥從TiO2 納米管中釋放。并進(jìn)一步開展體內(nèi)試驗(yàn)研究，為其應(yīng)用于種植臨床奠定基礎(chǔ)。 在完成本課題的研究內(nèi)容后，將申報(bào)浙江省自然科學(xué)基金以獲得資金資助，使研究工作繼續(xù)發(fā)展，推動種植體周輔助給藥領(lǐng)域的進(jìn)步。 4、研究方法、技術(shù)路線和進(jìn)度安排 （一）研究方法 ①陽極氧化法法制備TiO2 納米管陣列及表征 材料：純鈦片1mm×2mm×0.5mm。 電解液：0.50wt% NH4F+ 10vol% H2O 的甘油溶液。 DH1715A-5 型直流穩(wěn)壓電源提供陽極氧化所需電源, 在20~60V 電壓下陽極氧化一定時(shí)間后，立即取出樣品用二次水超聲清洗并晾干。 表征：場發(fā)射掃描電鏡（SEM）和透射電鏡(TEM)觀察分析試樣表面形貌和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并利用X 射線能量色散譜( EDS) 分析TiO2 納米管組試樣表面元素組成。 ②開環(huán)聚合法制備PEG-NH-N=CH-PCL膠束及表征 1.1　試劑 聚乙二醇（PEG，Mn＝5000）、對硝基苯基氯甲酸酯（NPCF）、對羥基苯甲醛（PHB）、ε-己內(nèi)酯（ε-CL）、阿莫西林、吡啶、水合肼、鋅酸亞錫（阿拉試劑公司）；二氯甲烷（CH2Cl2）、二甲基亞砜（DMSO）、Ｎ，Ｎ-二甲基甲酰胺（DMF）（北京化工廠）；其他為常用分析純試劑． 1.2　 PEG-NPCF的合成 稱取PEG（100mg，0.02mmol)溶于20mLCH2Cl2中，用微量進(jìn)樣器向該反應(yīng)體系中加入16.11μL吡啶，不斷攪拌直至溶解．將５mL　 NPCF（200mg，0.99mmol）的CH2Cl2溶液逐滴加入到反應(yīng)體系中，攪拌24h，控制整個(gè)反應(yīng)過程的溫度為０℃．反應(yīng)后，濃縮反應(yīng)液并用石油醚、乙酸乙酯沉淀，重復(fù)操作３次后，真空干燥至恒重，即得白色固體PEG-NPCF。 1.3 PEG-NH-NH2的合成 稱取PEG-NPCF（100mg，0.02mmol）溶于10mL無水乙醇，將29.10μL水合肼逐滴滴加到反應(yīng)體系中，90℃回流攪拌48h．冷卻至室溫后，濃縮反應(yīng)液，加入石油醚、乙酸乙酯，使沉淀析出，用無水乙醇洗滌沉淀，重復(fù)操作３次后，真空干燥即得淡黃色固體PEG-NH-NH2。 1.4 PEG-NH-N=CH-OH的合成 稱取PEG-NH-NH2（200mg，0.04mmol），PHB（20mg，0.016mmol）置于Schlenk瓶中，用４mL的DMSO溶解，加入１滴無水乙酸，抽真空充氮?dú)庋h(huán)３～５次，密封Schlenk瓶，于65℃攪拌反應(yīng)４８ｈ．用石油醚、乙酸乙酯沉淀，過濾，重復(fù)操作３次后，真空干燥即得白色固體． 1.5 PEG-NH-N=CH-PCL的合成 在Schlenk瓶中，將PEG-NH-N=CH-OH（100mg，0.02mmol），ε-CL（130mg，1.14mmol），鋅酸亞錫（20.25mg，0.05mmol）溶于5mL甲苯中，抽真空充氮?dú)庋h(huán)３～５次，于110℃攪拌反應(yīng)24h．冷卻至室溫后，加入適量氯仿使反應(yīng)物完全溶解，用冷乙醚沉淀，過濾，真空干燥即得淡黃色固體PEG-NH-N=CH-PCL。 1.6　聚合物膠束的自組裝 將10mg聚合物加入到1mlDMF中，超聲直至溶解，然后逐滴滴加（１滴/15s）10ml蒸餾水，室溫?cái)嚢?4h后即得穩(wěn)定的聚合物膠束．取5mL膠束溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（MWCO3000）中，用蒸餾水透析48h，即得空白聚合物膠束。37℃條件下，采用動態(tài)光散射（DLS）測量聚合物膠束的粒徑及粒徑分布．通過透射電鏡(TEM)觀察聚合物膠束的形態(tài)結(jié)構(gòu)．將透析得到的聚合物膠束滴在銅網(wǎng)表面，放在紅外燈下，待干燥后，采用TEM檢測，加速電壓為200kV。 1.7　載藥膠束的制備與體外釋放 將5mg PEG-NH-N=CH-PCL和2mg阿莫西林溶于0.5mL DMF中，超聲直至溶解，然后向溶液中逐滴滴加(1滴/15s)5mL磷酸鹽緩沖溶液（pH7.4），室溫下攪拌24h．將載藥膠束溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（MWCO30000）中，在磷酸鹽緩沖溶液（pH7.4）中透析48h，在12000r/min下離心15min，冷凍干燥上層清液得到載藥膠束，整個(gè)過程在避光條件下進(jìn)行．配制不同濃度的阿莫西林溶液，在37℃下，用UV/Vis可見光譜檢測230nm激發(fā)波長處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．為了測量載藥量，將凍干的載藥膠束溶于DMF中，檢測其在230nm處的吸光度值，并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，包封率和載藥量的計(jì)算公式如下： 包封率=（負(fù)載到膠束中阿莫西林的質(zhì)量/投入藥質(zhì)量）×100%載藥量=（負(fù)載到膠束中阿莫西林的質(zhì)量/載藥膠束質(zhì)量）×100% ③真空凍干法加載PEG-NH-N=CH-PCL膠束至TiO2納米管及表征 用PBS溶液將PEG-NH-N=CH-PCL膠束配制成0.5mg/mL的溶液。在清洗并干燥完成的二氧化鈦納米管表面加載PEG-NH-N=CH-PCL膠束。每次在二氧化鈦納米管表面移液管滴加10μL PEG-NH-N=CH-PCL膠束溶液，盡量鋪勻整個(gè)表面。然后將試樣放入凍干機(jī)中，在溫度設(shè)定為室溫，抽真空，干燥2h。重復(fù)上述加載步驟，直到每片試樣加載到100ug(A組，n=5) 或每片加載到200 ug (B組，n=5)。在最后一次加載蛋白干燥后，每一試樣用移液管吸取500μL PBS 快速沖洗表面，移除未與納米管牢固結(jié)合多余的BSA。收集沖洗液，保存用于后續(xù)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。加載量D1，沖洗下來的量是D2，那么加載效率為: η=(D1-D2)/D1。 ④體外模擬炎癥狀態(tài)下阿莫西林釋放測試 將試樣放入24孔板中，500μL SBF 中浸泡，分兩組，分別為pH7.4和5.5，置于每分鐘70轉(zhuǎn)的搖床上，在一定時(shí)間間隔內(nèi)（1h、3h、5h、10h、24h、3d、5d、7d、10d、20d、30d、40d、50d）收集200μL液體備用，再加入新鮮的200μL SBF 。收集的液體用ELISA法檢測濃度，計(jì)算釋放的劑量，繪制釋放曲線。 ⑤ 抗菌性能檢測 將載有含阿莫西林的聚合物膠束組、對照組（僅裝載阿莫西林）、空白對照組（不裝載藥物）的鈦片裁成1mm×1mm 大小，每組個(gè)三個(gè)樣本，滅菌放置，備用。再將金黃色葡萄球菌接種于三組材料表面培養(yǎng)24小時(shí)，將洗脫液于瓊脂平板上均勻推開，需氧培養(yǎng)24小時(shí)后平板計(jì)數(shù)。 抗菌率=[(對照組菌落數(shù)cfu-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)cfu)/對照組菌落數(shù)cfu]×100% （二）技術(shù)路線 純鈦片 陽極氧化 TiO2納米管陣列 PEG-NH-N=CH-PCL膠束 真空凍干法 載藥TiO2納米管陣列 采用對照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行抗菌性能檢測 在體外模擬體液中研究阿莫西林的pH響應(yīng)型釋放動力學(xué) （三）進(jìn)度安排 第一年度（2018.1-2018.12）： 1. 資料收集，調(diào)研、課題設(shè)計(jì)完善； 2．TiO2納米管陣列制備及檢測 3.pH響應(yīng)型PEG-NH-N=CH-PCL膠束制備及其表征 第二年度（2019.1-2019.12）： 1.完成TiO2納米管內(nèi)PEG-NH-N=CH-PCL膠束裝載 2. TiO2納米管負(fù)載PEG-NH-N=CH-PCL膠束性能檢測 3.載阿莫西林聚合物膠束的緩釋動力學(xué)研究及其調(diào)控 第三年度（2020.1-2020.12）： 1.細(xì)胞生物學(xué)評價(jià)及抗菌性能檢測 2.結(jié)果分析，綜合評價(jià)，課題結(jié)題，成果鑒定 5、主要創(chuàng)新點(diǎn) 本課題針對目前鈦種植體表面抗菌藥物緩釋存在的問題，設(shè)計(jì)了一種新型的智能藥物緩釋系統(tǒng)，利用炎癥和正常組織的PH差異，實(shí)現(xiàn)種植體微環(huán)境對抗菌藥物釋放的智能調(diào)控；改變了目前鈦種植體表面藥物緩釋系統(tǒng)僅僅按照既定程序釋放而不能對組織微環(huán)境作出相應(yīng)響應(yīng)的缺點(diǎn)，提高抗菌效率。在鈦納米管表面實(shí)現(xiàn)PH響應(yīng)的藥物緩釋系統(tǒng)，為種植體體表面生化修飾和藥物緩釋提供了新思路。 6、項(xiàng)目預(yù)期成果、考核指標(biāo) 1.成功將腙鍵引入到兩親性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL的主鏈上，實(shí)現(xiàn)聚合物的pH響應(yīng)特性，制備載藥膠束。 2．明確載藥膠束最大程度的裝載入TiO2納米管內(nèi)，并實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)型藥物緩釋。 3.鈦種植體均具有良好的生物相容性，不影響鈦種植體表面的生物礦化和細(xì)胞活力。 4.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在炎癥狀態(tài)下ph響應(yīng)藥物緩釋系統(tǒng)有更好的抗菌效果，更有利于炎癥狀態(tài)下，種植體周圍骨結(jié)合。5.在國內(nèi)外核心期刊上發(fā)表論文2篇，其中SCI源刊文章1篇，申請國家發(fā)明專利1項(xiàng)。 7、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)和條件 (1)課題組人員組成及實(shí)驗(yàn)室條件 項(xiàng)目申請者長期從事口腔相關(guān)生物材料研究，已經(jīng)在Carbonhydrate Polymers(IF=3.628), International Journal of Molecular Sciences（IF=2.453), Advanced Materials Research，《中國組織工程醫(yī)學(xué)研究》、《口腔醫(yī)學(xué)研究》發(fā)表文章數(shù)篇，其中以第一作者發(fā)表SCI論文3篇，以通訊作者發(fā)表EI論文1篇，具有一定的生物材料研究經(jīng)驗(yàn)。項(xiàng)目組成員均具有生物材料研究經(jīng)驗(yàn)，發(fā)表多篇論文。 申請者所在口腔材料研究所一貫強(qiáng)調(diào)口腔醫(yī)學(xué)特色，以牙頜面修復(fù)重建為研究主線，開展生物材料研制和評價(jià)，先后承擔(dān)國家、部省級課題多項(xiàng)。本課題組前期研究為本項(xiàng)目鈦表面改性材料制備進(jìn)行了系統(tǒng)的工作。所在單位設(shè)備齊全，測試手段完整，已有設(shè)備包括掃描電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、原子力顯微鏡、X射線光電子能譜分析、冷凍干燥設(shè)備、真空干燥設(shè)備、恒壓穩(wěn)壓電、百級細(xì)胞培養(yǎng)凈化室，細(xì)胞及分子生物學(xué)研究工作所需的設(shè)備和儀器，如：細(xì)胞活力儀、流式細(xì)胞儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、低溫離心機(jī)、激光共聚焦顯微鏡、Micro-CT儀等較為齊全的研究手段和設(shè)備。具備以上條件將給本項(xiàng)目的實(shí)施及計(jì)劃落實(shí)提供可靠保證。另外，本研究所需的試劑和原料（包括國外公司產(chǎn)品）均可在國內(nèi)購得，實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞株、標(biāo)準(zhǔn)菌株本課題組實(shí)驗(yàn)室均具備。 綜上，本項(xiàng)目所開展的工作在理論上、研究的內(nèi)容和技術(shù)手段、研究人員的前期工作基礎(chǔ)、目前的實(shí)驗(yàn)室條件評價(jià)可行，并有望達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。 發(fā)表的相關(guān)論文： 1.Preparation?and?Characterization?of?Lanthanum-Incorporated?Hydroxyapatite?Coatings?on?Titanium?Substrates.International?Jouranl?of?Molecular?Sciences.2015.16.21070-21086 2.In vivo evaluation of in situ polysaccharide based hydrogel for prevention of postoperative adhesion. Carbohydrate Polymers,2012,90(2):1024-1031. 3.Sol-Gel-Derived Hydroxyapatite-Carbon Nanotube/Titania Coatings on Titanium Substrates. International Journal of Molecular Sciences，2012,13(4):5242-5253. 4. Effects of Shaking Frequency on Growth and Adhesion Behaviour of Streptococcus Mutans,2013,749:p206-210 5. Hierarchical structure and mechanical properties of remineralized dentin. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2014, 40, 297-306. 6. Biomimetic promotion of dentin remineralization using L-glutamic acid: inspiration from biomineralization proteins, JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B,2014, 2: (28): 4544-4553 7. Prosthodontic Rehabilitation of Malpositioned Implants After Ameloblastoma Followed by Mandibulectomy and Costal Bone Graft: A Clinical Report, Implant Dentistry,2013,22 (1):16-19 8. Bio-inspired enamel repair via Glu-directed assembly of apatite nanoparticles: an approach to biomaterials with optimal characteristics. Adv Mater 2011, 23 (40), 4695-4701. 9. Does endodontic post space irrigation affect smear layer removal and bonding effectiveness EUROPEAN JOURNAL OF ORAL SCIENCES, 2009,117 (5), 597-603 10. Effect of Different Irrigation on Smear Layer Removal after Post Space Preparation, JOURNAL OF ENDODONTICS, 2009 35 (4),583-586 11. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks,JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY, 2011, 18 (34), 4079-4084 12. Glutaraldehyde-induced remineralization improves the mechanical properties and biostability of dentin collagen.Materials Science and Engineering C，67 (2016) 657–665 (2) 課題組前期相關(guān)的研究成果 本課題組前期利用陽級氧化法成功地在Ti表面制備了TiO2納米管陣列，通過控制反應(yīng)條件可控制形成的TiO2直徑在20-300nm之間，為裝載聚合物膠束奠定了基礎(chǔ)。 圖一 不同電壓下制備TiO2納米管陣列表面形貌SEM圖（10.0kv ×30,000）(a)80V (b)60V (c)40V (d)30V 圖二 經(jīng)450℃退火處理的TiO2納米管陣列EDS圖譜 上圖是iO2納米管陣列的EDS圖譜，只檢測到Ti、O元素，且峰值明顯。元素定量分析結(jié)果表明，樣品中含有Ti、O所占的原子百分比分別為33.79、66.21≈1：2，表明樣品以TiO2形式存在為主。 圖三 載阿莫西林TiO2納米管陣列XRD圖譜 圖四 阿莫西林體外釋放曲線 8、經(jīng)費(fèi)預(yù)算與說明 開支科目 專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（萬元） 配套經(jīng)費(fèi)（萬元） 預(yù)算說明 設(shè)備費(fèi) 0.00 0.00 無 材料費(fèi) 1.0 1.15 購買鈦片、試劑、細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料 試驗(yàn)化驗(yàn)加工費(fèi) 1.0 1.0 場發(fā)射掃描電鏡（SEM）、透射電鏡(TEM)，并利用X射線能量色散譜( EDS) 、接觸角測量儀測量接觸角、原子力顯微鏡(AFM)、X射線電子能譜儀(XPS) 燃料動力費(fèi) 0.00 0.00 無 管理費(fèi) 0.15 0.00 按相關(guān)規(guī)定提取 會議費(fèi) 0.00 0.00 無 差旅費(fèi) 0.35 0.35 參加學(xué)術(shù)交流以及到其他科研機(jī)構(gòu)科學(xué)咨詢的差旅費(fèi) 出版/文獻(xiàn)/信息傳播/知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)費(fèi) 0.3 0.3 文章出版費(fèi)及文獻(xiàn)檢索費(fèi)用 合作、協(xié)作研究與交流費(fèi) 0.2 0.2 參加口腔生物材料會 專家咨詢費(fèi) 0.00 0.00 無 人員勞務(wù)費(fèi) 0.00 0.00 無 外撥費(fèi)用 0.00 0.00 無 其他開支 0.00 0.00 無 -可編輯修改-